专利名称：原绿球藻的显微定量方法
技术领域：
本发明涉及一种海洋浮游植物的定量方法，尤其是涉及一种采用基于时间序列观察、自动成像和数字化分析的落式荧光显微镜法对海洋浮游植物原绿球藻(Prochlorococcus)的定量方法。
背景技术：
原绿球藻是新近发现的迄今为止海洋中丰度最高的原核自养光合生物，具有重大的生态学、进化以及资源环境意义。然而，原绿球藻细胞极小、荧光很弱，且在正常的落式荧光显微镜(EM)设置下(如激发光为450-480nm)焠灭得很快，几乎观察不到，更无法准确定量(Sieracki et al.，1995；Partensky et al.，1999；Schwalbach and Fuhrman，2005)。另外，聚球藻和原绿球藻是蓝细菌在海洋环境中常见的属(Partensky et al.，1999)，在蓝细菌的EM设置下，原绿球藻由于其所发出的信号被海水样中共存的具强荧光的较大的细胞，如聚球藻(Synechococcus)所掩盖，故在最初的蓝细菌视野下无法被观察到。另一方面，如果细胞用DNA染料(如DAPI，SYBR Green I)染色，海水样中包括异养细菌、原绿球藻等所有微生物都将被混在一起。所以，EM不被推荐用于原绿球藻的计数。而到现在为止流式细胞仪是原绿球藻计数的有效工具(Sieracki et al.，1995；Jiao et al.，2001)，但流式细胞仪是一价格昂贵的仪器，它只在一些专用的实验室提供。所以，本发明将解决上述难题，使一般具有显微镜的实验室都能够具有原绿球藻分析定量的能力。
发明内容
本发明的目的在于为了克服原绿球藻在普通EM设置下焠灭快、荧光被聚球藻遮蔽而无法在最初的蓝细菌视野下观察到以及采用流式细胞仪进行原绿球藻计数所需的昂贵费用等不足，提供一种新的原绿球藻计数方法，该法使得原绿球藻在有EM的普通实验室就可进行，操作简便。
本发明的步骤为1)将所采样品在暗中预过滤、固定、双链DNA荧光染料(4’6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色、过滤并制片；2)用配有红敏的电子耦合组件(CCD)照相机(SPOT Diagnostic Instruments，Inc.)和汞灯(Carl Zeiss Light MicroscopyAXIOSKOP 4)的落式荧光显微镜进行观察，以2组不同的荧光激发块分别对同一视野的蓝细菌(Cyano)和双链DNA荧光染料图像进行观察和拍照。显微聚焦后，进行蓝细菌和双链DNA荧光染料图像时间序列上的获取图像；3)对图像中的细胞进行识别和分析，并获得新的二元数字化图像；4)计算假设一个视野下，分别获得双链DNA荧光染料图像a、最初的蓝细菌图像b(聚焦后获得的第一张蓝细菌图像，是以聚球藻为主的具强荧光的较大的藻类细胞)和平台期的蓝细菌图像c，并分别获得相应的二元数字化图像d、e和f，那么原绿球藻的丰度＝Boolean AND[(d)，(f)]-Boolean AND[(d)，(e)](其中“Boolean AND”指“逻辑运算与”)。
在步骤1)中，所说的样品预过滤的方法是将样品用孔径为20μm的筛绢预过滤，以除去大的有机生物体和无机物颗粒；所说的固定方法是将预过滤后的样品用终浓度为2％的多聚甲醛在暗中固定15分钟；所说的双链DNA荧光染料的染色方法是用终浓度为5μg/ml的DAPI在室温下暗中染色30分钟；所说的过滤并制片方法是将染色后的样品用真空泵和滤器以小于0.03MPa的压力抽滤到25mm直径、0.2μm孔径的黑色聚碳酸酯膜上，然后剪取1/4膜样(过滤有样品的聚碳酸酯膜)，在载玻片和盖玻片上各滴一滴镜油，将1/4膜样(细胞面朝上)放在载玻片上，后盖上盖玻片压平；在步骤2)中，用配有红敏的电子耦合组件照相机和50W汞灯的落式荧光显微镜进行观察，以2组不同的荧光激发块分别对同一视野的蓝细菌和双链DNA荧光染料图像进行观察和拍照，所有的图像均通过自动曝光获得。显微聚焦后，进行蓝细菌和双链DNA荧光染料图像时间序列上的获取，每隔60秒获取一张图像，持续10-15分钟。
在步骤3)中，图像中的细胞用Image-Pro Plus(IPP)软件(Media Cybernetics，Inc.)进行识别和分析，并获得新的二元数字化图像。
在步骤4)中，计算假设一个视野下，分别获得DAPI图像a、最初的蓝细菌图像b(聚焦后获得的第一张蓝细菌图像，是以聚球藻为主的具强荧光的较大的藻类细胞)和平台期的蓝细菌图像c(时间序列观察中获得的蓝细菌数目最大的图像，主要包括聚球藻和原绿球藻，其它藻细胞的丰度小不足以构成误差)，并分别获得相应的二元数字化图像d、e和f，那么原绿球藻的丰度＝Boolean AND[(d)，(f)]-Boolean AND[(d)，(e)](其中“Boolean AND”指“逻辑运算与”)。
与已有技术相比，本发明的优势在于技术的普及性(落式荧光显微镜在一般实验室均有提供)；采用时间序列观察法可以对原绿球藻进行计数；且方法简便，易操作。
具体实施例方式
1.将所采样品先以20μm的筛绢预过滤以除去大的有机生物体和无机物颗粒，后用终浓度为2％的多聚甲醛(PFA)固定15分钟，再以终浓度为5μg/ml的DAPI染色30分钟，之后细胞被过滤到0.2μm孔径的黑色聚碳酸酯(PC)膜(Whatman)上，剪取1/4膜样，细胞面朝上制片。
2.用EM对制片进行观察，所用的荧光激发块如下所示。染DAPI的细胞用于对照，其所用的荧光激发块是330-390nm激发，440-490nm发射，400-430nm分光(Zeiss Filter set02)(Kolber et al.，2001；Zhang and Jiao，2004)(DAPI-settings)。蓝细菌(主要包括聚球藻和原绿球藻)细胞所用的荧光激发块是BP 546±12nm激发，LP 590nm发射(Li and Wood，1988；Sherry and Wood，2001)，FT 580nm分光(Zeiss Filter set 15)(Cyano-settings)。每个显微镜视野用×100的油镜观察，对同一个视野同时获得DAPI图像和蓝细菌图像。所有的图像均通过自动曝光获得，其“gain limit”(增益限制，自动成像软件中的一个设置参数)是8。时间序列的DAPI和Cyano图像在初始约30秒的聚焦步骤后，连续被捕获10-15分钟，时间间隔是60秒。
3.图像中的细胞用Image-Pro Plus(IPP)软件(Media Cybernetics，Inc.)进行识别和分析。首先通过测定平均背景灰度值并以此重新生成灰度图像，使原始图像标准化。图像中的细胞边界以IPP的“Variance filter”(差异过滤，IPP软件中的一个设置参数)来测定并强化，“Variance filter”会以灰度值计算的标准偏差来替换周围3×3相邻像素点灰度值。生成的图像以“3×3 neighborhood median filter”(3×3相邻中值过滤，IPP软件中的一个设置参数)进行弱化。最后软件以一固定设置的灰度值自动识别细胞，从而获得二元图像。将CCD图像中的点进行二元数字化以产生一个新的图像，可以获得更可信的数据。在这个二元图像中背景灰度值为“0”，而每个被识别的点不管大小都为“1”。最后，不同图像之间的细胞定位可以通过逻辑运算“与”来进行。
4.计算假设一个视野下，分别获得DAPI图像a、最初的蓝细菌图像b(聚焦后获得的第一张蓝细菌图像，是以聚球藻为主的具强荧光的较大的藻类细胞)和平台期的蓝细菌图像c(时间序列观察中获得的蓝细菌数目最大的图像，主要包括聚球藻和原绿球藻，其它藻细胞的丰度小不足以构成误差)，并分别获得相应的二元数字化分析结果图像d、e和f，那么原绿球藻的丰度＝Boolean AND[(d)，(f)]-Boolean AND[(d)，(e)]。
权利要求
1.原绿球藻的显微定量方法，其特征在于其步骤为1)将所采样品预过滤、固定、双链DNA荧光染料染色、过滤并制片；2)用配有红敏的电子耦合组件照相机和汞灯的落式荧光显微镜进行观察，以2组不同的荧光激发块分别对同一视野的蓝细菌和双链DNA荧光染料图像进行观察和拍照，显微聚焦后，进行蓝细菌和双链DNA荧光染料图像时间序列上的获取图像；3)对图像中的细胞进行识别和分析，并获得新的二元数字化图像；4)计算假设一个视野下，分别获得双链DNA荧光染料图像a、最初的蓝细菌图像b和平台期的蓝细菌图像c，并分别获得相应的二元数字化图像d、e和f，那么原绿球藻的丰度＝Boolean AND[(d)，(f)]-Boolean AND[(d)，(e)]，其中“Boolean AND”指“逻辑运算与”，所说的聚焦后获得的第一张蓝细菌图像是以聚球藻为主的具强荧光的较大的藻类细胞。
2.如权利要求1所述的原绿球藻的显微定量方法，其特征在于在步骤1)中，所说的样品预过滤的方法是将样品用孔径为20μm的筛绢预过滤，以除去大的有机生物体和无机物颗粒。
3.如权利要求1所述的原绿球藻的显微定量方法，其特征在于在步骤1)中，所说的固定方法是将预过滤后的样品用终浓度为2％的多聚甲醛在暗中固定15分钟。
4.如权利要求1所述的原绿球藻的显微定量方法，其特征在于在步骤1)中，所说的双链DNA荧光染料的染色方法是用终浓度为5μg/ml的DAPI在室温下暗中染色30分钟。
5.如权利要求1所述的原绿球藻的显微定量方法，其特征在于所说的过滤并制片方法是将染色后的样品用真空泵和滤器以小于0.03MPa的压力抽滤到25mm直径、0.2μm孔径的黑色聚碳酸酯膜上，然后剪取1/4膜样，在载玻片和盖玻片上各滴一滴镜油，将1/4膜样放在载玻片上，后盖上盖玻片压平。
6.如权利要求5所述的原绿球藻的显微定量方法，其特征在于所说的膜样为过滤有样品的聚碳酸酯膜。
7.如权利要求5所述的原绿球藻的显微定量方法，其特征在于所说的膜样细胞面朝上放在载玻片上，后盖上盖玻片压平。
8.如权利要求1所述的原绿球藻的显微定量方法，其特征在于在步骤2)中，用配有红敏的电子耦合组件照相机和50W汞灯的落式荧光显微镜进行观察，以2组不同的荧光激发块分别对同一视野的蓝细菌和双链DNA荧光染料图像进行观察和拍照，所有的图像均通过自动曝光获得，显微聚焦后，进行蓝细菌和双链DNA荧光染料图像时间序列上的获取，每隔60秒获取一张图像，持续10-15分钟。
9.如权利要求1所述的原绿球藻的显微定量方法，其特征在于在步骤3)中，图像中的细胞用Image-Pro Plus软件进行识别和分析，并获得新的二元数字化图像。
全文摘要
原绿球藻的显微定量方法，涉及一种海洋浮游植物的定量方法，尤其是涉及一种采用基于时间序列观察、自动成像和数字化分析的落式荧光显微镜法对海洋浮游植物原绿球藻的定量方法。提供一种原绿球藻计数方法，其步骤为样品预过滤、固定、双链DNA荧光染料染色、过滤并制片用配有红敏的电子耦合组件照相机和汞灯的落式荧光显微镜进行观察，以2组不同的荧光激发块对同一视野蓝细菌和染料图像观察和拍照，显微聚焦后进行蓝细菌和双链DNA荧光染料图像时间序列上的获取图像；对图像中的细胞识别和分析，得新的二元数字化图像；计算由双链DNA荧光染料图像、最初的蓝细菌图像、平台期的蓝细菌图像和二元数字化图像得原绿球藻的丰度。
文档编号C12Q1/04GK1710095SQ200510078720
公开日2005年12月21日 申请日期2005年6月3日 优先权日2005年6月3日
发明者焦念志, 张瑶, 陈瑶 申请人:厦门大学