转基因玉米ie034的定性pcr检测引物、方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，涉及转基因植物及其产品的检测方法，具体涉及转基因玉米IE034的定性PCR检测引物、方法及试剂盒。本方法首先公开了用于精准检测转基因玉米IE034的特异性引物对。在此基础上，本发明建立了一种特异性强、灵敏度高的转基因玉米IE034的定性PCR检测方法。本发明进一步公开了一种转基因玉米IE034的定性PCR检测试剂盒。实验证明，本发明提供的转基因玉米IE034定性PCR检测引物、方法及试剂盒具有特异性强、灵敏度高等优点，适用于转基因玉米IE034及其衍生品种的特异性精准检测。
【专利说明】转基因玉米丨E034的定性PCR检测引物、方法及试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，涉及转基因植物及其产品的检测方法，具体涉及转基 因玉米IE034的定性PCR检测引物、方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 转基因玉米IE034是将密码子经过优化的杀虫基因通过农杆菌介导法转 入玉米基因组中，获得的一个抗虫转基因玉米新品系。目前，IE034玉米已进入生产性试验 阶段，具有重大产业化应用前景。建立IE034玉米的转化体特异性精准检测方法，是对该转 基因玉米进行安全评价和安全监管的重要手段。
[0003] PCR技术是当前国内外转基因产品检测中应用最为广泛的方法。迄今为止，缺乏一 种针对转基因抗虫玉米IE034及其衍生品种的特异性强、灵敏度高的定性PCR检测方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于公开转基因玉米IE034的定性PCR检测引物。
[0005] 本发明的另一个目的在于公开一种转基因玉米IE034的定性PCR检测方法。
[0006] 本发明的另一个目的在于公开一种转基因玉米IE034的定性PCR检测试剂盒。
[0007] 本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的： 根据转基因玉米IE034的转化体特异性序列，设计合成IE034玉米的特异性定性PCR 检测引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0: 1~2;确定定性PCR的反应体系及反应程序；对定性 PCR检测方法进行特异性、灵敏度等测试。
[0008] 转基因玉米IE034转化体特异性定性PCR检测引物，其核苷酸序列为： 上游引物序列，IE034-F1 :5' -TGCAGGAGAAGTTTGATGGA-3'（SEQ ID NO :1); 下游引物序列，IE034-R1 :5' -GGGTTTCGCTCATGTGTTG-3'（SEQ ID N0:2)。
[0009] 转基因玉米IE034转化体特异性定性PCR检测方法，包括以下步骤： (1) 合成上游引物（SEQ ID N0:1)和下游引物（SEQ ID N0:2); (2) 制备待测样品的基因组DNA溶液； (3) 配制定性PCR反应体系； (4) 运行定性PCR反应程序； (5) 若待测样品中扩增出258bp的特异性条带，则该样品中含有转基因玉米IE034转化 体成分；若待测样品中未扩增出258bp的条带，则该样品中不含有转基因玉米IE034转化体 成分。
[0010] 进一步地，步骤（1)所述合成的上游引物和下游引物的浓度均为10Mffl〇l/L，步骤 (2)所述制备的DNA溶液的浓度为50ng/ μ L。
[0011] 进一步地，步骤（3)所述的配制定性PCR反应体系的总体积为25 μ L，包括以下组 分：10XPCR缓冲液2. 5 μ L、dNTPs混合溶液2 μ L、上游引物0. 5 μ L、下游引物0. 5 μ L、Taq DNA 聚合酶(λ 125 μ L、DNA 溶液 2 μ L、水 17. 375 μ L。
[0012] 进一步地，步骤（4)所述的定性PCR反应程序为：94°C变性5min ;94°C变性30s， 58°〇退火3〇8,721：延伸3〇8，共进行35次循环；721：延伸71^11。
[0013] 另外，本发明公开的转基因玉米IE034转化体特异性定性PCR检测试剂盒，包括以 下组分：l〇XPCR缓冲液，dNTPs混合溶液，上游引物IE034-F1和下游引物IE034-R1，Taq DNA聚合酶和水。
[0014] 通过实验证明，本发明提供的转基因玉米IE034的定性PCR检测引物、方法及试剂 盒具有特异性强、灵敏度高等优点，适用于转基因玉米IE034及其衍生品种的特异性精准 检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1为IE034玉米定性PCR检测方法的反应程序的筛选结果，a为56°C退火，b为 58°C退火，c为60°C退火，d为62°C退火，e为64°C退火；1为空白对照，2为阴性对照，3为 质量分数为1%的IE034玉米，4为质量分数为0. 1%的IE034玉米； 图2为IE034玉米定性PCR检测方法的特异性测试结果，1为空白对照，2为阴性对 照，3为质量分数为1%的IE034玉米，4为转基因玉米M0N89034、M0N810、Btll、Btl76、 M0N863、M0N88017、MIR604、TC1507、59122 和 NK603 的混合样品，5 为转基因大豆 M0N89788、 GTS40-3-2、A2704-12、A5547-127、305423 和 356043 的混合样品，6 为转基因水稻 KF-6、 TT51-1 和 KMD-1 的混合样品，7 为转基因棉花 M0N531、M0N15985、M0N1445 和 LLC0TT0N25 的 混合样品，8为转基因油菜RF1、MS1、Topas 19/2和T45的混合样品，Μ为DNA分子量Marker ; 图3为IE034玉米定性PCR检测方法的灵敏度测试结果，1为空白对照，2为阴性对照， 3?7依次为IE034玉米质量分数分别为1%、0· 5%、0· 1%、0· 05%、0· 01%的测试样品，Μ为DNA 分子量Marker。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0017] 实施例1转基因玉米IE034的定性PCR检测方法的反应程序优化 以质量分数分别为1%和〇. 1%的IE034玉米为测试对象，以非转基因玉米综31为阴 性对照，以灭菌超纯水为空白对照，设置56°C、58°C、60°C、62°C、64°C等5个退火温度，采用 0· 2 μ mol/L的引物终浓度，进行定性PCR扩增。
[0018] 结果表明（图1)，使用5种不同的退火温度进行PCR扩增时，在IE034玉米质量分 数为1%和0. 1%的样品中均能扩增获得258bp的特异性条带，表明本发明所述的检测方法 对退火温度有很好的容许度，最终确定退火温度优选为58°C，引物终浓度为0. 2 μ mol/L。
[0019] 实施例2转基因玉米IE034的定性PCR检测方法的特异性测试 对实施例1所述的转基因玉米IE034的定性PCR检测方法的特异性进行测试，测试 样品包括：质量分数为1%的IE034玉米，由转基因玉米M0N89034、M0N810、Btll、Btl76、 M0N863、M0N88017、MIR604、TC1507、59122和NK603制成的混合样品（每种转化体的质量 分数为 1%)，由转基因大豆 M0N89788、GTS40-3-2、A2704-12、A5547-127、305423 和 356043 制成的混合样品（每种转化体的质量分数为1%)，由转基因水稻KF-6、TT51-1和KMD-1制 成的混合样品（每种转化体的质量分数为1%)，由转基因棉花M0N531、M0N15985、M0N1445 和LLC0TT0N25制成的混合样品（每种转化体的质量分数为1%)，由转基因油菜RF1、MSI、 Topasl9/2和T45制成的混合样品（每种转化体的质量分数为1%)，非转基因玉米综31。
[0020] 结果表明（图2)，仅质量分数为1%的IE034玉米样品中扩增出258bp的特异性条 带，而其他转基因作物和非转基因玉米中均未扩增出258bp的条带，表明本发明所述的检 测方法对转基因玉米IE034具有很好的特异性。
[0021] 实施例3转基因玉米IE034的定性PCR检测方法的灵敏度测试 将转基因玉米IE034与对应的非转基因玉米综31按质量比，混合制成IE034玉米质量 分数分别为l%、〇. 5%、0. 1%、0. 05%、0. 01%的样品，对实施例1所述的转基因玉米IE034的定 性PCR检测方法的灵敏度进行测试。
[0022] 结果表明（图3)，在IE034玉米质量分数为0. 05%以上(含0. 05%)的样品中均能稳 定扩增出258bp的特异性条带，表明本发明所述的检测方法的灵敏度可达到0. 05%。
[0023] 应当说明的是，上述实施例为本发明的具体实施例子，但本发明的实施方式并不 受上述实施例的限制，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的 所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【权利要求】
1. 转基因玉米IE034转化体特异性定性PCR检测引物，其特征在于： 上游引物序列，IE034-F1 :5' -TGCAGGAGAAGTTTGATGGA-3'（SEQ ID NO :1); 下游引物序列，IE034-R1 :5' -GGGTTTCGCTCATGTGTTG-3'（SEQ ID N0:2)。
2. 转基因玉米IE034转化体特异性定性PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 合成权利要求1所述的上游引物和下游引物； (2) 制备待测样品的基因组DNA溶液； (3) 配制定性PCR反应体系； (4) 运行定性PCR反应程序； (5) 若待测样品中扩增出258bp的特异性条带，则该样品中含有转基因玉米IE034转化 体成分；若待测样品中未扩增出258bp的条带，则该样品中不含有转基因玉米IE034转化体 成分。
3. 根据权利要求2所述的转基因玉米IE034转化体特异性定性PCR检测方法，其特征 在于，步骤（1)所述合成的上游引物和下游引物的浓度均为10Mffl 〇l/L，步骤（2)所述制备的 DNA溶液的浓度为50ng/ μ L。
4. 根据权利要求2和3所述的转基因玉米ΙΕ034转化体特异性定性PCR检测方法，其特 征在于，步骤（3)所述的配制定性PCR反应体系的总体积为25 μ L，包括以下组分：10XPCR 缓冲液2. 5 μ L、dNTPs混合溶液2 μ L、上游引物0. 5 μ L、下游引物0. 5 μ L、Taq DNA聚合酶 0· 125 μ L、DNA 溶液 2 μ L、水 17. 375 μ L。
5. 根据权利要求2?4所述的转基因玉米ΙΕ034转化体特异性定性PCR检测方法，其 特征在于，步骤（4)所述的定性PCR反应程序为：94°C变性5min ;94°C变性30s，58°C退火 3〇8,721：延伸3〇8，共进行35次循环；721：延伸71^11。
6. 转基因玉米IE034转化体特异性定性PCR检测试剂盒，包括以下组分：10XPCR缓冲 液，dNTPs混合溶液，权利要求1所述的上游引物和下游引物，Taq DNA聚合酶和水。
【文档编号】C12Q1/68GK104195256SQ201410457456
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月10日 优先权日:2014年9月10日
【发明者】李飞武, 龙丽坤, 李葱葱, 徐俊锋, 刘允军, 闫伟, 董立明, 武奉慈 申请人:吉林省农业科学院