专利名称：一种新型链霉菌分泌表达质粒及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学以及基因工程领域，具体而言，涉及一种链霉菌分泌表达 质粒，以及其在链霉菌中分泌表达外源蛋白的应用。
背景技术：
链霉菌是一种丝状革兰氏阳性细菌，能产生大量的次级代谢产物，如抗生素、免疫 抑制剂等，在医药和农业生产中具有重要的价值。链霉菌表达体系是从20世纪中后期发展 起来的一种新的原核表达体系，具有高效的蛋白分泌机制，并且表达的蛋白通常是可溶性、 具有生物活性的，这些优点使其成为一种非常有前景的表达体系。模式菌天蓝色链霉菌的基因组测序已经完成，变铅青链霉菌(Sti^ptomyces lividans)也已成为一个高效分泌异源蛋白的表达宿主，许多真核蛋白在该系统中获得了 成功的分泌表达，如 TNFa、娃鱼降 丐素(Vrancken K, Ann ej, Secretory production of recombinantproteins by Streptomyces,Future Microbiology,2009,4(2) :181_188)等。到目前为止根据不同的需要已经在链霉菌中构建了大量的质粒载体(Kieser T， Bibb MJ,Buttner MJ,Chater KF,Hopwood DA :PracticalStreptomyces Genitics，2000)， 其中大部分是从变铅青链霉菌ISP5434质粒pIJlOl衍生而来。虽然链霉菌的克隆表达体 系已逐渐完善，但是向链霉菌中直接引入外源基因仍然比大肠杆菌复杂，并且能达到大肠 杆菌表达水平的载体还很少。研究人员在1992年从力达霉素产生菌球孢链霉菌C-1027 (Streptomyces globisporus C-1027)中分离出一种新质粒pSGLl (李晓平，李元，中国抗生素杂志，1992， 17(5) :326 332)，该质粒具有易于分离，分子量小(7. 4kb)和带有多个限制性酶切位 点的特点。进一步的研究表明，PSGLl为高拷贝质粒，其最小复制子位于Sau3AI酶切的 2. Okb片段上(洪斌，李元，球孢链霉菌质粒pSGLl的性质研究，微生物学报，1998，38 (4) 256-260 ；张华，洪斌，李元，链霉菌质粒pSGLl最小复制子序列测定及分析，微生物学报， 1999，39 (4) 327-332)，而且该质粒与常用的pIJlOl衍生质粒相容，可用于异源基因的克 隆和表达。但是该质粒现在还没有充分优化，不含大肠杆菌质粒复制子和接合转移元件 oriT，只能采用原生质体转化的方式来进行链霉菌中外源基因的克隆，操作比较繁琐；没有 方便实用的多克隆位点来克隆需要表达的外源基因；没有外源基因表达必需的启动子；没 有外源基因分泌表达必需的信号肽。因此尚需要进一步开发简便易用、表达效率高的链霉 菌表达载体。
发明内容
基于此需要，发明人进行了多方面的研究，选择了力达霉素产生菌球孢链霉菌 C-1027中的表达元件，由此构建了能在链霉菌中进行重组蛋白表达的新型载体。本发明的一个方面涉及一种表达载体，其为环状，且可操作地连接有源于pSGLl的复制子序列其由SEQ ID NO 1中第5086-7372位所示序列的互补序列构成；
大肠杆菌复制起始区ori序列其由SEQ ID NO 1中第2497-3164位所示序列构 成；氨苄青霉素抗性基因bla序列其由SEQ ID NO=I中第3315-4172位所示序列的 互补序列构成；多克隆酶切位点序列其由SEQ ID NO 1中第1452-1481位所示序列构成；阿普霉素抗性基因aac (3) IV序列其由SEQ ID NO 1中第204-980位所示序列的 构成；源于链霉菌接合转移的必需区oriT序列其由SEQ ID NO 1中第8602-8713位所 示序列构成；cagAp和ermE*p串联的强启动子序列其由SEQ ID NO 1中第1581-2057位所示 序列的互补序列构成；和信号肽序列其由SEQ ID NO 1中第1482-第1580位所示序列的互补序列构成或 者由SEQ ID NO 1中第1482-第1580位所示序列中第1572位至第1574位的CTG替换为 TTA的互补序列构成。本发明另一方面涉及一种表达载体，其为环状，且由SEQ ID NO 1所示序列构成。上述两个方面的表达载体中还可操作地插入有表达外源蛋白的基因。所述外源蛋 白包括细胞因子、肽类生物药物、功能蛋白等，例如集落刺激因子、表皮生长因子、白介素、 胰岛素等；在本发明的一个实施方案中，所述外源蛋白是IL6。本发明还涉及含有上述两个方面的表达载体的宿主细胞，在本发明的一个实施方 案中，所述宿主细胞为链霉菌。本发明还涉及上述两个方面的表达载体在链霉菌中表达外源蛋白的用途，其中的 表达为分泌型表达，蛋白直接分泌到培养基中。所述外源蛋白包括细胞因子、肽类生物药 物、功能蛋白等，例如集落刺激因子、表皮生长因子、白介素、胰岛素等；在本发明的一个实 施方案中，所述外源蛋白是IL6。在本发明中，术语“可操作地连接”是指将核酸与另外的核酸序列置于在功能上具 有关系的状态。这可以是相互连接的基因和控制序列以这样的方式连接，使得当适当的分 子被结合到控制序列时，该基因的表达变得可行。例如，如果启动子控制编码序列的转录， 那么该启动子将可操作性地与该序列结合。通常，术语“可操作地连接”是指被连接的DNA 序列是相邻的，并且在分泌性前导序列的情况中，是相邻的且在阅读框内。所述序列的连接 是通过在适当的限制酶位点上进行连接来实施的。如果所述位点不存在，可以使用根据常 规方法合成的寡聚核苷酸衔接子或接头。具体而言，发明人按照下述技术方案制备得到了新型的表达载体从pSGLl质粒得到pSGLl的最小复制子(所述复制子是DNA分子中能独立进行复 制的最小功能单位)。从pBluescript II KS+质粒获得大肠杆菌复制起始区ori和氨苄青霉素抗性基 因 bla。从质粒pOJ446中酶切得到源于链霉菌接合转移的必需区oriT和阿普霉素抗性基 因 aac (3)IV。
从质粒pL646中获得启动子ermE*p片段。从力达霉素产生菌球孢链霉菌C-1027的基因组中得到包含力达霉素辅基蛋白基 因cagA启动子cagAp和信号肽的序列cagA ，并采用突变的方法获得包含cagA启动子 cagAp和突变型信号肽SP。agA(CTe)的序列cagA 。WpSGLl的最小复制子为骨架，将上述各片段连接，具体连接方式为沿着pSGLl 复制子转录的方向依次连接bla、ori、ermE*p、cagAp、SP。agAfcTC)、多克隆位点(MCS)、aac (3) IV和oriT，其中aac (3) IV的连接方向与转录方向相反。链霉菌基因表达调控是一个非常复杂的过程，选择合适的启动子和信号肽对外源 蛋白的表达量至关重要。在链霉菌中表达真核基因时必须使用原核的启动子，不同的外源 基因通常需要尝试不同的启动子信号肽才能确定最佳的选择，表达载体的构建尽可能的选 用高效转录的基因启动子、高效切割的信号肽。研究发现串联的启动子能增强蛋白的表达量，因此本实验中采用强启动子ermE*p 和力达霉素辅基蛋白基因cagA的启动子串联。信号肽采用突变后的cagA信号肽，cagA是 球孢链霉菌中力达霉素辅基蛋白的编码基因，其信号肽也被用于外源蛋白的分泌。cagA的 信号肽中第三位密码子为链霉菌稀有密码子TTA，其在链霉菌次级代谢中起调控作用。为了 研究其对外源蛋白分泌表达的影响，我们通过定点突变，用CTG取代TTA，不改变其编码的 氨基酸。在本发明的一个实施方案中，链霉菌分泌表达质粒pIMB4和pIMB3的构建包括以 下步骤1)复制区的选择根据已知的pSGLl质粒的酶切图谱，通过实验证实pSGLl的最小复制子存在于Sal I和Sac I两单酶切位点之间。将pSGLl上包含最小复制子的小片段克隆入pUC19-E载体 上，得到包含最小复制子的质粒PUC19-E/SG。2)大肠杆菌复制起始区ori、链霉菌接合转移的必需区oriT、抗性基因的获得及 质粒ρIMBl的构建将pUC19-E/SG双酶切，回收含pSGLl最小复制子的大片段，与pOJ446酶切获得的 包含oriT和aac (3) IV的约2. 2kb的片段，再与pBluescriptll KS+载体双酶切获得的包 含ori和bla的片段进行三片段连接，得到质粒pIMBl。3)启动子，信号肽，多克隆位点的获得本发明以含有ermE*p片段的质粒pL646为模板，设计引物进行PCR扩增，将PCR 产物克隆到pGEM-T载体上，得到质粒pGEM-ermE*p。为了获得cagA的启动子及其突变的信号肽，本发明提取力达霉素产生菌球孢链 霉菌C-1027的基因组为模板，通过设计引物，利用重叠PCR的方法获得包含cagA启动 子cagAp及其突变型信号肽SP。agA(CTe)的序列cagA ，并克隆到pGEM_T载体上，得到质粒 pGEM-cagACTG0采用一步PCR法，获得野生型cagA 的序列，克隆到pGEM_T载体上，得到质 粒 pGEM-cagA 。4)pIMB4 的构建
将质粒pGEM_ermE*p双酶切，回收ermE*p片段，再将质粒pGEM-cagAeTC双酶切，回 收cagAGTG片段，一起连接到经酶切的pIMBl质粒上，得到表达载体pIMB4(SEQ ID NO :1)。同样构建了表达载体PIMB3，与pIMB4的差别仅在于cagA的信号肽编码序列中的TTA未被 CTG所取代。以在S. Iividans TK24中表达人白细胞介素6 (Interleukin-6，IL6)为例，说明本 发明质粒pIMB4的应用效果IL6作为一种多效性细胞因子，在大肠杆菌、酵母以及哺乳动物细胞中都获得了表 达(董宇清，李荣贵，吴光耀，重组人白细胞介素6工程菌的表达和功能初探，北京大学学 报(自然科学版)，2000，36 (4) 468-471 ；Guisez Y, Tison B, Contreras R, production andpurification of recombinant human interleukin-6 secreted by theyeast Saccharomyces cerevisiae, Eur J Biochem, 1991,198(1) :217_222)，但迄今还没有在链 霉菌中表达的报道。本发明以人外周血单核细胞总RNA逆转录而成的cDNA为模板，扩增获 得人的IL6基因并克隆到pGEM-T载体上。，得到质粒pGEM-IL6。将酶切回收的IL6片段与载 体PIMB4进行连接，构建链霉菌表达质粒pIMB4-IL6。将pIMB4_IL6转化大肠杆菌ET12567/ PUZ8002,然后接合转移至变铅青链霉菌S. Iividans TK24，获得重组菌株S. Iividans TK24[pIMB4-IL6]。同样构建了重组菌株S. Iividans TK24[pIMB3_IL6]。重组菌株发酵后， 经检测表明IL6在S. Iividans TK24中获得分泌表达，以pIMB4为载体的产量比以pIMB3 为载体的产量略高，约为0. 61mg/L。进一步对重组菌株S. Iividans TK24[pIMB4_IL6]72h 发酵液进行硫酸铵沉淀、阳离子交换层析、凝胶过滤层析等分离纯化后，每升发酵液可获得 重组人IL6纯品0. 3mg,经HPLC分析纯度达90%以上。发明的有益效果应用pIMB4在链霉菌中表达外源蛋白，具有以下优点1)ρΙΜΒ4采用质粒pSGLl的最小复制子，其拷贝数高，pSGLl在原宿主中的拷贝数 为70，其衍生质粒pSGLS3在变铅青链霉菌中拷贝数达到250 (洪斌，李元，球孢链霉菌质粒 PSGLl的性质研究，微生物学报，1998，38 (4) :256_26)，可通过基因剂量效应达到外源基因 的高表达。2)pIMB4采用质粒pSGLl的最小复制子，与链霉菌常用的piJlOl系列质粒载体相 容，可以用于在同一宿主中同时表达多种蛋白。3)pIMB4同时具有大肠杆菌复制起始区ori，便于在大肠杆菌中进行遗传操作。由 于链霉菌中进行基因操作相对复杂，所以本发明在PIMB4中加入大肠杆菌复制区，可先在 大肠杆菌中完成重组质粒构建，再导入链霉菌中表达。4)pIMB4具有链霉菌接合转移的必需区oriT，便于导入链霉菌宿主。在链霉菌中 导入质粒通常采用原生质体转化方法，操作复杂，转化效率低。本发明在PIMB4种克隆入接 合转移的必需区oriT，可通过大肠杆菌与链霉菌之间的接合转移导入质粒，更加方便。5) ρ IMB4具有两种抗性基因，方便导入不同宿主或与不同质粒并存于同一宿主。6)pIMB4具有强启动子ermE*p和力达霉素辅基蛋白基因cagA的启动子，双启动子 串联方式能增强蛋白的表达量。pIMB4采用突变后的cagA信号肽编码序列，cagA编码蛋白在球孢链霉菌中的表达 量非常高，其信号肽可被用于外源蛋白的分泌，突变后的cagA信号肽编码序列可进一步提 高异源蛋白的表达量。
图IA质粒pIMB4构建过程示意图；图IB质粒pIMB4示意图。图2、重叠PCR法扩增包含cagA启动子cagAp及其突变型信号肽SP。agAfcTC)的编码 序列cagA 示意图。图 3、重组菌株 S. Iividans TK24[pIMB3_IL6]和 S. Iividans TK24[pIMB4_IL6]的 SDS-PAGE分析(A)和Western blot分析(B)。泳道M 预染蛋白分子量Marker ；泳道1,2 对照菌株；泳道 3 :S. Iividans[pIMB4-IL6]；泳道 4 :S. Iividans[pIMB3_IL6]。图 4、重组菌株 S. Iividans TK24 [pIMB3_IL6]和 S. Iividans TK24 [pIMB4_IL6] 的生长曲线及IL6最适表达时间。(A)重组菌株的生长曲线；(B)重组菌株培养液pH变 化示意图；(C)S. Iividans [pIMB3-IL6]不同培养时间上清液的Western blot分析。泳 道M 预染蛋白分子量Marker ；泳道1 :S. Iividans [pIMB3-IL6]发酵24h上清液；泳道2 S. Iividans[pIMB3-IL6]发酵 48h 上清液；泳道 3 :S. Iividans[pIMB3_IL6]发酵 72h 上 清液；泳道 4 :S. Iividans[pIMB3-IL6]发酵 96h 上清液。(D)S. Iividans[pIMB4_IL6] 不同培养时间上清液的Western blot分析。泳道M 预染蛋白分子量Marker ；泳道1 S. Iividans[pIMB4-IL6]发酵 24h 上清液；泳道 2 :S. Iividans[pIMB4_IL6]发酵 48h 上清 液；泳道 3 :S. Iividans[pIMB4-IL6]发酵 72h 上清液；泳道 4 :S. Iividans[pIMB4_IL6]发 酵96h上清液。图 5、ELISA 分析重组菌株 S. Iividans TK24[pIMB3_IL6]和 S. Iividans TK24[pIMB4-IL6]中 IL6 表达水平。图6、HPLC检测重组人IL6样品纯度。图7、重组人IL6表达质粒信号肽切割示意图(A)和N端氨基酸序列测定(B)。图8、pIMB4启动子cagAp和信号肽SP
cagA (CTG)区不思图
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市购获得的常规产品。实施例1ρΙΜΒ4的构建过程1.表达载体链霉菌复制区的选择将pSGLl用SalI和SacI双酶切，回收包含最小复制子的小片段，并连接到同样以 SalI 和 SacI 双酶切的 pUC19-E[pUC19 (Kieser Τ, BibbMJ, Buttner MJ, Chater KF, Hopwood DA =Practical StreptomycesGenitics, 2000)的 EcoR I 位点被人工缺失]载体上，得到质 粒 pUC19-E/SG(图 1A)。2.抗性基因，大肠杆菌复制起始区ori、链霉菌接合转移的必需区ori T的获得大肠杆菌复制起始区ori和氨苄 青霉素抗性基因bla来源于pBluescript II KS+ 质粒(Kieser T, Bibb MJ, Buttner MJ, Chater KF, Hopwood DA Practical Streptomyces Genitics, 2000)，链霉菌接合转移的必需区oriT和阿普霉素抗性基因aac (3) IV通过质粒 pOJ446(Kieser Τ,Bibb MJ,Buttner MJ,Chater KF,Hopwood DA :PracticalStreptomycesGenitics, 2000)酶切得到。在质粒pOJ446上，链霉菌接合转移的必需区oriT和阿普霉素抗性基因aac (3) IV 可通过EcoR I和Pst I双酶切一起获得，但由于在oriT两侧均存在Pst I位点，所以采取 先将pOJ446用EcoR I完全酶切，再以Pst I部分酶切的方式。将pUC19_E/SG用Sac I和 Pst I双酶切，回收含最小复制子的大片段，与上述pOJ446 EcoR I和Pst I酶切获得的约 2. 2kb的片段，再与经过Sac I和EcoR I双酶切的pBluescript IIKS+载体进行3片段一 起连接，得到质粒PlMBl (图1A)，经酶切鉴定正确。3.启动子，信号肽，多克隆位点的获得3. lermE*p基因的获得以含有 ermE氺ρ 片段的质粒 pL646 (Hong B, Phornphisutthimas S, Tilley Ε, Baumberg S, McDowall KJ, Streptomycin production byStreptomyces griseus can be modulated by a mechanism notassociated with change in the adpA component of the A-factorcascade, Biotechnol Lett, 2007, 29 :57_64)为模板,设计两条引物，Ea :5，GCCAAGCTTGACGTCCATGCGAGTGTCCGTTCGA 3，(SEQ ID NO 2)Eb :5’ GCTCTAGATGGGGTCCTCCTGTGGAGTGGTTCT 3’ (SEQ ID NO 3)以Ea和Eb为引物，pL646为模板进行PCR扩增，PCR扩增条件为94°C预变性5 分钟，94°C变性1分钟，56 °C退火30秒，72 °C延伸1分钟，30个循环，72 °C延伸10分钟，将 PCR产物电泳证实获得大小为220bp的条带，将目的条带进行胶回收纯化，3’端加A，克隆到 pGEM-Τ载体(购自Promege公司)上，得到质粒pGEM_ermE*p，质粒转化大肠杆菌TGl感受 态细胞，挑取白斑，行快速裂解初步鉴定。将快速裂解初步鉴定正确的阳性克隆进行插入片 段的序列测定，分别用T7和SP6引物进行测序，测序结果与GenBank数据库进行Blast比 对和分析。结果表明获得的阳性克隆上的插入片段与已知ermE*p启动子序列一致。3. 2 cagA启动子、信号肽序列及多克隆位点的获得为了获得cagA的启动子及其突变的信号肽，本发明提取力达霉素产生菌球孢链 霉菌C-1027(国家药用微生物菌种资源共享平台保藏，编号为CPCC 200270)的基因组为模 板，设计了4条引物(1、02、03、〇4。Cl :5，GCTCTAGACTACCGGTCCGACCTCGCGC 3，(SEQ ID NO 4)C2 :5，TCGGAGCCTACGCATGTCGCTGCGTCACAT 3，(SEQ ID NO 5)C3 :5’ AAGCACGGCGGGACATGTGACGCAGCGAC 3’ (SEQ ID NO 6)C4 5‘GGAATTCAGATCTGATATCCCGCGGCATATGGGCGAAGGCGACGGACTGTG3‘ (SEQ ID NO 7)在Cl的5，端加上了 XbaI酶切位点，C2和C3为定点突变TTA为CTG的引物，C4 引物设计在cagA信号肽切割位点后加上了多克隆位点(MCS)，依次为Ndel，SacII, EcoRV, BglII和EcoRI (图2)。利用重叠PCR的方法(图2)获得包含cagA启动子cagAp及其突
变型信号肽SP。agAfcTC)的编码序列CagAcrc，分三步法。第一步用Cl和C2引物PCR扩增CagA_ClC2段，以C-1027的基因组DNA为模板 进行扩增，PCR扩增条件为94°C预变性5分钟，94°C变性1分钟，52°C退火30秒，72°C延伸 1分钟，30个循环，72°C延伸10分钟，将PCR产物电泳证实获得大小约300bp的条带，将目 的条带进行胶回收纯化。
第二步用C3和C4引物PCR扩增cagA-C3C4段，以C-1027的基因组DNA为模板 进行扩增，PCR扩增条件为94°C预变性5分钟，94°C变性1分钟，56°C退火40秒，72°C延伸 1分钟，30个循环，72°C延伸10分钟，将PCR产物电泳证实获得大小约为120bp的条带，将 目的条带进行胶回收纯化。
第三步用Cl和C4引物PCR扩增cagA-ClC4段，以cagA_ClC2片段和cagA_C3C4片 段做模板进行扩增，PCR扩增条件为94°C预变性5分钟，94°C变性1分钟，52°C退火40秒， 72°C延伸1分钟，30个循环，72°C延伸10分钟，将PCR产物电泳证实获得大小约为390bp的 条带，将目的条带进行胶回收纯化，3’端加A，克隆到pGEM-T载体上，得到质粒pGEM-cagACT(;采用一步PCR法扩增野生型cagA 的序列，以Cl和C4为引物，以C-1027的基 因组DNA为模板进行扩增，PCR扩增条件为94°C预变性5分钟，94°C变性1分钟，52°C退 火40秒，72°C延伸1分钟，30个循环，72°C延伸10分钟，将PCR产物电泳证实获得大小约 为390bp的条带，将目的条带进行胶回收纯化，3’端加A，克隆到pGEM-T载体上，得到质粒 pGEM-cagA 。4. pIMB4和pIMB3表达载体的构建将质粒pGEM-ermE*p用Hind III和Xba I双酶切，回收ermE*p片段，再将质粒 pGEM-cagACTG用Xba I和EcoR I双酶切，回收cagACTG片段，将ermE*p片段和cagAGTG片段 一起连接到经Hind III和EcoR I酶切的pIMBl质粒上，得到表达载体pIMB4 (图IA和图 1B)，经酶切鉴定正确。其中PIMB4启动子cagAp和信号肽SP。agAfcTC)区参见图8。同时，本发 明也构建了含有未突变的cagA信号肽的质粒载体pIMB3，将质粒pGEM-ermE*p用Hind III 和Xba I双酶切，回收ermE*p片段，再将质粒pGEM-cagA 和用Xba I和EcoR I双酶切， 回收cagA 片段，一起连接到经Hind III和EcoR I双酶切的pIMBl质粒上，得到表达载 体pIMB3，经酶切鉴定正确。pIMB3与pIMB4的序列仅有3个碱基不同，位于信号肽的编码 序列上，pIMB3将pIMB4序列1572位至第1574位的CTG替换为TTA。实施例2IL6在新型链霉菌表达载体pIMB3、pIMB4中的克隆表达1IL6重组表达菌株的构建根据已知人IL6基因编码序列，设计两条引物IL6a和IL6b，IL6a:5，TCCATATGGTACCCCCAGGAGAAGATTC 3，(SEQ ID NO 8)IL6b :5，CGGGATCCTTACATTTGCCGAAGAGCCCTC 3，(SEQ ID NO 9)在上游引物IL6a 5，端加上了 Nde I酶切位点，下游引物IL6b 5，端加上了 BamH I酶切位点，且在酶切位点前引入终止密码子TAA。采用Pfu高保真DNA聚合酶进行PCR， 以人外周血单核细胞总RNA逆转录而成的cDNA为模板，PCR扩增条件为94°C预变性5分 钟，94 V变性1分钟,55 0C退火40秒，72 °C延伸2分钟，30个循环，72 °C延伸10分钟，将PCR 产物电泳证实获得大小约为560bp的条带，将目的条带进行胶回收纯化，3’端加A，克隆到 pGEM-T载体上，得到质粒pGEM-IL6。测序结果表明获得的阳性克隆上的插入片段与已知 IL6基因cDNA序列完全一致。将克隆有IL6基因片段的质粒pGEM_IL6用Nde I和BamH I双酶切，回收IL6片段。将酶切回收IL6片段分别与经Nde I和Bgl II双酶切的载体 pIMB3、pIMB4进行连接(BamH I和Bgl II为同尾酶)，连接产物转化大肠杆菌TGl感受态 细胞，挑选转化子并提取质粒进行鉴定。将酶切鉴定正确的重组质粒命名为pIMB3-IL6、pIMB4_IL6，转化大肠杆菌ET12567(pUZ8002)(Kieser Τ, Bibb MJ, Buttner MJ, ChaterKF, Hopwood DA =Practical Streptomyces Genitics，2000)，然后接合转移至变铅青链霉菌S. Iividans TK24(国家药 用微生物菌种资源共享平台保藏，编号为CPCC 200079)。挑取接合子进行PCR鉴定，证实 重组质粒成功转化S. Iividans ΤΚ24，获得的菌株命名为S. lividansTK24[pIMB3_IL6]和 S.Iividans TK24[pIMB4_IL6]。2重组菌株的表达情况2. 1SDS-PAGE 分析和 Western blot 分析重组菌株S. Iividans[pIMB3-IL6]、S. Iividans[pIMB4_IL6]和对照菌株同时 采用CM培养基28°C发酵，取72h发酵液上清，经90 %饱和度硫酸铵沉淀后充分透析，冻 干后样品进行 12 % SDS-PAGE 分析和 Western blot 分析，S. Iividans [pIMB3_IL6]和 S. Iividans[pIMB4-IL6]发酵液上清在分子量约20kD处有明显的特异条带出现，与IL6预 计分子量相符，S. Iividans [pIMB4-IL6]中 IL-6 的表达量略高于 S. Iividans [pIMB3_IL6]， 而含空质粒的对照菌株并不产生IL6(图3)。2. 2重组菌生长曲线及IL6最适表达时间研究2. 2. 1菌丝干重与培养基pH曲线重组菌株S. Iividans[pIMB3-IL6]、S. Iividans[pIMB4_IL6]和对照菌株同时采 用CM培养基28°C发酵，分别在24h、48h、72h、96h取样，测定菌丝干重及发酵液pH值，绘制 菌株的生长曲线和PH变化曲线(图4A，4B)。从图中可以看出，重组菌株在48h内生长较 快，代谢旺盛，PH低于8，在48h菌体干重达到最大；72h时pH上升到8. 0上，此时菌体干重 开始缓慢下降，说明菌丝体已开始自溶；96h时，pH值达到9.0以上，菌体干重继续下降。对 照菌株的生长情况和重组菌株相似。2. 2. 2ffestern blot分析重组人IL6最适表达时间分别取重组菌株S. Iividans [pIMB3-IL6]、S. Iividans [pIMB4_IL6]和对照菌株 24h、48h、72h、96h的发酵液上清，硫酸铵沉淀处理后进行12%的SDS-PAGE。结果显示，随 培养时间延长，S. Iividans [pIMB3-IL6]和 S. Iividans [pIMB4_IL6]在分子量约 20kD 处条 带逐渐变粗，在72h时达到最高(图4C，4D)。Western blot验证了该结果，因此确定采取 72h发酵。2. 2. 3ELISA检测重组人IL6不同时间的表达水平采用IL6ELISA检测试剂盒(R&D公司)检测重组菌株S. Iividans [pIMB3_IL6]、 S. Iividans[pIMB4-IL6]24h、48h、72h、96h的发酵液上清，重组菌株中IL6的表达量随着 培养时间的延长，浓度逐渐升高，在72h达到最高，而后重组蛋白随时间延长而浓度降低。 S. Iividans[pIMB3-IL6]中重组人 IL6 最高表达水平约 0. 5mg/L, S. Iividans[pIMB4_IL6] 中重组人IL6最高表达水平约0. 61mg/L(图5)。实施例3重组人IL6的纯化及生物学活性验证1. IL6理化性质及结构预测在纯化蛋白前首先对目标蛋白的性质做初步分析，主要包括分子量大小和等电点 等。我们用蛋白序列分析软件包ANTHREP0RT 5. 0预测实施例2 S. Iividans [pIMB4_IL6] 表达的IL6的理化性质，IL6蛋白分子量为20813. 87，等电点pi = 6. 175 ；整个分子为疏水 与亲水交错排列的结构；蛋白完全可溶性；无跨膜区结构。
10
2.分离纯化链霉菌表达的重组人IL6我们选择强阳离子交换树脂Q Sepharose Fast Flow作为分离介质，离子交换起 始缓冲液PH高于目标蛋白等电点值2个单位以上，以保证目标蛋白带有净负电荷，因此缓 冲液PH设定为8. 5。Superdex HR 7510/300分离物质分子量范围为3，000-70，000，IL6分 子量20813. 87，位于以上分离范围之内。IL6的分离纯化流程如下首先离心、收集实施例2的S. Iividans[pIMB4-IL6]72h发酵液上清，用90%饱 和度硫酸铵沉淀，离心、弃上清，然后加水溶解、透析，冷干；接着进行阳离子交换层析(Q Sepharose FF)，再透析、冷干；再进行凝胶过滤层析(Superdex HR 75 10/300)，最后超滤 浓缩、冷干。3. HPLC 分析对经过上述步骤纯化后的重组人IL6样品进行高效液相检测，结果表明纯化后的 蛋白样品中重组人IL6的含量高于90% (图6)。4.重组人IL6 N端氨基酸序列测定对经过上述步骤纯化后的重组人IL6 N-端9个氨基酸的序列测定结果如下His -Met-Val-Pro-Pro-Gly-Glu-Asp-Ser，His-Met为信号肽切割位点后加入的酶切位点Nde I 序列(CATATG)编码，Val-Pro-Pro-Gly-Glu-Asp-Ser 紧接 Nde I 位点之后，与天然 IL6 的 N 端氨基酸序列完全一致(图7)。5.重组人IL6的纯化收率采用500ml三角摇瓶，以50mL/瓶进行S. Iividans [pIMB4-IL6]的发酵研究，取发 酵72h发酵液进行纯化，ELISA检测重组IL6含量为0. 61mg/L。1升发酵液经过90%饱和 度硫酸铵沉淀处理后平均能够得到约400mg发酵粗品，经BCA蛋白定量试剂盒测定发酵粗 品中的蛋白含量约为25%;发酵粗品经SDS-PAGE电泳、使用Quantity One软件分析考马斯 亮蓝染色的SDS-PAGE胶，估算得出IL6蛋白约占蛋白总量的0.5%。经Q Sepharose FF离 子交换层析后，收集组分，充分透析冷干，蛋白称重总量为1.8mg，利用SDS-PAGE、Quantity One软件分析，重组IL6占总量的24%。在进行Superdex HR 75 10/300凝胶过滤层析后， 收集组分，超滤脱盐，冷冻干燥，最终获得蛋白产物为0. 3mg，经HPLC分析，重组IL6占总量 的90% (见表1)。表1重组IL6纯化收率
1权利要求
1.一种表达载体，其为环状，且可操作地连接有源于PSGLl的复制子序列其由SEQ ID NO 1中第5086-7372位所示序列的互补序列 构成；大肠杆菌复制起始区ori序列其由SEQ ID NO 1中第2497-3164位所示序列构成； 氨苄青霉素抗性基因bla序列其由SEQ ID NO=I中第3315-4172位所示序列的互补 序列构成；多克隆酶切位点序列其由SEQ ID NO 1中第1452-1481位所示序列构成； 阿普霉素抗性基因aac (3) IV序列其由SEQ ID NO=I中第204-980位所示序列的构成；源于链霉菌接合转移的必需区oriT序列其由SEQ ID NO :1中第8602-8713位所示序 列构成；cagAp和ermE*p串联的强启动子序列其由SEQ ID NO 1中第1581-2057位所示序列 的互补序列构成；和信号肽序列其由SEQ ID NO :1中第1482-第1580位所示序列的互补序列构成或者由 SEQ ID NO :1中第1482-第1580位所示序列中第1572位至第1574位的CTG替换为TTA的 互补序列构成。
2.权利要求1的表达载体，其为环状，且由SEQID NO 1所示序列构成。
3.权利要求1或者2的表达载体，其中还可操作地插入有表达外源蛋白的基因。
4.权利要求3的表达载体，其中的外源蛋白选自细胞因子、肽类生物药物和功能蛋白。
5.权利要求4的表达载体，其中的外源蛋白是白细胞介素6。
6.宿主细胞，其含有权利要求1或2所述的表达载体。
7.权利要求6的宿主细胞，其为链霉菌。
8.权利要求1或2所述的表达载体在链霉菌中表达外源蛋白的用途。
9.权利要求8的用途，其中所述的外源蛋白选自细胞因子、肽类生物药物和功能蛋白， 优选白细胞介素6。
10.权利要求8的用途，其中的表达为分泌型表达。
全文摘要
本发明涉及一种新的链霉菌分泌表达质粒及其应用。具体地，本发明提供的质粒以球孢链霉菌C-1027中天然存在的pSGL1质粒最小复制子为骨架，克隆有大肠杆菌复制起始区ori、链霉菌接合转移的必需区oriT、氨苄青霉素抗性基因bla、阿普霉素抗性基因aac(3)IV、启动子ermE＊p、力达霉素辅基蛋白基因启动子cagAp、力达霉素辅基蛋白基因突变型信号肽SPcagA(CTG)和多克隆位点。该质粒可应用于在链霉菌中高效分泌表达各种异源蛋白。
文档编号C12N1/21GK102002510SQ20101019693
公开日2011年4月6日 申请日期2010年6月10日 优先权日2010年6月10日
发明者余腾斐, 朱元军, 杜郁, 洪斌, 王丽非, 王松梅 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所