烷基化保护，然后进行全同重化学共价标记即可，不需要对蛋白质序列中赖氨酸残基上的ε -氨基进行胍化保护，方法简单快捷，同时标记效率高、副反应少、准确度高。
【附图说明】
[0020]图1为基于蛋白质赖氨酸ε -氨基及N端氨基同重二甲基标记的定量流程图。
[0021]图2为蛋白质分子赖氨酸氨基和N端氨基全同重二甲基标记示意图。
【具体实施方式】
[0022]下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0023]实施例
[0024]—种整体蛋白质定量分析方法，采用如图1所示的整体流程，包括以下步骤:
[0025](I)两种不同生理或病理条件的整体蛋白(以控制组与疾病组为例)先统一用二硫苏糖醇对可能存在的二硫键进行还原；然后用碘乙酰胺对所有巯基进行烷基化保护；
[0026](2)烷基化后的两组蛋白质分别用甲醛和氘代氰基硼氢化钠、13C标记甲醛和氰基硼氢化钠对蛋白分子中的赖氨酸氨基及N端氨基进行全部同重标记(如图2所示)；也就是分别标记为-N(CH2D)JP -N (13CH3) 2，其单个标记后氨基的质量差异为0.00584Da。反应过程和条件如下:烧基化后的蛋白重新溶解在乙酸钠缓冲溶液(100mM，pH 5-6)后，加入刚刚配制的4%甲醛溶液；在搅拌条件下加入600mM的新配制的氰基硼氢化钠溶液。室温反应I小时后，反应用4%的氨水淬灭；
[0027](3)同重标记后两组蛋白按等比例混合(按照控制组与疾病组的重量、体积或摩尔量以1:1比例进行混合)进行高分辨质谱和串级质谱分析得到一个数据组；
[0028](4)ProteinGoggle对数据组进行定性、定量数据库搜索，得到蛋白质的ID及疾病组每一个蛋白质相对于控制组的相对比例，即疾病条件下所有蛋白的上调或下调情况。上调或下调倍数最大的蛋白即与该疾病发生、发展相关的蛋白。
[0029]上述解析方法基于所述质谱的原始二级质谱，通过计算含标记基团碎片离子的平均相对强度从而计算标记蛋白在不同生理或病理条件下的相对强度。该定量方法对整体蛋白质序列中赖氨酸ε-氨基及N端氨基的同重标记和其高分辨串级质谱标记碎片离子同位素轮廓指纹比对原位数据解析，标记效率高，准确度高，适用于整体蛋白质基于高分辨串级质谱的定量分析。
[0030]上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种整体蛋白质定量分析方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将两组不同生理或病理条件的整体蛋白质分别作为控制组与疾病组，并分别对可能存在的一■硫键进彳丁还原，同时对疏基进彳丁烧基化保护； (2)对两组烷基化的蛋白质的氨基酸特定官能团进行全同重化学共价标记； (3)同重标记后两组蛋白质按等比例混合进行高分辨质谱和串级质谱分析得到一个数据组； (4)对数据组进行定性、定量数据库搜索，得到蛋白质的ID及疾病组每一个蛋白质相对于控制组的相对比例，即疾病条件下所有蛋白的上调或下调情况，上调或下调倍数最大的蛋白即为与该疾病发生、发展相关的蛋白。2.根据权利要求1所述的一种整体蛋白质定量分析方法，其特征在于，步骤(I)中用二硫苏糖醇对可能存在的二硫键进行还原，用碘乙酰胺对所有巯基进行烷基化保护。3.根据权利要求1所述的一种整体蛋白质定量分析方法，其特征在于，步骤(2)中氨基酸特定官能团包括赖氨酸ε-氨基及N端氨基。4.根据权利要求1所述的一种整体蛋白质定量分析方法，其特征在于，步骤(2)中，一组蛋白质中的氨基酸特定官能团标记为-N (CH2D) 2，另一组蛋白质中的氨基酸特定官能团标记为-N(13CH3)2，单个标记后氨基的质量差异为0.00584Da。5.根据权利要求4所述的一种整体蛋白质定量分析方法，其特征在于，一组蛋白质用甲醛和氘代氰基硼氢化钠标记，另一组蛋白质用13C标记甲醛和氰基硼氢化钠标记； 反应过程和条件如下:烷基化的蛋白质重新溶解在乙酸钠缓冲溶液后，加入4% (v/v)甲醛溶液；在搅拌条件下加入600mM的新配制的氰基硼氢化钠溶液，室温反应I小时后，用4% (v/v)的氨水淬灭。6.根据权利要求5所述的一种整体蛋白质定量分析方法，其特征在于，所述的乙酸钠缓冲溶液为10mmo I/L，pH为5-6。7.根据权利要求1所述的一种整体蛋白质定量分析方法，其特征在于，步骤(3)所述的等比例混合指:按照控制组与疾病组的重量、体积或摩尔量以1:1比例进行混合。
【专利摘要】本发明涉及一种整体蛋白质定量分析方法，首先将两组不同生理或病理条件的整体蛋白质分别作为控制组与疾病组，并分别对可能存在的二硫键进行还原，同时对巯基进行烷基化保护；然后对两组烷基化的蛋白质的氨基酸特定官能团进行全同重化学共价标记；同重标记后两组蛋白质按等比例混合进行高分辨质谱和串级质谱分析得到一个数据组；最后对数据组进行定性、定量数据库搜索，得到蛋白质的ID及疾病组每一个蛋白质相对于控制组的相对比例，即疾病条件下所有蛋白的上调或下调情况，上调或下调倍数最大的蛋白即为与该疾病发生、发展相关的蛋白。与现有技术相比，本发明方法标记效率高，准确度高，适用于整体蛋白质基于高分辨串级质谱的定量分析。
【IPC分类】G01N33/68
【公开号】CN105137088
【申请号】CN201510534271
【发明人】肖开捷, 方后琴, 沈赟, 田志新
【申请人】同济大学
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年8月27日