本发明涉及生物检测
技术领域：
，尤其涉及一种高尔基体蛋白GP73定量测定试剂盒及其检测方法。
背景技术：
：肝癌(HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一，其早期症状不明显，一经发现，往往已属中晚期而失去了最佳治疗时机，“早诊、早治”是防治肝癌的关键。目前临床上对肝癌的诊断主要是影像学和血清标志物甲胎蛋白(AFP)检查，这两种方法都不能实现肝癌早期诊断，因此有必要研发应用于临床的肝癌早期诊断试剂。血清学检测操作简单、价格低廉、适合大规模筛查，越来越受到各国学者的重视。目前，高尔基体蛋白73(GP73)被认为是最好的肝癌早期诊断血清学标志物之一，其检测敏感性大于AFP，对AFP阴性患者有较好的预警能力。据文献报道，GP73检测肝癌的灵敏度为69％,特异性为75％。对于早期肝癌的诊断,GP73的敏感性为62％,而AFP敏感性仅为25％。AFP水平低于20μg/L的肝癌患者中,有57％的人群GP73水平显著升高。这表明，GP73的应用能够大大提高对AFP阴性的肝癌患者的检出率。国内仅1家公司应用酶联免疫法(ELISA)开发了临床GP73定量测定试剂盒。国外同类产品(ELISA方法)也只应用于科研，未见应用于临床的GP73检测诊断试剂盒。目前已知的高尔基体糖蛋白GP73检测方法还存在较多缺陷，如操作较为繁琐，耗时较长，不适宜临床上使用。目前，我国市场上的高尔基体糖蛋白GP73检测试剂盒存在准确度低、灵敏度低、重复性较差等缺点。针对这些问题，我公司与北京肝病研究所合作，从源头开始，自主研发抗原、抗体等原材料，制备的单抗、多抗效价均大于106，建立了质量稳定、定量灵敏的高尔基体蛋白73(GP73)测定试剂盒(酶联免疫法)，极大的降低了生产成本。技术实现要素：鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种快速测定血清中高尔基体糖蛋白GP73含量的试剂盒，用于解决现有技术中的问题。本发明的技术方案为：一种高尔基体蛋白GP73定量测定试剂盒，其特征在于：包括GP73抗体包被板、GP73标准品、浓缩酶结合物、浓缩酶结合物稀释液、浓缩洗涤液、显色剂A液、显色剂B液、 终止液、封板膜。一种高尔基体蛋白GP73定量测定检测方法，其特征在于：所述检测方法包括实验准备过程和检测步骤，所述实验准备过程如下：(1)将试剂盒和待测血清样品放置室温，平衡至少30分钟；(2)稀释浓缩洗涤液：在合适的洁净容器内用新鲜的蒸馏水或去离子水将浓缩洗涤液稀释20倍，混匀备用；在使用前若浓缩洗涤液有结晶析出，将浓缩洗涤液放置于水浴锅中加热，使其完全溶解；(3)在GP73抗体包被板上对样品编号；(4)配制酶工作液：吸取120μl浓缩酶结合物，加入至浓缩酶结合物稀释液瓶中，轻轻上下混匀备用；若一次未使用完应-20℃储存，该酶工作液最多可冻融3次；一种高尔基体蛋白GP73定量测定检测方法的检测步骤如下：(1)加样：分别在GP73抗体包被板相应孔中加入50μL标准品或血清样品，轻轻振荡；(2)温浴：用封板膜将GP73抗体包被板封板后置37℃温浴30分钟；(3)洗涤：揭掉封板膜，甩干孔内液体，用洗涤液充分洗涤5遍，每次每孔应加入至少300μL洗涤液，最后在干净的吸水纸上拍干；(4)加酶结合物：每孔加入100μL实验准备过程步骤(4)得到的酶工作液，轻轻振荡；(5)温浴：用另一张封板膜将GP73抗体包被板封板后置37℃温浴30分钟；(6)洗涤：揭掉封板膜，甩干孔内液体，用洗涤液充分洗涤5遍，每次每孔应加入至少300μL洗涤液，最后在干净的吸水纸上拍干；(7)显色：每孔加入50μL显色剂A，再加入50μL显色剂B，轻轻振荡混匀，37℃避光温浴10分钟；(8)测定：每孔加入50μL终止液，轻轻振荡混匀，使用酶标仪选择双波长进行测量各孔吸光度值，主波长450nm，参考波长630nm，用空白孔调零点；(9)数据处理：选择数据处理软件，以检测步骤(8)得到的各标准品的吸光度的Log值为横坐标，各标准品浓度的Log值为纵坐标，按“吸光度值的对数-浓度对数”数学模型进行线性拟合，建立标准曲线，以各待测血清吸光度值在标准曲线上查出该血清的GP73的浓度，其中横坐标为发光强度，横坐标为GP73浓度。本发明的有益效果在于：本试剂盒采用双抗体夹心法对GP73进行定量检测，可作为辅助临床早期诊断肝癌的一种标志物。检测灵敏度高，样品用量少，操作简单，反应时间短方便客户使用。产品有效期为9个月，稳定性好。对于256例未治疗的肝癌标本，GP73的ROC曲线下面积为0.913，灵敏度82.4％，特异性92.2％。远远高于AFP，其敏感性和特异度分别为39％-64％和76％-91％。具体实施方式本发明一种高尔基体蛋白GP73定量测定试剂盒，其特征在于：包括GP73抗体包被板、GP73标准品、浓缩酶结合物、浓缩酶结合物稀释液、浓缩洗涤液、显色剂A液、显色剂B液、终止液、封板膜。一种高尔基体蛋白GP73定量测定检测方法，其特征在于：所述检测方法包括实验准备过程和检测步骤，所述实验准备过程如下：(1)将试剂盒和待测血清样品放置室温，平衡至少30分钟；(2)稀释浓缩洗涤液：在合适的洁净容器内用新鲜的蒸馏水或去离子水将浓缩洗涤液稀释20倍，混匀备用；在使用前若浓缩洗涤液有结晶析出，将浓缩洗涤液放置于水浴锅中加热，使其完全溶解；(3)在GP73抗体包被板上对样品编号；(5)配制酶工作液：吸取120μl浓缩酶结合物，加入至浓缩酶结合物稀释液瓶中，轻轻上下混匀备用；若一次未使用完应-20℃储存，该酶工作液最多可冻融3次；一种高尔基体蛋白GP73定量测定检测方法的检测步骤如下：(1)加样：分别在GP73抗体包被板相应孔中加入50μL标准品或血清样品，轻轻振荡；(2)温浴：用封板膜将GP73抗体包被板封板后置37℃温浴30分钟；(3)洗涤：揭掉封板膜，甩干孔内液体，用洗涤液充分洗涤5遍，每次每孔应加入至少300μL洗涤液，最后在干净的吸水纸上拍干；(4)加酶结合物：每孔加入100μL实验准备过程步骤(4)得到的酶工作液，轻轻振荡；(5)温浴：用另一张封板膜将GP73抗体包被板封板后置37℃温浴30分钟；(6)洗涤：揭掉封板膜，甩干孔内液体，用洗涤液充分洗涤5遍，每次每孔应加入至少300μL洗涤液，最后在干净的吸水纸上拍干；(7)显色：每孔加入50μL显色剂A，再加入50μL显色剂B，轻轻振荡混匀，37℃避光温浴10分钟；(8)测定：每孔加入50μL终止液，轻轻振荡混匀，使用酶标仪选择双波长进行测量各孔吸光度值，主波长450nm，参考波长630nm，用空白孔调零点；(9)数据处理：选择数据处理软件，以检测步骤(8)得到的各标准品的吸光度的Log值为横坐标，各标准品浓度的Log值为纵坐标，按“吸光度值的对数-浓度对数”数学模型进行线性拟合，建立标准曲线，以各待测血清吸光度值在标准曲线上查出该血清的GP73的浓度，其中横坐标为发光强度，横坐标为GP73浓度。性能指标：(1)测定范围：采用零标准添加高浓度的GP73测定本试剂盒的测定范围为3-150ng/ml；(2)标准曲线相关系数r：≥0.99；(3)灵敏度：取试剂盒中校准试剂做20个平行孔，求其平均值及偏差SD，从浓度-反应曲线上查出相对应的浓度值，确定为本试剂盒的灵敏度(最小检出值)为3ng/ml；(4)精密度：批内变异系数≤15.0％，批间变异系数≤15.0％本产品与北京热景生物技术有限公司生产的同种产品相比，具有以后优势：对比项目本产品对比产品分析灵敏度3ng/ml≦25ng/ml未治疗肝癌组特异性69.1％68％健康人特异性99.0％98.89％反应时间30min/30min/10min60min/30min/15min操作50μL样本反应30min加50μL稀溶液，再加50μL样本临床研究结果：1、在821例健康体检标本中，特异性为99.0％(813/821)。2、对于256例未治疗的肝癌标本，GP73的ROC曲线下面积为0.913，灵敏度82.4％， 特异性92.2％，阳性率69.1％(177/256)。3、4921例标本定量检测结果(大于11ng/ml为阳性)：4、初诊为非肝癌，GP73检测结果阳性，随后确诊为肝癌的病例标本统计：以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。当前第1页1 2 3