专利名称：检测肉牛早熟性的引物及其方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测肉牛早熟性的引物及其方法与应用。
背景技术：
青春期启动在家畜繁殖研究中占有重要地位，与其繁殖力和生长发育有着密切的 关联性。哺乳动物的青春期启动以及繁衍后代的行为是从下丘脑神经细胞分泌的脉冲性 GnRH(促性腺激素释放激素)开始的，而GnRH的分泌由一系列上游作用因子所调控。研究 证实，GPR54基因在下丘脑、垂体和胎盘等多种组织中表达，在青春期的下丘脑表达量最大， 并随动情周期呈现周期性的变化。GPR54通过与kissp印tin结合后，活化GnRH的表达，进 而打开下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴，启动青春期发育。在进化过程中所形成的性早熟特 性能够稳定的遗传，如能发现控制早熟性状的主效基因，或与之紧密连锁的分子标记，则对 加快动物的繁殖力和生长发育性状的育种进程具有重要的意义。目前，杂交改良是牛的育种，尤其是肉牛育种的主要手段，工作时间长，效果缓慢; 选种方法主要是常规育种，突破牛的单胎特性还没有可能性，由于缺少合适的遗传标记，应 用分子育种解决育种难题则相当困难。
发明内容
本发明的目的是提供一种可用于检测肉牛早熟性的引物及其方法与应用。本发明所提供的检测肉牛早熟性的引物，其核苷酸序列如序列表中序列1和序列 2所示。本发明所提供的检测肉牛早熟性的方法，是以待测牛基因组DNA为模板，以序列 表中序列1和序列2所示的DNA分子为引物，进行PCR扩增，Mae II和Nla IV限制性内切酶 分别酶切PCR扩增产物，检测Mae II和Nla IV限制性内切酶酶切产物的大小；当Mae II酶切后的PCR产物含有两条临近的DNA片段，大小都在100 200bp ； Nla IV酶切后的PCR产物含有两条DNA片段，大小分别在100 200bp、200 300bp，待测 牛为GPR973-CC-TT基因型；当Mae II酶切后的PCR产物含有三条DNA片段，其中两个片段的大小都在100 200bp，另一片段的大小在300 400bp ；Nla IV酶切后的PCR产物含有三条DNA片段，大小 分别在 100 200bp、200 300bp、300 400bp，待测牛为 GPR973-CT-TC 基因型；当Mae II酶切后的PCR产物含有一条DNA片段，大小在300 400bp ；Nla IV酶切 后的PCR产物含有一条DNA片段，大小在300 400bp，待测牛为GPR973-TT-CC基因型。所述GPR973-CC-TT基因型牛要比GPR973-TT-CC基因型牛或所述GPR973-CT-TC 基因型牛早熟。本发明的检测牛早熟性的方法，其中所述检测Mae II和NlaIV限制性内切酶酶切 产物的大小的方法为琼脂糖凝胶电泳。本发明所提供的培育肉牛的方法，是用所述检测肉牛早熟性的方法，获得GPR973-CC-TT基因型的牛，以所述GPR973-CC-TT基因型的牛为亲本进行育种获得牛。本发明检测肉牛早熟性的方法，能通过简单的PCR扩增和酶切确定待测牛的基因 型，GPR973-CC-TT基因型牛要比GPR973-TT-CC基因型牛或所述GPR973-CT-TC基因型牛早 熟。以GPR973-CC-TT基因型的牛进行育种可获得候选的早熟的肉牛品系。
图1为Mae II限制性内切酶酶切PCR产物后的图谱。图2为Nla IV限制性内切酶酶切PCR产物后的图谱。
具体实施例方式一、鉴定 GPR973-T/T-C/C 基因型提取西门塔尔牛、安徽地方黄牛牛基因组DNA。以提取的基因组DNA为模板， GPR973S和GPR973A为引物进行PCR扩增，引物GPR973S和GPR973A的核苷酸序列如下GPR973S 5‘ GGCAGGCAGATTCCTAACCACTAG 3‘GPR973A 5‘ TCAACCTTCCCAAGACTCTGATGC 3‘PCR扩增体系总体系 25 μ L，10 μ M/L TPS 1· 0 μ L，10 μ M/L TPA, l.OyL 10XPCR 缓冲液 2. 5 μ L, 2mM/L dNTPs 2. 0 μ L, 5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 0. 5 μ L, IOOng/ μ L 模板 1.0 μ L，其余用超纯水补齐。PCR 扩增条件 95°C预变性 5min ；95°C变性 45s，65°C退火 30s，72°C延伸 30s，35 个 循环，最后72°C延伸5min，4°C保存。用Mae II和Nla IV限制性内切酶分别对PCR产物进行酶切。15yL酶切反应体系=IOOng PCR产物，5U的Mae II或Nla IV限制性内切酶，1. 5 μ L 的IOX缓冲液，加超纯水至15 μ L。37°C过夜消化，3%的琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪分析和拍照，统计基因型。凝胶成像结果如图1所示Mae II酶切后的PCR产物I，在琼脂糖凝胶上呈现两条条带，两条带的大小都在 100 200bp (精确为157bp和184bp)，该牛为CC基因型(图1的泳道1) ；PCR产物经过测
序与预期结果一致；Mae II酶切后的PCR产物II，在琼脂糖凝胶上呈现三条条带，其中两条带的大小 都在100 200bp(精确为157bp和184bp)，另外一条带的大小在300 400bp(精确为 341bp)，该牛为CT基因型(图1的泳道2) ；PCR产物经过测序与预期结果一致；Mae II酶切后的PCR产物III，在琼脂糖凝胶上呈现一条带，该带的大小在300 400bp(精确为341bp)，该牛为TT基因型(图1的泳道3) ；PCR产物经过测序与预期结果一 致。Nla IV酶切后的PCR产物I，在琼脂糖凝胶上呈现两条条带，两条带的大小分别在 100 200bp (精确为123bp) ,200 300bp (精确为218bp)，该牛为TT基因型(图2的泳 道1) ；PCR产物经过测序与预期结果一致。Nla IV酶切后的PCR产物III，在琼脂糖凝胶上呈现一条条带，条带大小在300 400bp(精确为341bp)，该牛为CC基因型(图2的泳道2) ；PCR产物经过测序与预期结果一
4致。Nla IV酶切后的PCR产物II，在琼脂糖凝胶上呈现三条条带，三条带的大小分别在 100 200bp (精确为 123bp)、200 300bp (精确为 218bp)、300 400bp (精确为 341bp)， 该牛为TC基因型(图2的泳道3) ；PCR产物经过测序与预期结果一致。Mae II酶切CC型，Nla IV酶切为TT型，该牛为GPR973_CC_TT基因型；Mae II酶切TT型，Nla IV酶切为CC型，该牛为GPR973-TT-CC基因型；Mae II酶切CT型，Nla IV酶切为TC型，该牛为GPR973-CT-TC基因型。二、GPR973-T/T-C/C基因型与牛早熟性的相关性西门塔尔牛和荷斯坦牛共78头，南阳牛、安徽地方黄牛共103头，南阳牛和安徽地 方黄牛杂交2代113头，用步骤(一)的方法鉴定基因型，同时统计初情期，结果见表1。表1不同基因型牛的基因型频率及其与早熟性之关联性 表1中“未检测到”是指所检测牛中未发现该基因型表明GPR973-CC-TT基因型牛的初情期显著早于GPR973-CT-TC基因型和 GPR973-TT-CC基因型(P < 0. 01)，在实际的肉牛育种中，选择GPR973-CC-TT基因型的牛进 行育种可获得候选的早熟型的肉牛品系。以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进 行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方 案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
权利要求
检测肉牛早熟性的引物，其核苷酸序列如序列表中序列1和序列2所示。
2.检测肉牛早熟性的方法，是以待测牛基因组DNA为模板，以序列表中序列1和序列2 所示的DNA分子为引物，进行PCR扩增，Mae II和Nla IV限制性内切酶分别酶切PCR扩增产 物，检测Mae II和Nla IV限制性内切酶酶切产物的大小；当Mae II酶切后的PCR产物含有两条临近的DNA片段，大小都在100 200bp ；Nla IV 酶切后的PCR产物含有两条DNA片段，大小分别在100 200bp、200 300bp，待测牛为 GPR973-CC-TT 基因型；当Mae II酶切后的PCR产物含有三条DNA片段，其中两个片段的大小都在100 200bp，另一片段的大小在300 400bp ；Nla IV酶切后的PCR产物含有三条DNA片段，大小 分别在 100 200bp、200 300bp、300 400bp，待测牛为 GPR973-CT-TC 基因型；当Mae II酶切后的PCR产物含有一条DNA片段，大小在300 400bp ；Nla IV酶切后的 PCR产物含有一条DNA片段，大小在300 400bp，待测牛为GPR973-TT-CC基因型。所述GPR973-CC-TT基因型牛要比GPR973-TT-CC基因型牛或所述GPR973-CT-TC基因 型牛早熟。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述检测MaeII和Nla IV限制性内切酶 酶切产物的大小的方法为琼脂糖凝胶电泳。
4.培育肉牛的方法，是用权利要求2或3所述的方法检测牛，获得GPR973-CC-TT基因 型的牛，以所述GPR973-CC-TT基因型的牛为亲本进行育种获得牛。
全文摘要
本发明公开了一种检测肉牛早熟性的引物及其方法与应用，检测肉牛早熟性的引物，其核苷酸序列如序列表中序列1和序列2所示。检测牛早熟性的方法，是以待测牛基因组DNA为模板，以序列表中序列1和序列2所示的DNA分子为引物，进行PCR扩增，Mae Ⅱ和NlaⅣ限制性内切酶分别酶切PCR扩增产物，检测Mae Ⅱ和NlaⅣ限制性内切酶酶切产物的大小；本发明检测牛早熟性的方法，能通过简单的PCR扩增和酶切确定待测牛的基因型，以GPR973-CC-TT基因型的牛进行育种可获早熟的肉牛品系。
文档编号C12Q1/68GK101914616SQ20101019694
公开日2010年12月15日 申请日期2010年6月10日 优先权日2010年6月10日
发明者陈华, 陈宏权 申请人:安徽农业大学