专利名称：一种莽草酸生产用基因工程菌株的构建方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体地说涉及一种莽草酸生产用基因工程菌株的构建方法，该菌株可用于发酵生产莽草酸。
背景技术：
莽草酸(Shikimicacid，Shikimate)，化学名[3R-(3 α，4 α，5 β ) ]-3，4，5-三羟基-ι-环己烯-ι-羧酸，是生物体内代谢过程的中间产物，也是合成许多生物碱、芳香氨基酸与吲哚衍生物、手性药物(如抗病毒药)的原料，广泛存在于植物及微生物中。莽草酸通过影响花生四烯酸代谢，抑制血小板聚集，抑制动、静脉血栓及脑血栓的形成，莽草酸不仅具有抗炎、镇痛作用，还可以作为抗病毒和抗癌药物中间体。莽草酸的一些衍生物也具有一定的药物作用。以莽草酸为原料合成的“达菲”是世界卫生组织推荐的防治高致病性禽流感药物， 也是目前唯一证实有效治疗禽流感药物。禽流感暴发以来，世界对“达菲”的需求急剧扩大。 我国政府和企业都在分别加紧进行抗禽流感药物的储备和生产，但因生产“达菲”的主要原料一莽草酸产量的不足，严重限制了 “达菲”的生产。目前，莽草酸的制备方法主要有三种，分别是植物组织提取法、化学合成法和微生物发酵法。莽草酸大量存在于高等植物和微生物中，如八角果含莽草酸8% 13%，是各类已研究植物种类中莽草酸含量最高的，也是工业化生产莽草酸最常用的原料。但由于毒八角果内含有剧毒物质，其挥发油会引起麻痹，提取莽草酸时需要经过严格处理才能够达到环保要求，生产成本较高。虽然从植物中提取莽草酸具有简单方便、技术限制较少等优点，而目前的莽草酸也多是从八角茴香等植物组织中提取而来，但是该方法受原料产量限制，无法大量生产。此外随着八角茴香价格的提高，莽草酸成本也随之上升。化学合成方法因较多使用有机和有毒试剂，不能被大量应用于莽草酸生产。微生物发酵法因较少受到原料来源的限制，容易持续工业化生产，对环境污染较少，成本低廉，逐渐被应用于莽草酸生产。莽草酸循环广泛存在于微生物中，通过微生物发酵也能够提取莽草酸。在大肠杆菌中葡萄糖转化为芳香族氨基酸(L-苯丙氨酸、L-赖氨酸和L-色氨酸)，而莽草酸为中间产物。普通大肠杆菌经过改造后可以积累莽草酸。罗氏公司2005年与德国一家生物技术中心合作，通过向一种无害的大肠杆菌超量补给葡萄糖，迫使细菌释放莽草酸。目前，罗氏公司三分之二的莽草酸取自八角茴香，余下三分之一由发酵法提供。在生物体的自身代谢中，莽草酸难以大量积累。莽草酸作为中间代谢物，一旦合成就被会被用于其它生物分子特别是芳香族分子的合成。因而生物的原生代谢必须被打破才可能积累莽草酸。与莽草酸合成相关的酶有3-脱氧-D-阿拉伯-庚酬-7-磷酸合成 (3-deoxy-7-phosphohep tulonate synthase,简称 DAHP 合成酶，催化 DAHP 的合成)、3_ 脱氢奎尼酸合成酶(3-dehydroq uinate synthase，催化由DAHP到3_脱氢奎尼酸的反应)、 3-脱氢奎尼酸脱水酶(3-dehydroquinate dehydratase，催化3_脱氢奎尼酸脱水生成脱氢莽草酸)、莽草酸脱氢酶(shikimate dehydrogenase，催化脱氢莽草酸向莽草酸的转变，该反应可逆)和莽草酸激酶同工酶(shikimate kinase isozyme，催化莽草酸磷酸化为3_磷酸莽草酸)。它们在大肠杆菌中分别由aroF UroG,aroH),aroB,aroD,aroE,aroK Carol) 编码，其中aroF、aroG和aro//均编码DAHP合成酶UroF受酪氨酸反馈抑制，aroG受苯丙氨酸反馈抑制，aroV受色氨酸反馈抑制)，ar0f和aroZ都编码莽草酸激酶同工酶，它将莽草酸转化为3-磷酸莽草酸(shikimate-3-phosphate)。由于和莽草酸合成相关酶并不足以进行大量积累莽草酸的催化，莽草酸激酶催化莽草酸向其它化合物的转化，因此生产菌株必须进行相关酶的改造以适合莽草酸的大量合成。目前，关于莽草酸的微生物发酵法生产在国内外已有相关报道。Yurgis等通过对枯草芽孢杆菌进行改造以生产莽草酸，该菌株通过失活莽草酸激酶基因UroI)或者5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS，可催化莽草酸-3-磷酸向分支酸的转化)基因，导入莽草酸脱氢酶和DHAP合成酶等基因，可产莽草酸约20g/L。John W. Frost等通过对大肠杆菌进行基因改造以提高莽草酸产量，这些菌株包含和莽草酸合成相关的基因如aro八 aroE、serA、tktA、ppsA和aroD等，使得莽草酸产量达到70g/L左右。John W. Frost对 2-酮-3-脱氧半乳糖酸醛缩酶(KDPGal aldolase)基因进行分子进化获得一种可以催化丙酮酸和E4P合成DAHP，同DAHP合成酶相比，可以为细胞节省大量PEP，进一步提高了莽草酸产量。汪莉将莽草酸合成相关基因aroAaroA和aroi 导入大肠杆菌基因组中，同时敲除莽草酸激酶基因(aroZ和arof)和 儿采用该菌株进行发酵，可产莽草酸8. 3g/L。此外，日本也有采用柠檬酸杆菌进行莽草酸发酵的报道。色氨酸启动子可以高效率地起始转录。色氨酸启动子受到阻遏蛋白TrpR(由trpR 基因编码)的调控，当色氨酸足量时，TrpR同色氨酸结合为活性形式阻遏色氨酸启动子的启动；当色氨酸匮乏时，TrpR无色氨酸结合，为无活性形式，无法阻遏启动子的启动，受色氨酸启动子控制的基因开始转录。由于上述的这种特点，色氨酸启动子被广泛应用于重组蛋白的表达和酶的合成。现有发明大多通过敲除基因来中断莽草酸的代谢，并导入莽草酸合成代谢基因来实现莽草酸的有效积累，此类方法需要从宿主细胞中敲除较多的基因，操作起来相对繁琐。
发明内容
本发明的目的在于提供一种莽草酸生产用基因工程菌株的构建方法，该方法敲除基因少，构建的菌株能够有效中断莽草酸代谢和实现莽草酸的大量积累。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案
一种莽草酸生产用基因工程菌株的构建方法，其包括以下步骤 ①构建arM基因敲除的大肠杆菌菌株；
利用Red系统构建arM基因敲除的大肠杆菌菌株W3110 (AaroA)0本发明方法使用大肠杆菌五cWi菌株W3110，但菌株不仅限于W3110—种。Red系统为新发展的用于基因操作的技术，利用重组技术可以方便地敲除、敲入或突变基因，目前多用于大肠杆菌。彻A 基因编码EPSPS，催化莽草酸-3-磷酸和PEP反应生成5-烯醇丙酮莽草酸_3_磷酸。敲除 arM基因可导致细菌缺失5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶，代谢流中断在莽草酸-3-磷酸，从而利于积累莽草酸和莽草酸-3-磷酸。②构建含有莽草酸代谢途径中的关键酶基因aro(fM (该基因编码的酶不受苯丙氨酸反馈抑制)、aro^\aroS、aro々、议M和的重组表达质粒pAR63，且这些基因均处于色氨酸启动子/^p的转录控制下；
重组表达质粒PAR63是通过依次将基因ppsA、tktA ,aroB.aroD.aroE和aro(fM连接至 pAR质粒而获得的。其中，基因aroG、aroE、aroD、aroB、tktA和ppsA均来源于大肠杆菌，重组表达质粒PAR63的出发质粒为pACYC184。③将重组表达质粒pAR63转入已敲除arW基因的大肠杆菌菌株W3110 (MroA), 获得表达莽草酸的生产菌株。生产菌株可以通过流加葡萄糖方式溶氧控制发酵来制备莽草酸。具体的，步骤①包括
a、通过PCR扩增获得aroA同源替换序列DaroA；
b、将质粒pKD46导入大肠杆菌菌株W3110；
c、诱导步骤b所得阳性菌株产生同源重组所需的酶，收获菌体制备感受态细胞；
d、通过电击转化将步骤a获得的同源替换序列DaroA导入步骤c获得的感受态细胞， 得到arM基因被替换的菌株；
e、使用pCP20质粒消除步骤d所得菌株的抗性基因片段，得到arM基因敲除菌株。具体的，步骤②包括
a、基于质粒pACYC184构建包含ir/77 基因的改造载体pAR，可以表达一定量TrpR，用于阻遏载体上的/^p启动子；
b、构建抗反馈抑制的arof-基因，并在基因前加上色氨酸启动子/^ C、克隆aroB和aroE基因，并为其添加核糖体结合位点RBS ；
d、克隆基因tktA、PPsA和aro々，并在tktA前加上色氨酸启动子/^P，在你M后面加上转录终止子(转录终止子用Ter表示)；
e、将各基因按照Ptrp、aro(fB\aroE、aroB、aroD、Ptrp、tktA、ppsA和转录终止子的顺序连接至PAR质粒，构成pAR63质粒。所述重组表达质粒pAR63中含有色氨酸启动子阻遏蛋白基因trpR,且ir/7/P带有自身启动子，可以自主表达。所述重组表达质粒pAR63中所含的/基因下游序列为转录终止子序列；所述重组表达质粒PAR63中所含的tktA基因上游序列为色氨酸启动子序列；所述重组表达质粒pAR63中所含的aroB和aroE基因上游序列均含有核糖体结合位点(RBS)序列；所述重组表达质粒PAR63中所含的aro々基因带有自身RBS序列；所述重组表达质粒pAR63中所含的aro(fM基因上游序列为色氨酸启动子序列，aroi^是由aroG基因的180位点定点突变为Phe而获得。所述转录终止子序列为rrai 转录终止子序列。本发明敲除细菌中的EPSPS基因，同时构建导入含有色氨酸启动子(Z^p)控制的限速酶基因的载体，减少莽草酸的分解代谢，在适当的生长时期自动开启相关基因表达，增加前体含量，加速合成反应，从而促进原料高效转化为莽草酸。和现有技术相比，本发明方法的创新点如下
(1)通过敲除arM单基因实现中断莽草酸代谢的目的，需要敲除基因少，与双基因 aroZ/f敲除方法相比操作难度减小，且莽草酸代谢流向莽草酸-3-磷酸，降低莽草酸对莽草酸脱氢酶等上游酶的反馈抑制作用，降低莽草酸合成过程中的中间产物含量，提高莽草酸产量。反应最终产物主要为莽草酸和莽草酸-3-磷酸，通过酸化和加热处理即可转变为莽草酸。(2)导入了莽草酸合成相关基因，并处于/^>调控之下，发酵初期，培养基中含有丰富的氨基酸，基因表达处于阻遏状态，有利于菌体积累。由于莽草酸无法进入芳香族氨基酸合成代谢，莽草酸合成菌株为色氨酸缺陷型，无法进行色氨酸的生产，待色氨酸消耗后浓度降低，各基因逐步开始表达，催化莽草酸的大量合成。(3)由于莽草酸无法进入芳香族氨基酸合成代谢，莽草酸合成菌株为色氨酸缺陷型，无法进行色氨酸的生产，基因表达通过/^p调控表达，和莽草酸合成菌的发酵过程中培养基中的色氨酸含量偶联，自然控制基因表达具有时间差异性，简化了生产工艺中的操作。(4)基因的表达处于自动开关状态，在中后期自动启动，无需诱导物的诱导，减少了向培养基中添加有毒物质的可能性。
图1为aroA同源替换序列DaroA PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果和aroA敲除菌株W3110 CAaroA)的PCR鉴定结果；其中DaroA长度为15%bp，W3110菌株PCR片段应为 1626bp，W3110 Oa/ZAarW)菌株PCR片段应为1838bp，卡那霉素抗性基因消除后的菌株 W3110 (AarW)PCR片段应为44^p。结果显示DaroA长度正常且arW已经被敲除，抗性基因片段也已经消除。图中泳道M :lkb Marker ；泳道1 :DaroA ；泳道2 菌株W3110 ；泳道3 菌株 W3110 (Aanjf AaroA)；泳道 4-5 菌株 W3110 (AaroA)；
图2为pAR质粒构建过程中PCR产物和质粒酶切鉴定结果；其中泳道M Marker ； 泳道1 序列PCR产物；泳道2 :pACYC184质粒PCR产物；泳道3 质粒pAR饱Hin dill 单酶切图谱；泳道4 质粒pAR的Hin dill和/ ^ I双酶切图谱；
图3为质粒pAROl构建过程中PCR产物和酶切鉴定结果；图中泳道M Marker ；泳道1 基因PCR产物；泳道2 终止子序列PCR产物；泳道3 ,ppsA与终止子序列连接PCR 产物；泳道4 质粒pAROl饱Bam HI单酶切结果；泳道5 质粒pAROl饱Bam HI和I双酶切结果；
图4为质粒pAR03构建过程中PCR产物和质粒pAR03酶切鉴定结果；图中泳道Ml :100 bp Marker ；泳道 M2 :lkb Marker ；泳道 1 -.Ptrp 序列 PCR 产物；泳道 2 -.tktA 基因 PCR 产物； 泳道3 -.Ptrp与tktA基因连接PCR产物；泳道4 质粒pAR03饱Bam HI单酶切结果；泳道5 质粒pAR03饱Bam HI和/ OMI双酶切结果；
图5为质粒pAR17构建过程中PCR产物和质粒pAR17酶切鉴定结果；图中泳道M Marker ；泳道1 ..aroB基因PCR产物；泳道2 -.aroD基因PCR产物；泳道3 ..aroB与aroD基因 PCR产物；泳道4 质粒pAR17饱Bam HI单酶切结果；泳道5 质粒pAR17饱Bam HI和fe^· I双酶切结果；
图6为质粒pAR31构建过程中PCR产物和质粒pAR31酶切鉴定结果；图中泳道M Marker ；泳道1 -.aroE基因PCR产物；泳道2 添加RBS序列的aroE基因PCR产物；泳道3 质粒pAR31饱Bam HI单酶切结果；泳道4 质粒pAR31饱Bam HI和Sac I双酶切结果；
图7为质粒pAR63构建过程中PCR产物和质粒pAR63酶切鉴定结果；图中泳道Ml IOObp Marker ；泳道1 -.Ptrp序列PCR产物；泳道2 -.aroG (前半部分)PCR产物；泳道3 -.aroG(后半部分)PCR产物；泳道4 -.Ptrp-aroG (前半部分)PCR产物；泳道5 -.Ptr~aro(fBR PCR产物； 泳道6 :pAR63饱Bam HI单酶切产物；泳道7 :pAR63饱Bam HI和Sph I双酶切产物；泳道 M2 :lkb Marker ；
图8为重组质粒pAR63的构建和结构示意图9为实施例1中发酵法生产莽草酸的发酵过程中菌体浓度和莽草酸含量随发酵时间的变化。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明进行详细说明，但本发明的保护范围不限于此。实施例所用LB液体培养基组成为1%胰蛋白胨、1%氯化钠和0. 5%酵母提取物；LB固体培养基组成为1%胰蛋白胨、1%氯化钠、0. 5%酵母提取物和1. 5%琼脂。实施例中所提到的制备或转化等过程，如无特殊说明，则采用本领域的常规方法均可实现，故不再赘述。实施例1
一种莽草酸生产用基因工程菌株的构建方法，其包括以下步骤 一、构建arW基因敲除的大肠杆菌菌株W3110 (AaroA )；
Red重组技术的原理是将两段含有目的基因同源序列的DNA片段导入宿主细菌，在重组酶的作用下，目的基因片段被其它片段替换从而完成目的基因的敲除工作。) a、通过PCR扩增获得aroA同源替换序列DaroA ；
以质粒PKD4 (由中国科学院上海生命科学研究院提供)为模板，利用引物aroAF (见序列表中序列1)和aroAR (见序列表中序列2)，PCR扩增质粒pKD4中的h/Z基因。同源重组引物的5’端为目的基因两侧同源序列，3’端为抗性基因两侧序列，引物序列如下
AF 5' -atggaatccctgacgttacaacccatcgctcgtgtcgatggcactattaagtgtaggctggagctgc ttc-3，
AR 5' -tcaggctgcctggctaatccgcgccagctgctcgaaataatccggaaatgatgggaattagccatgg tcc-3，
PCR扩增条件为94°C预变性5min ；94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸2min，共循环30次。PCR结束后获得长度为1596bp的DNA片段，琼脂糖凝胶电泳回收该片段即为 DaroA，见图1。所得PCR片段两侧为arM基因同源片段，中间部分为卡那抗性基因。PCR 片段进行琼脂糖凝胶电泳纯化后备用。) b、将质粒pKD46导入大肠杆菌菌株W3110 ；
参照分子克隆实验指南第三版，制备W3110的化学感受态细胞，并以质粒pKD46 (由中国科学院上海生命科学研究院提供)转化W3110菌株感受态细胞，30°C培养池后涂布于含 100 yg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基平板上，30°C过夜培养，能够生长的转化子即为含有PKD46质粒的大肠杆菌W3110菌株，挑选阳性转化子保存备用。) C、诱导步骤b所得阳性菌株产生同源重组所需的酶，收获菌体制备感受态细胞； 将步骤b获得的阳性菌株接种于5mL氨苄抗性LB液体培养基(含100 μ g/mL Amp)中
于3(TC、200r/min过夜培养，次日接种ImL至IOOmL氨苄抗性LB液体培养基(含IOOyg/ mL Amp)中，30°C、200r/min培养至菌体浓度OD6tltl=O. 25时，加入L-阿拉伯糖至终浓度为 30mmol/L，诱导至OD6tltl=O. 6，参照分子克隆实验指南第三版，收获细胞制备电击转化感受态细胞。) d、通过电击转化将步骤a获得的同源替换序列DaroA导入步骤c获得的感受态细胞，得到arM基因被替换的菌株；
取5 μ L步骤a所得的PCR产物DaroA加至50 μ L步骤c制得的感受态细胞中，冰上放置5分钟后转入2mm的电击杯中，进行电击(电击条件为200 Ω，25 μ F，电压2. 5kV，电击时间4-5ms)。电击后加入950 μ L LB液体培养基中，150r/min，37°C培养浊，12000 X g离心 lmin，弃去上层800 μ L上清液，剩余细胞轻轻重悬后涂于卡那抗性LB固体培养基平板(含 10 yg/mL卡那霉素)上37°C过夜培养。能够生长的转化子即为敲除arW基因的菌株，挑选阳性转化子保存备用，记为W3110 ikarf AarW)菌株。) e、使用pCP20质粒消除步骤d所得菌株的抗性基因片段，得到arM基因敲除菌株。将质粒pCP20 (由中国科学院上海生命科学研究院提供)转入上述步骤d获得的阳性克隆中，30°C培养，挑出同时具有卡那抗性和氨苄抗性的克隆，接种于LB液体培养基中， 300C，200r/min培养8h，然后将温度提高到42°C，此时FLP重组酶(F1 ipase recombination enzyme，翻转酶重组酶)开始表达，催化FRT (Flp recombination target，翻转酶重组位点) 位点之间抗性基因片段的消除，质粒PCP20由于停止复制而逐渐丢失。将菌液稀释后涂布于LB固体培养基平板，挑选单菌落接种于卡那抗性LB固体培养基平板(含10 μ g/mL卡那霉素)上，无法生长的菌落为抗性基因消除的菌株。arM基因敲除菌株以W3110 (AaroA) 表不。所得菌株(包括W3110 OazZzlarf^ )和W3110 (ZlaroJ ))分别以DF (见序列表中序列3)和DR (见序列表中序列4)为引物进行PCR鉴定，W3110菌株为对照。引物序列如下 DF :5，-tcatggttgagttcgaacgccgtc-3，；DR :5，-gtgggtattttgacaccctgtcag-3，；
PCR扩增条件为95°C预变性5min ；94°C变性30s，50°C退火30s，72°C延伸2min，共循环30次。以不同菌株为模板所获得的DNA片段长度是不同的，由此可判断是否从基因组中敲除arW基因，结果见图1，因此判定最后获得的菌株即为五coli W3110 (zlarW)，保存二、构建含有莽草酸代谢途径中的关键酶基因arof-(该基因不受苯丙氨酸反馈抑制)^^^^^^^、^^々、^“和的重组表达质粒pAR63，其构建和结构示意图见图8 ；
2. 1 pAR质粒的构建
以trpRF (序列表中序列5)和trpRR (序列表中序列6)为引物，菌株W3110基因组为模板进行PCR扩增ir/7/P完整序列，凝胶回收后备用，引物序列如下 trpRF 5' -gcgctgcaggtcggatccacgtcgttactgatccgcac-3'； trpRR :5，-gggaagcttccacgtcttatcaggcctac-3，；
PCR扩增条件为94°C预变性^iin ；94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，共循环 30次。PCR结束后获得长度为480bp的DNA片段，结果见图2。以pAF (序列表中序列7)和pAR (序列表中序列8)为引物，质粒pACYC184 (由中国科学院上海生命科学研究院提供)为模板进行PCR扩增质粒片段，凝胶回收后备用。引物序列如下
ρAF 5' -gcgctgcagggcctcaggcatttgagaag-3'；
8pAR 5' -ttaaagcttatcgatgataagctgtc-3‘；
PCR扩增条件为94°C预变性^iin ；94°C变性30s，52°C退火30s，72°C延伸aninl5s，共循环30次。PCR结束后获得长度为2197bp的DNA片段，结果见图2。将上述两种DNA片段分别用历dill和I双酶切后进行凝胶回收，然后使用 T4 DNA连接酶连接两片段。连接产物转化ToplO感受态细胞(购自南京赛泓瑞生物科技有限公司)，在含20 μ g/mL氯霉素的LB固体培养基平板上筛选阳性菌株，所得质粒即为pAR 质粒。所得pAR质粒采用单酶切(Mn dill)和双酶切(Mn dill和Ai I)鉴定，琼脂糖凝胶电泳图见图2。将ppsA基因导入pAR质粒
采用ppsAF (见序列表序列9)和ppsAR (见序列表序列10)为引物，菌株W3110基因组为模板进行PCR扩增得到片段1，回收备用。引物序列如下
ppsAF 5' -catggatccctcgggcccatgtgtttctcaaaccgttc-3'； ppsAR 5' -gccgccaggcaaattctgtttttatttcttcagttcagcc-3'； PCR扩增条件为94°C预变性^iin ；94°C变性30s，62°C退火30s，72°C延伸anin30s，共循环30次。PCR结束后获得长度为M60bp的DNA片段，结果见图3。采用TerF (见序列表序列11)和TerR (见序列表序列12)为引物，W3110基因组为模板进行PCR扩增得到片段2，回收备用。引物序列如下
TerF 5' -ggctgaactgaagaaataaaaacagaatttgcctggcggc-3'； TerR 5' -gcgctgcagaagagtttgtagaaacgcaaaaaggccatc-3'；
PCR扩增条件为94°C预变性^iin ；94°C变性30s，62°C退火30s，72°C延伸40s，共循环 30次。PCR结束后获得长度为382bp的DNA片段，结果见图3。在20 μ L PCR反应体系(反应体系含有0. 5U Taq DNA聚合酶，1 X Taq DNA聚合酶缓冲液，lmmol dNTPs)中，不加入引物，加入上述得到的片段1和片段2各2μ L，进行10次循环反应。然后加入引物PPsAF和TerR至浓度为0. 5 μ mol，进行30次循环反应，得到DNA 片段3，回收备用。PCR 扩增条件为94°C预变性 ^iin ；94°C变性 30s，62°C退火 45s，72°C延伸 3min， 共循环10次；94°C变性30s，62°C退火30s，72°C延伸3min，共循环30次。PCR结束后获得长度为^03bp的DNA片段，结果见图3。用3m HI和Ai I双酶切质粒pAR和DNA片段3，然后用T4 DNA连接酶连接两片段，转化ToplO感受态细胞，筛选到阳性克隆，所得质粒为pAROl。所得质粒pAROl分别进行单酶切(Mam HI)和双酶切鉴定(Mm HI和Pst I),鉴定结果见图3。将tktA基因导入pAROl质粒
采用PtrpF (见序列表序列13)和PtrpR (见序列表序列14)为引物，菌株W3110基因组为模板进行PCR扩增得到片段1，回收备用。引物序列如下 PtrpF :5，-catggatccctccggccgcggttctggcaaatattc-3，； PtrpR -gcaagctctttacgtgaggacattgtcgataccctttttacg-S'； PCR扩增条件为94°C预变性^iin ；94°C变性30s，61°C退火30s，72°C延伸30s，共循环30次。PCR结束后获得长度为132bp的DNA片段，结果见图4。采用tktAF (见序列表序列15)和tktAR (见序列表序列16)为引物，W3110基因组为模板进行PCR扩增得到片段2，回收备用。引物序列如下
tktAF 5' -cgtaaaaagggtatcgacaatgtcctcacgtaaagagcttgc-3'； tktAR 5' -ctcgggcccttacagcagttcttttgctttcgcaac-3'；
PCR扩增条件为94°C预变性^iin ；94°C变性30s，61°C退火30s，72°C延伸2min，共循环30次。PCR结束后获得长度为2019bp的DNA片段，结果见图4。在20 μ L PCR反应体系(反应体系含有0. 5U Taq DNA聚合酶，1 X Taq DNA聚合酶缓冲液，lmmol dNTPs)中，不加入引物，加入上述两种片段1和片段2各2μ L，进行10次循环反应。然后加入引物PtrpF和tktAR，进行30次循环反应，得到DNA片段3，回收备用。PCR 扩增条件为94°C预变性 ^iin ；94°C变性 30s，62°C退火 30s，72°C延伸 2min， 共循环10次；94°C变性308，611退火308，721延伸anin30s，共循环30次。PCR结束后获得长度为2110bp的DNA片段，结果见图4。以Bam HI和/ OMI双酶切质粒pAROl和DNA片段3，然后用T4 DNA连接酶连接两片段，连接产物转化ToplO感受态细胞，筛选到阳性克隆，所得质粒为pAR03。所得pAR03质粒分别采用单酶切(Mm HI)和双酶切(Main HI和Psp OMI)进行鉴定，结果见图4。将aroB和aroD基因导入pAR03质粒
以aroBF (见序列表序列17)和aroBR (见序列表序列18)为引物，W3110基因组为模板进行PCR，得到片段1，凝胶回收后备用。引物序列如下 aroBF :5，-gcgccatggagaggattgtcgttact-3，； aroBR :5，-tgcgctagcttgttgttacgctgattgac-3，；
PCR扩增条件为94°C预变性^iin ；94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸lminl5s，共循环30次。PCR结束后获得长度为IlOSbp的DNA片段，结果见图5。以Afco I^WNhe I分别酶切片段1和pED8a+质粒(购自Novagen公司)，以T4 DNA 连接酶连接两片段，得到质粒pET28a-ari^。以aroDF (见序列表序列19)和aroDR (见序列表序列20)为引物，W3110基因组为模板进行PCR，得到片段2，凝胶回收后备用。引物序列如下
aroDF :5，-cgggctagcgtaacagggtgatcatgag-3，； aroDR :5，-catcggccgcctgatgcttcgtatttacg-3，；
PCR扩增条件为94°C预变性^iin ；94°C变性30s，退火30s，72°C延伸lmin30s，共循环30次。PCR结束后获得长度为1260bp的DNA片段，结果见图5。以Nhe I和Eag I分别酶切片段2和质粒pEI^8a_aroB，用T4 DNA连接酶连接两片段，得到质粒pET28a-aroB-aroD。以aroBFL (见序列表序列21)和aroDR (见序列表序列20)为弓丨物， PET28a-aroB-aroD为模板进行PCR，得到片段3，凝胶回收备用。引物序列如下
aroBFL -Ctgggatcccatgagctcttaactttaagaaggag-S'； aroDR -catcggccgcctgatgcttcgtatttacg-S'；
PCR扩增条件为94°C预变性^iin ；94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸anin30s，共
10循环30次。PCR结束后获得长度为M06bp的DNA片段，结果见图5。以Bam HI和Eag I分别酶切片段3和质粒pAR03，以"Γ4 DNA连接酶连接两片段， 得到质粒质粒PAR17。所得质粒分别采用单酶切(Meim HI)和双酶切(Mm HI和Eeig I)进行鉴定，结果见图5。将aroE基因导入pAR17质粒
以aroEF (见序列表序列22)和aroER (见序列表序列23)为引物，W3110基因组为模板，进行PCR得到片段1，凝胶回收备用。引物序列如下 aroEF :5，-ctggccatggaaacctatgctg-3，； aroER :5，-cgcgagctcacgcggacaattcctc-3，；
PCR扩增条件为94°C预变性^iin ；94°C变性30s，49°C退火30s，72°C延伸lmin，共循环30次。PCR结束后获得长度为831bp的DNA片段，结果见图6。以Afco I和I分别酶切片段1和pEI^8a+质粒，以"Γ4 DNA连接酶连接两片段， 得到质粒pET28a-arof。WaroEFL (见序列表序列Μ)和aroERR (见序列表序列25)为引物，pET28a_aro万为模板进行PCR，得到片段2，凝胶回收备用。引物序列如下
aroEFL 5' -ctgggatcccatgcatgcttaactttaagaaggag-3'； aroERR :5，-acggagctcacgcggacaattcctcctgcaattgc-3，；
PCR扩增条件为94°C预变性^iin ；94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸lmin，共循环30次。PCR结束后获得长度为867bp的DNA片段，结果见图6。以Bam HI和Sac I分别酶切片段2和质粒pAR17，以"Γ4 DNA连接酶连接两片段， 得到质粒PAR31。 所得质粒pAR31分别采用单酶切(Mam HI)和双酶切(Mm HI和Sac I)进行鉴定， 结果见图6。构建aro(fM基因并导入pAR31质粒
以PtrpFl (见序列表序列26)和PtrpRl (见序列表序列27)为引物，W3110基因组为模板，进行PCR得到片段1，凝胶回收备用。引物序列如下
PtrpFl 5' -catggatcccggttctggcaaatattctgaaatgag-3'； PtrpRl 5' -cgtcgttctgataattcattgtcgataccctttttac-3'；
PCR扩增条件为94°C预变性^iin ；94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，共循环 30次。PCR结束后获得长度为119bp的DNA片段，结果见图7。以aroGLF (见序列表序列28)和aroGLR (见序列表序列29)为引物，W3110基因组为模板，进行PCR得到片段2，凝胶回收备用。引物序列如下
aroGLF 5' -gtaaaaagggtatcgacaatgaattatcagaacgacg-3'； aroGLR :5，-atttttgaagccgaccggacaaaaaagccctgatgccagttcg-3，； PCR扩增条件为94°C预变性^iin ；94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸lmin，共循环30次。PCR结束后获得长度为581bp的DNA片段，结果见图7。以aroGRF (见序列表序列30)和aroGRR (见序列表序列31)为引物，W3110基因组为模板，进行PCR得到片段3，凝胶回收备用。引物序列如下aroGRF 5' -cgaactggcatcagggcttttttgtccggtcggcttcaaaaat-3'； aroGRR :5，-cgcgcatgcttacccgcgacgcgcttttactgcat-3，；
PCR扩增条件为94°C预变性^iin ；94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸lmin，共循环30次。PCR结束后获得长度为的DNA片段，结果见图7。在20 μ L PCR反应体系(反应体系含有0. 5U Taq DNA聚合酶，1 X Taq DNA聚合酶缓冲液，lmmol dNTPs)中，不加入引物，加入上述片段1和片段2各2μ L，进行10次循环反应。然后加入引物PtrpFl和aroGLR至终浓度为0. 5 μ mol，进行30次循环反应，得到DNA 片段4，回收备用。PCR 扩增条件为94°C预变性 ^iin ；94°C变性 30s，63°C退火 30s，72°C延伸 lmin， 共循环10次；94°c变性30s，6(TC退火30s，72°C延伸lmin，共循环30次。PCR结束后获得长度为661bp的DNA片段，结果见图7。在20 μ L PCR反应体系(反应体系含有0. 5U Taq DNA聚合酶，1 X Taq DNA聚合酶缓冲液，lmmol dNTPs)中，不加入引物，加入上述片段3和片段4各2 μ L，进行10次循环反应。然后加入引物PtrpFl和aroGRR至终浓度为0. 5 μ mol，进行30次循环反应，得到DNA 片段5，回收备用。PCR 扩增条件为94°C预变性 ^iin ；94°C变性 30s，64°C退火 30s，72°C延伸 lmin， 共循环10次；94°c变性30s，60°C退火30s，72°C延伸90s，共循环30次。PCR结束后获得长度为1162bp的DNA片段，结果见图7。用Bern HI和Sph I分别酶切片段5和质粒pAR31，用T4 DNA连接酶连接两片段， 得到质粒PAR63。质粒pAR63即为最终构建成功的载体。所得质粒pAR63分别采用单酶切(Mam HI)和双酶切(Mm HI和Sph I)鉴定，结果见图7。三、将重组表达质粒pAR63转入已敲除arW基因的大肠杆菌菌株W3110(AarW)， 获得表达莽草酸的生产菌株。生产菌株可以通过流加葡萄糖方式溶氧控制发酵来制备莽草酸。(1)构建目的工程菌株
参考分子克隆实验指南第三版化学法制备大肠杆菌感受态和转化外源基因的方法将质粒pAR63转入菌株￡. coli W3110 (AaroA )，得到目的工程菌株￡. coli W3110 (AaroA ) pAR63。(2)发酵法生产莽草酸
将构建成功的目的工程菌株五coli W3110 (A3rW)pAR63进行斜面活化，接种于LB 液体培养基中，370C，220r/min培养至OD6tltl ^ 2时，接种于5L发酵罐中，发酵罐装料2. 4L。 发酵培养基组成为葡萄糖15g，酵母提取物lg，K2HPO4 8g，一水柠檬酸2. 5g, L-Phe 0. 7g， L-Tyr 0. 7g, L-Trp 0. 7g, MgSO4 0. 24g, H3BO3 0. 0247g, ZnSO4 · 7H20 0. 0029g, CuSO4 · 5H20 0. 0025g，MnCl ·4Η20 0. 0158g，对羟基苯甲酸0. 010g，对氨基苯甲酸0. 010g，2，3-二羟基苯甲酸0.010g。发酵温度37°C，初始搅拌转速50r/min，初始通气量1:0. 1 (即发酵液体积 每分钟通入的无菌空气量=10)。开始先通过控制转速将溶氧控制在30%，当转速达到最高 800r/min时，通过调整通气量控制溶氧在20%，当通气量达到1 1时，通过流加60%葡萄糖控制溶氧在10%-15%。
发酵过程中每隔池取样，检测发酵液中的莽草酸含量和菌体浓度。莽草酸含量检测方法将发酵液用硫酸调至PH值为2. 0后于80°C加热20min，然后按照分光光度法检测莽草酸含量，具体为取少量前述处理过的发酵液离心，将离心所得上清液适当稀释后，取 ImL稀释过的上清液，加入ImL含0. 5%高碘酸和0. 5%偏高碘酸钠的水溶液，于37°C反应 30min后，加入2mL含3g/L亚硫酸钠和0. 6mol/L氢氧化钠的水溶液终止反应，在Ih内读取反应液在382nm处的吸光值。同时利用莽草酸标准品制作标准曲线，对照标准曲线即可得到吸光值所对应的莽草酸含量。菌体浓度采用比浊法在600nm波长处测定吸光值来检测。发酵5 时，发酵液中莽草酸含量达到43g/L。发酵过程中菌体浓度和莽草酸含量随发酵时间的变化见图9。实施例2发酵法生产莽草酸
将构建成功的目的工程菌株五coli W3110 (A3rW)pAR63进行斜面活化，接种于LB 培养基中，37°C，220r/min培养至OD600 ^ 2时，接种于5L发酵罐中，发酵罐装料2. 4L，发酵培养基为葡萄糖15g，酵母提取物lg, K2HPO4 8g，一水柠檬酸2. 5g，L-Phe 0. 7g，L-Tyr 0. 7g, L-Trp 0. 7g,MgSO4 0. 24g,H3BO3 0. 0247g，ZnSO4 ·7Η20 0. 0029g，CuSO4 ·5Η20 0. 0025g, MnCl · 4H20 0. 0158g，对羟基苯甲酸 0. 010g，对氨基苯甲酸0. 010g，2，3-二羟基苯甲酸 0.010go发酵温度37°C，初始搅拌转速50r/min，初始通气量1:0. 1。开始通过控制转速将溶氧控制在30%，当转速达到最高800r/min时，通过调整通气量控制溶氧在20%，当通气量达到1:1时，通过流加60%葡萄糖控制同样在10%-15%。每隔池取样检测莽草酸含量和菌体浓度(检测方法同上)。发酵60h时，发酵液中莽草酸含量达到Mg/L。实施例3发酵法生产莽草酸
将构建成功的目的工程菌株五coli W3110 (A3rW)pAR63进行斜面活化，接种于LB 培养基中，37°C，220r/min培养至OD600 ^ 2时，接种于5L发酵罐中，发酵罐装料2. 4L，发酵培养基为葡萄糖15g，酵母提取物lg, K2HPO4 8g，一水柠檬酸2. 5g，L-Phe 0. 7g，L-Tyr 0. 7g, L-Trp 0. 7g,MgSO4 0. 24g,H3BO3 0. 0247g，ZnSO4 ·7Η20 0. 0029g，CuSO4 ·5Η20 0. 0025g, MnCl · 4H20 0. 0158g，对羟基苯甲酸 0. 010g，对氨基苯甲酸0. 010g，2，3-二羟基苯甲酸 0.010go发酵温度37°C，初始搅拌转速50r/min，初始通气量1:0. 1。开始通过控制转速将溶氧控制在30%，当转速达到最高800r/min时，通过调整通气量控制溶氧在20%，当通气量达到1:1时，通过流加60%葡萄糖控制同样在10%-15%。每隔池取样检测莽草酸含量和菌体浓度(检测方法同上)。发酵4 时，发酵液中莽草酸含量达到36g/L。
权利要求
1.一种莽草酸生产用基因工程菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤 ①构建arM基因敲除的大肠杆菌菌株；②构建含有莽草酸代谢途径中的关键酶基因aro(fB\ aroE、aroB、aroD、tktA和的重组表达质粒pAR63 ；③将重组表达质粒pAR63 转入已敲除arM基因的大肠杆菌菌株，获得表达莽草酸的生产菌株。
2.如权利要求1所述莽草酸生产用基因工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤①包括a、通过PCR扩增获得aroA同源替换序列DaroA ；b、将质粒pKD46导入大肠杆菌菌株W3110；c、诱导步骤b所得阳性菌株产生同源重组所需的酶，收获菌体制备感受态细胞；d、通过电击转化将步骤a获得的同源替换序列DaroA导入步骤c获得的感受态细胞， 得到arM基因被替换的菌株；e、使用pCP20质粒消除步骤d所得菌株的抗性基因片段，得到arM基因敲除菌株。
3.如权利要求1所述莽草酸生产用基因工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤②包括a、基于质粒pACYC184构建包含ir/77 基因的改造载体pAR；b、构建抗反馈抑制的arof-基因，并在基因前加上色氨酸启动子/^ C、克隆aroB和aroE基因，并为其添加核糖体结合位点RBS ；d、克隆基因tktA、PPsA和aro々，并在tktA前加上色氨酸启动子/^P，在你M后面加上转录终止子；e、将各基因按照Ptrp、aro(fB\aroE、aroB、aroD、Ptrp、tktA、ppsA和转录终止子的顺序连接至PAR质粒，构成pAR63质粒。
4.如权利要求3所述莽草酸生产用基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述重组表达质粒PAR63中含有色氨酸启动子阻遏蛋白基因ir/77 ，且ir/7/P带有自身启动子。
5.如权利要求3所述莽草酸生产用基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述重组表达质粒PAR63中所含的/基因下游序列为转录终止子序列；所述重组表达质粒PAR63 中所含的tktA基因上游序列为色氨酸启动子序列；所述重组表达质粒pAR63中所含的 aroB和aroE基因上游序列均含有RBS序列；所述重组表达质粒pAR63中所含的aroD基因带有自身RBS序列；所述重组表达质粒pAR63中所含的aroi1^基因上游序列为色氨酸启动子序列，aroi/^是由aroG基因的180位点定点突变为Phe而获得。
6.如权利要求5所述莽草酸生产用基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述转录终止子序列为rraS转录终止子序列。
全文摘要
本发明公开了一种莽草酸生产用基因工程菌株的构建方法，其包括以下步骤①构建aroA基因敲除的大肠杆菌菌株；②构建含有莽草酸代谢途径中的关键酶基因aroGFBR、aroE、aroB、aroD、tktA和ppsA的重组表达质粒pAR63，且这些基因均处于色氨酸启动子Ptrp的转录控制下；③将重组表达质粒pAR63转入已敲除aroA基因的大肠杆菌菌株，获得表达莽草酸的生产菌株。本发明方法通过敲除aroA单基因实现中断莽草酸代谢的目的，敲除基因少，操作难度小，基因的表达处于自动开关状态，在中后期自动启动，无需诱导物的诱导，减少了向培养基中添加有毒物质的可能性，莽草酸产量高。
文档编号C12N15/70GK102304539SQ20111024867
公开日2012年1月4日 申请日期2011年8月26日 优先权日2011年8月26日
发明者乔娟平, 任存邦, 叶晓冲, 孟军虎, 张蕴才, 李晓霞, 武广君, 王娜, 王春阳, 石玲珑, 董建辉 申请人:河南孟成生物药业股份有限公司