专利名称：转基因玉米安全性评价方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及转基因玉米安全性评价方法。
背景技术：
转基因食品在人体内是否具有基因损害效应，是人们对其安全性产生怀疑的主要 原因。经遗传工程修饰的基因片段导入后，引发下游基因转录效应，可能致使其最终产物 含有新的成分或改变现有成分的含量；调控基因(启动子，终止子)转移效应的潜在风险， 如转基因大豆35S启动子可能会通过基因的水平转移插入到某一致癌基因上游，活化并导 致癌症的发生。当转入多个基因片段进入生物体时，发生非预期效应的概率可能会比较高。 以目前的技术研究尚不能完全掌握这些非预期的未知有害因素，转基因食品与现存食品仅 仅在化学上的相似性并不足以证明它对人类消费是安全的，而应更深入地对其进行细胞毒 性、遗传毒性等相关方面的实验，以提供更有说服力的数据和结论。有关转基因食品是否对 人体健康造成危害的争议日趋激烈，引起世界公众的关注。随着我国生物技术不断发展和 我国对转基因食品的进口量不断增加，对其进行安全性评价和科学的安全管理是十分必要 的。目前国内外对转基因玉米所做安全性评价研究较少，主要集中在传统毒理学方法 (动物试验)方面，采用代谢物分析、毒代动力学、慢性毒性、亚慢性毒性、繁殖试验和致畸 试验等方法，在安全性评价的过程中，主要应用全食喂养，观察对动物靶器官造成影响。但 整个过程耗时长、费用高，由于玉米市场价格波动频繁，过长的检查时间显然不具有实用价 值，而且结果的准确性容易受诸多因素的影响，比如单一喂食导致营养不良、食物中其他 未知内含物、动物实验结果外推到人存在种群间差异等。而传统毒理学方法检测层面仍停 留在组织、器官病理性改变层面，并未涉及细胞及基因层面。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种简单易行、花费低、周期短、评价更为客观 的转基因玉米安全性评价方法。为此本发明采用以下技术方案它包括如下步骤(1)、提供人淋巴细胞、待测转基因玉米的全蛋白、非转基因玉米全蛋白、阳性诱变 剂；(2)、对人淋巴细胞分成各组进行孵育对人淋巴细胞与待测转基因玉米全蛋白共同孵育，对人淋巴细胞与非转基因玉米全蛋白共同孵育，对人淋巴细胞与所述阳性诱变剂共同孵育，对人淋巴细胞与空白剂共同孵育；(3)、分别检测与待测转基因玉米全蛋白共同孵育的人淋巴细胞、与非转基因玉米 全蛋白共同孵育的人淋巴细胞、与所述阳性诱变剂共同孵育的人淋巴细胞、与空白剂共同 孵育的人淋巴细胞的细胞损伤程度及遗传损伤程度，根据人淋巴细胞的细胞损伤程度及遗
4传损伤程度判别所述待测转基因玉米的安全性。在采用上述技术方案的基础上，本发明还可同时采用或组合采用以下进一步的技 术方案检测人淋巴细胞的细胞损伤程度的方法为CCK-8试验和中性红试验，检测人淋巴 细胞的遗传损伤程度的方法为彗星试验和微核试验。所述阳性诱变剂选取阿霉素、长春新碱两种；阿霉素用于模拟多通道DNA损伤，诱 使细胞出现多种类型DNA损伤；长春新碱用于模拟染色体损伤，诱使细胞出现染色体畸变、 姐妹染色单体交换损伤。在步骤(2)对人淋巴细胞与所述阳性诱变剂共同孵育中，对人淋巴细胞分成以下 2组进行孵育对人淋巴细胞与与阿霉素共同孵育和对人淋巴细胞与与长春新碱共同孵育；在步骤(3)中，与长春新碱共同孵育的人淋巴细胞用于CCK-8试验、中性红摄取试 验和微核试验的阳性对照，与阿霉素共同孵育的人淋巴细胞作为彗星试验的阳性对照。待测转基因玉米全蛋白的孵育终浓度为200、100、50、25、12. 5μ g/ml，并各分别孵 育1. 5h、6h、24h ；非转基因玉米全蛋白的孵育终浓度为200、100、50、25、12· 5μ g/ml，并各 分别 1. 5h、6h、24h。在步骤(3)中，采用以下方法判定如与所述阳性诱变剂共同孵育的人淋巴细胞和与空白剂共同孵育的人淋巴细胞 的细胞损伤程度及遗传损伤程度无显著差异，说明所选取试验方法不能有效检测阳性诱 变剂引起的细胞毒性及遗传毒性损伤，则不进行与待测转基因玉米全蛋白共同孵育的人淋 巴细胞和与非转基因玉米全蛋白共同孵育的人淋巴细胞细胞损伤程度及遗传损伤程度对 比；如与所述阳性诱变剂共同孵育的人淋巴细胞和与空白剂共同孵育的人淋巴细胞 的细胞损伤程度有显著差异，再比较与待测转基因玉米全蛋白共同孵育的人淋巴细胞和与 非转基因玉米全蛋白共同孵育的人淋巴细胞细胞损伤程度，如无显著差异，则判定待测转 基因玉米与非转基因玉米的细胞毒性相似，可安全食用；如细胞损伤程度存在显著差异，则 认为待测转基因玉米较非转基因玉米更具有细胞毒性，食用存在不安全性；如与所述阳性诱变剂共同孵育的人淋巴细胞和与空白剂共同孵育的人淋巴细胞 的遗传损伤程度有显著差异，再比较与待测转基因玉米全蛋白共同孵育的人淋巴细胞和与 非转基因玉米全蛋白共同孵育的人淋巴细胞遗传损伤程度，如无显著差异，则判定待测转 基因玉米与非转基因玉米的遗传毒性相似，可安全食用；如遗传损伤程度存在显著差异，则 认为待测转基因玉米较非转基因玉米更具有遗传毒性，食用存在不安全性。显著性检验的目的是确定样本间的差异由于抽样误差所致的概率(P)大小，在统 计专业研究中，0. 05的P值通常被认为是可接受阈值水平。如果这一概率较大(P > 0. 05)， 通常认为不能排除样本间的差异是由于抽样误差所致，即这两个样本均数(率或构成比) 是由两个相同的总体中抽到(实际上是来自同一总体)，统计学称之为差异无显著性；这一 概率若很小(P < 0. 05，即小概率事件)，则认为两个样本均数(率或构成比)是从两个本 质不同的总体中抽到，它们之间的差异属于本质不同的差异，不是抽样误差所致，而是由于 其他因素所致，统计学称之为差异有显著性；本发明将P < 0. 05作为参与对比的两组数据存在显著性差异的阈值。当然，根据判定显著差异的尺度不同，也可对所述阈值进行上下调
本发明中所述数据对比是指在同种试验，同等实验条件下在对比对象之间进行对 比，如彗星试验中，对多个与空白剂共同孵育1.5h后的人淋巴细胞样本所测得的多个尾 部DNA百分比数据与对多个与阿霉素共同孵育1. 5h后的人淋巴细胞样本所测得的多个尾 部DNA百分比数据相比较，利用前段所述方法，判断与所述阳性诱变剂共同孵育的人淋巴 细胞和与空白剂共同孵育的人淋巴细胞的遗传损伤程度是否有显著差异。在本发明中所述空白剂可以选择磷酸盐缓冲液(PBS)或者生理盐水。由于采用本发明的技术方案，本发明通过人淋巴细胞系传代培养，将转基因玉米 全蛋白提取物作用于人淋巴细胞，通过检测人淋巴细胞损伤程度及遗传损伤程度来评价其 安全性，评价方法周期短，费用低，简便易行，检测敏感度高，可用以系列型号转基因玉米及 其相关衍生产物的安全性评价，具有实际的应用前景。本发明既可独立评价转基因玉米，亦可与其他检验方法结合，综合评价转基因玉 米安全性。进一步地，本发明采用CCK-8试验、中性红试验、彗星试验、微核试验来检测人淋 巴细胞的细胞损伤程度及遗传损伤程度，可以对转基因玉米细胞毒性和遗传毒性进行综合 评价，得到更客观的结果。本发明在细胞毒性及遗传毒性检测方面各选取两种不同检测机理的试验，其目的 在于提高检测灵敏度及准确度。其中，CCK-8试验主要通过评价细胞内脱氢酶的活力来检测 细胞的存活率；中性红试验通过测量溶酶体染料的摄人来反映细胞的存活率；彗星试验是 一种简便、快速、灵敏、花费少的技术，适于评价细胞DNA损伤程度；微核试验是一种快速、 简便检测染色体损伤的方法，可用于评价细胞染色体损伤程度。CCK-8试验、中性红试验同 属细胞毒性检测试验，但两者的检测机理不同，两者有机结合，可有效提高检测灵敏度和准 确度；彗星试验、微核试验同属遗传毒性检测试验，但由于不同的生物学检测终点，两者可 有效互补，提高检测灵敏度和准确度。本发明中，所述阳性诱变剂选择面较广，多种抗癌药物如甲氨蝶呤、博来霉素等均 有细胞损伤及遗传损伤作用，但损伤作用较为单一。本发明优选阿霉素、长春新碱作为阳性诱变剂。阿霉素用于模拟多通道DNA损伤， 诱使细胞出现多种类型DNA损伤，导致细胞死亡；长春新碱用于模拟染色体损伤，诱使细胞 出现染色体畸变、姐妹染色单体交换损伤，导致细胞死亡。针对彗星试验、微核试验检测细 胞生物学终点，这两类阳性诱变剂损伤类型多样化，将该两种阳性诱变剂有机结合，能更为 理想地验证本发明中试验方法的灵敏度和准确度。此外，长春新碱诱使细胞出现染色体损 伤在细胞毒性方面要低于阿霉素直接引起的细胞DNA损伤。CCK-8试验、中性红试验采用长 春新碱作为阳性诱变剂，也能更好地验证检测方法的灵敏度。
具体实施例方式以下以型号为CrylAb转基因玉米为实例进一步解释本发明，但实施例并不对本 发明做任何限定LCrylAb转基因玉米全蛋白制备
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裂解提取1).取新鲜CrylAb转基因玉米样本。在液氮条件下，用研钵充分研磨成粉末。2).融解Western及IP细胞裂解液(适用于Western和免疫沉淀的细胞裂解液)， 混勻。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入苯甲基磺酰氟(PMSF)，使苯甲基磺酰氟的 最终浓度为ImM。3).取50mg样品，按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解 液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当 减少裂解液的用量。)4).用玻璃勻浆器勻浆，直至充分裂解。5).充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清。注所有提取步骤均在4°C下进行。蛋白浓缩清洗1).将上清液放入密理博Microcon Ultra-O. 5 3000超滤管；再放入1. 5ml离心管。2). 14000g离心，弃离心管里滤液；3).往超滤管中加入450ul 4°C预冷的IX磷酸缓冲液(PBS)；4). 14000g离心，弃离心管里滤液；5).重复 3、4 步骤;6).换新的1.5ml离心管，倒置超滤管，IOOOg离心，收集蛋白。将提取的转基因玉米全蛋白置于磷酸盐缓冲液(PBS)中溶解并超声振荡混勻。把 配置好的lmg/ml的原液置于零下80度低温冰箱保存，用时现取。2、非转基因玉米全蛋白制备可选取作为对照非转基因玉米的品种范围较广，任何非转基因玉米品种皆可以作 为对照样本，如玉米“龙单38”;“绥玉10”;“海玉十号”;“鑫珏1号”等，但在种系上与所评 价的转基因玉米一致或接近为好。本例采用“吉单27”玉米，其全蛋白制备的具体步骤同 上。保存方法同上。3、细胞暴露Iml人淋巴细胞(密度为50000细胞)悬液移入24孔培养板中37°C培养，使细胞 生长在培养板上。转基因玉米全蛋白和非转基因玉米全蛋白的暴露时间和浓度见表1。磷 酸盐缓冲液(PBS)作为空白剂阴性对照，长春新碱作为CCK-8试验、中性红摄取试验和微核 试验的阳性对照，阿霉素作为彗星试验(COMET)的阳性对照。所有试验重复三次。表1在4种试验中蛋白暴露浓度和暴露时间浓度(Mg/ml)
时间
权利要求
转基因玉米安全性评价方法，其特征在于它包括如下步骤(1)、提供人淋巴细胞、待测转基因玉米的全蛋白、非转基因玉米全蛋白、阳性诱变剂；(2)、对人淋巴细胞分成各组进行孵育对人淋巴细胞与待测转基因玉米全蛋白共同孵育，对人淋巴细胞与非转基因玉米全蛋白共同孵育，对人淋巴细胞与所述阳性诱变剂共同孵育，对人淋巴细胞与空白剂共同孵育；(3)、分别检测与待测转基因玉米全蛋白共同孵育的人淋巴细胞、与非转基因玉米全蛋白共同孵育的人淋巴细胞、与所述阳性诱变剂共同孵育的人淋巴细胞、与空白剂共同孵育的人淋巴细胞的细胞损伤程度及遗传损伤程度，根据人淋巴细胞的细胞损伤程度及遗传损伤程度判别所述待测转基因玉米的安全性。
2.如权利要求1所述的转基因玉米安全性评价方法，其特征在于检测人淋巴细胞的细 胞损伤程度的方法为CCK-8试验和中性红试验，检测人淋巴细胞的遗传损伤程度的方法为 彗星试验和微核试验。
3.如权利要求2所述的转基因玉米安全性评价方法，其特征在于所述阳性诱变剂选取 阿霉素、长春新碱两种；在步骤(2)对人淋巴细胞与所述阳性诱变剂共同孵育中，对人淋巴细胞分成以下2组 进行孵育对人淋巴细胞与与阿霉素共同孵育和对人淋巴细胞与与长春新碱共同孵育；在步骤(3)中，与长春新碱共同孵育的人淋巴细胞用于CCK-8试验、中性红摄取试验和 微核试验的阳性对照，与阿霉素共同孵育的人淋巴细胞用于彗星试验的阳性对照。
4.如权利要求1所述的转基因玉米安全性评价方法，其特征在于待测转基因玉米全蛋 白的孵育终浓度为200、100、50、25、12· 5 μ g/ml,并各分别孵育1. 5h、6h、24h ；非转基因玉 米全蛋白的孵育终浓度为200、100、50、25、12. 5μ g/ml，并各分别1. 5h、6h、24h。
5.如权利要求1、2、3或4所述的转基因玉米安全性评价方法，其特征在于在步骤(3) 中采用以下方法判定如与所述阳性诱变剂共同孵育的人淋巴细胞和与空白剂共同孵育的人淋巴细胞的细 胞损伤程度及遗传损伤程度无显著差异，说明所选取试验方法不能有效检测阳性诱变剂引 起的细胞毒性及遗传毒性损伤，则不进行与待测转基因玉米全蛋白共同孵育的人淋巴细胞 和与非转基因玉米全蛋白共同孵育的人淋巴细胞细胞损伤程度及遗传损伤程度对比；如与所述阳性诱变剂共同孵育的人淋巴细胞和与空白剂共同孵育的人淋巴细胞的细 胞损伤程度有显著差异，再比较与待测转基因玉米全蛋白共同孵育的人淋巴细胞和与非转 基因玉米全蛋白共同孵育的人淋巴细胞细胞损伤程度，如无显著差异，则判定待测转基因 玉米与非转基因玉米的细胞毒性相似，可安全食用；如细胞损伤程度存在显著差异，则认为 待测转基因玉米较非转基因玉米更具有细胞毒性，食用存在不安全性；如与所述阳性诱变剂共同孵育的人淋巴细胞和与空白剂共同孵育的人淋巴细胞的遗 传损伤程度有显著差异，再比较与待测转基因玉米全蛋白共同孵育的人淋巴细胞和与非转 基因玉米全蛋白共同孵育的人淋巴细胞遗传损伤程度，如无显著差异，则判定待测转基因 玉米与非转基因玉米的遗传毒性相似，可安全食用；如遗传损伤程度存在显著差异，则认为待测转基因玉米较非转基因玉米更具有遗传毒性，食用存在不安全性。
全文摘要
本发明公开了一种转基因玉米安全性评价方法，该方法通过人淋巴细胞系传代培养，将转基因玉米全蛋白提取物作用于人淋巴细胞，通过检测人淋巴细胞损伤程度及遗传损伤程度来评价其安全性，评价方法周期短，费用低，简便易行，检测敏感度高、准确，可用以系列型号转基因玉米及其相关衍生产物的安全性评价，具有实际的应用前景。
文档编号C12Q1/68GK101948924SQ20101029607
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月29日 优先权日2010年9月29日
发明者吕沁风, 吴忠华, 李 禾, 郑伟, 陈吴建 申请人:浙江国际旅行卫生保健中心