转基因玉米ie034的转化体特异性定量pcr检测引物和探针及方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，涉及转基因植物及其产品的检测方法，具体涉及转基因玉米IE034的定量PCR检测引物和探针及方法。本方法首先公开了用于精准检测转基因玉米IE034的特异性引物和探针。在此基础上，本发明建立了一种特异性强、灵敏度高、准确性好的转基因玉米IE034的定量PCR检测方法。实验证明，本发明提供的转基因玉米IE034的转化体特异性定量PCR检测引物和探针及方法具有特异性强、灵敏度高、稳定性好等优点，适用于转基因玉米IE034及其衍生品种的特异性定量检测。
【专利说明】转基因玉米丨E034的转化体特异性定量PCR检测引物和探 针及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，涉及转基因植物及其产品的检测方法，具体涉及转基 因玉米IE034的转化体特异性定量PCR检测引物和探针及方法。
【背景技术】
[0002] 转基因玉米IE034是将密码子经过优化的杀虫基因通过农杆菌介导法转 入玉米基因组中，获得的一个抗虫转基因玉米新品系。目前，IE034玉米已进入生产性试验 阶段，具有重大产业化应用前景。建立IE034玉米的转化体特异性精准检测方法，是对该转 基因玉米进行安全评价和安全监管的重要手段。
[0003] PCR技术是当前国内外转基因产品检测中应用最为广泛的方法。迄今为止，缺乏一 种针对转基因抗虫玉米IE034及其衍生品种的特异性强、灵敏度高、准确性好的定量PCR检 测方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于公开转基因玉米IE034的转化体特异性定量PCR检测引物及配 套使用的荧光探针。
[0005] 本发明的另一个目的在于公开一种转基因玉米IE034的转化体特异性定量PCR检 测方法。
[0006] 本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的： 根据转基因玉米IE034的转化体特异性序列，设计合成IE034玉米的特异性定量PCR 检测引物和探针，其核苷酸序列如SEQ ID N0: 1~3;确定定量PCR的反应体系；对定量PCR 检测方法进行线性、特异性、检测限、定量限、准确性等测试。
[0007] 转基因玉米IE034转化体特异性定量PCR检测引物，其核苷酸序列为： 上游引物序列，IE034-QF1 :5' -AGCTTCGCACTCAGCAGTAAG-3'（SEQ ID NO :1); 下游引物序列，IE034-QR1 :5' -AACGTCCGCAATGTGTTATT-3'（SEQ ID NO :2); 荧光探针序列，IE034-QP:5'-FAM- CAAGAAGCAGGTCCCAGTATAITTTGTGGTG -TAMRA-3' (SEQ ID NO ：3)〇
[0008] 转基因玉米IE034转化体特异性定量PCR检测方法，包括以下步骤： (1) 合成上游引物（SEQ ID N0:1)、下游引物（SEQ ID N0:2)和荧光探针（SEQ ID N0: 3)； (2) 制备待测样品的基因组DNA溶液； (3) 配制定量PCR反应体系； (4) 运行定量PCR反应程序。
[0009] 进一步地，步骤（1)所述合成的上游引物、下游引物及荧光探针的浓度均为 10Mm〇l/L，步骤（2)所述制备的DNA溶液的浓度为50ng/l·! L。
[0010] 进一步地，步骤（3)所述的配制定量PCR反应体系的总体积为25 μ L，包括以下 组分：2XTaqMan Real-time PCR Mix 12.5以1^、上游引物1以1^、下游引物1以1^、荧光探针 0· 5 μ L、DNA 溶液 2 μ L、水 8 μ L。
[0011] 进一步地，步骤（4)所述的定量PCR反应程序为：95°C变性lOmin ;95°C变性15s， 60°C退火30s，共进行45次循环。
[0012] 通过实验证明，本发明提供的转基因玉米IE034的定量PCR检测引物和探针及方 法具有特异性强、灵敏度高、准确性好等优点，适用于转基因玉米IE034及其衍生品种的特 异性定量检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1为IE034玉米定量PCR检测方法的反应体系的筛选结果，a~e依次为引物/探 针终浓度为 0· 8 μ mol/L/0. 4 μ mol/L、0. 6 μ mol/L/0. 4 μ mol/L、0. 4 μ mol/L/0. 2 μ mol/L、 0· 2 μ mol/L/0. 1 μ mol/L、0. 1 μ mol/L/0. 04 μ mol/L等5个组合的扩增曲线及标准曲线； 图2为IE034玉米定量PCR检测方法的扩增曲线及标准曲线，1飞依次为IE034玉米 基因组 DNA 拷贝数为 9000copies/ μ L、2250copies/ μ L、560copies/ μ L、140copies/ μ L、 70copies/y L、35copies/y L 的标准样品； 图3为IE034玉米定量PCR检测方法的特异性测试结果，1为IE034玉米。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0015] 实施例1转基因玉米IE034的定量PCR检测方法的反应体系优化 用灭菌超纯水将IE034玉米的基因组DNA按照4倍梯度稀释，获得6个IE034玉米DNA 测试样品（1: 1，1:4,1:16 ;1:64 ; 1:256 ; 1:1024);以非转基因玉米综31为阴性对照，以灭菌 超纯水为空白对照，定量PCR反应体系中的引物/探针终浓度设置0· 8 μ mol/L/0. 4 μ mol/ L、0. 6 μ mol/L/0. 4 μ mol/L、0. 4 μ mol/L/0. 2 μ mol/L、0. 2 μ mol/L/0. 1 μ mol/L、0. 1 μ mol/ L/0. 04 μ mol/L等5个组合，采用通用的定量PCR反应程序，进行PCR扩增，每个样品平行4 次；以6个IE034玉米DNA测试样品制作标准曲线。
[0016] 结果表明（图1)，使用5种不同终浓度的引物/探针组合进行定量PCR扩增时，除 0. 1 μ mol/L/0. 04 μ mol/L组合外，其他4种组合均符合下述国际公认标准：扩增效率（E) 介于90%?110%，决定系数（R2值）彡98%，斜率介于-3. 1?-3. 6,表明本发明所述的检 测方法对不同引物/探针终浓度有很好的容许度，最终确定引物/探针终浓度组合优选为 0·6 μ mol/L/0. 4 μ mol/L〇
[0017] 实施例2转基因玉米IE034的定量PCR检测方法的标准曲线 用灭菌超纯水将IE034玉米的基因组DNA进行梯度稀释，制备6个IE034玉米DNA标准 样品（9000copies/y L、2250copies/y L、560copies/y L、140copies/y L、70copies/y L、 35copies/yL、18copies/yL)，用于制作实施例1所述的转基因玉米IE034的定量PCR检 测方法的标准曲线，每个样品平行4次。
[0018] 结果表明（图2)，标准曲线的扩增效率（E)为95. 8%，决定系数（R2值）为0.997， 斜率为-3. 426,均符合国际公认标准(扩增效率介于90%?110%，决定系数> 98%，斜率介 于-3. 1?-3. 6)，表明依据本发明所述的定量PCR检测方法建立的标准曲线具有很好的线 性。
[0019] 实施例3转基因玉米IE034的定量PCR检测方法的检测限和定量限 用灭菌超纯水将IE034玉米的基因组DNA进行梯度稀释，制备7个IE034玉米DNA测试 样品（7〇copies/y L、35copies/y L、18copies/y L、9copies/y L、4copies/y L、2copies/ 111^、1(：〇?化8/^〇，对实施例1所述的转基因玉米此034的定量？0?检测方法的检测线 (L0D)和定量限（L0Q)进行评价，每个样品平行10次。
[0020] 结果表明（表1)，当样品中IE034玉米的含量彡4copies/y L时，在10次平行试验 中均能获得典型扩增曲线，且Ct值均< 37,表明本发明所述的定量PCR方法的检出限可达 4个拷贝；当样品中IE034玉米的含量彡35C〇pi es/l·! L时，在10次平行试验中均能获得典 型扩增曲线，Ct值的极差< 0. 5,且10次平行的Ct值相对标准差< 25%，表明本发明所述 的定量PCR方法的定量限可达35个拷贝。
[0021] 表 1
【权利要求】
1. 转基因玉米IE034转化体特异性定量PCR检测引物和探针，其特征在于： 上游引物序列，IE034-QF1 :5' -AGCTTCGCACTCAGCAGTAAG-3'（SEQ ID NO :1); 下游引物序列，IE034-QR1 :5' -AACGTCCGCAATGTGTTATT-3'（SEQ ID NO :2); 荧光探针序列，IE034-QP:5'-FAM- CAAGAAGCAGGTCCCAGTATAITTTGTGGTG -TAMRA-3' (SEQ ID NO ：3)〇
2. 转基因玉米IE034转化体特异性定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 合成权利要求1所述的上游引物、下游引物和荧光探针； (2) 制备待测样品的基因组DNA溶液； (3) 配制定量PCR反应体系； (4) 运行定量PCR反应程序。
3. 根据权利要求2所述的转基因玉米IE034转化体特异性定量PCR检测方法，其特征 在于，步骤（1)所述合成的上游引物、下游引物及荧光探针的浓度均为10Mffl〇l/L，步骤（2) 所述制备的DNA溶液的浓度为50ng/ μ L。
4. 根据权利要求2和3所述的转基因玉米ΙΕ034转化体特异性定量PCR检测方法， 其特征在于，步骤（3)所述的配制定量PCR反应体系的总体积为25yL，包括以下组分 ： 2XTaqMan Real-time PCR Mix 12.5 4 1^、上游引物14 1^、下游引物14 1^、荧光探针0.5 4 1^、 DNA 溶液 2 μ L、水 8 μ L。
5. 根据权利要求2?4所述的转基因玉米ΙΕ034转化体特异性定量PCR检测方法，其 特征在于，步骤（4)所述的定量PCR反应程序为：95°C变性lOmin ;95°C变性15s，60°C退火 30s，共进行45次循环。
【文档编号】C12N15/11GK104195257SQ201410457457
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月10日 优先权日:2014年9月10日
【发明者】李飞武, 闫伟, 龙丽坤, 徐俊锋, 刘允军, 李葱葱, 董立明, 武奉慈 申请人:吉林省农业科学院