专利名称：鲫肝细胞原代培养方法
技术领域：
本发明涉及一种新的鲫肝细胞原代培养方法，属于细胞生物学及生物技术学领域。
背景技术：
肝脏是机体的主要解毒器官，是许多毒物损伤的靶器官，同时也是体内化学物代谢的重要器官。体内复杂多变的环境对在体研究化学物引起肝脏损伤带来一定的难度，原代培养细胞离体时间短，生物性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反应体内状态，利用原代培养细胞生理生化及遗传特性稳定性，研究化学物的毒性及肝细胞对毒物的应答及解毒机制。鱼类是生活在水体中的脊椎动物，是用来检测水体污染物良好的生物指示体。原代培养的肝细胞较好地保留及维持了肝细胞的完整性和代谢活性，可真实地反应体内代谢情况。同时，肝细胞是外源化学物转化及代谢的重要场所，也是外源物质造成化学和生物损伤的主要作用靶点。因此体外肝细胞在研究化学物生物转化和毒性作用机制方面有着许多优势，是研究体外毒性的理想模型。鱼类培养的细胞作为实验对象，有着活体鱼无法比拟的优点(1)实验材料成本低，细胞的维护不需要大量的换水、充气和养殖设备；(2)重复性好，实验条件可以精确控制，对细胞进行深入研究，无论在理论研究方面，还是在实际应用方面，都有着深远意义。鲫是我国重要的食用鱼，在我国水产市场占有重要地位，以鲫鱼作为实验对象，不论从市场经济上和科学研究都有强大的推动作用。肝实质由大量肝细胞为主组成，含间质少，肝细胞具有多种功能，代谢旺盛，在体外所需条件高。《中国比较医学杂志》，2006年14卷3期，在剑尾鱼肝组织块培养方法中，对组织块消毒采用的是70%乙醇浸泡30s，实验提及浸泡时间应严格控制在30S内，过长的时间会影响组织活性，降低细胞贴壁能力和存活率。相对于乙醇，洗必泰更适合用于组织块的消毒。目前虽然有一些分离和鉴定肝细胞的方法，然而分离的肝细胞纯度比较低，活性相对较低。本实验对已有的细胞培养方法进行改良、借鉴，欲通过建立较高纯度的肝细胞培养方法，为研究环境污染对鲫肝细胞的毒害及致毒机制提供良好的实验模型。我们在模型建立中发现，从组织分离到细胞获取，中间有3个关键因素1.无菌培养；2.消化过程； 3.细胞生长的贴壁程度，这三个因素会决定细胞的生长状态，影响着后续试验的开展。
发明内容
本发明的目的是为了在鲫肝细胞原代培养方法中得到纯度和活性相对较高的肝细胞。在对已有的细胞培养方法进行改良、借鉴的基础上，本发明提供了一种鲫肝细胞原代培养方法，它包括以下工艺步骤
a、从健康的鲫中分离肝组织首先剪断其鳃部脉弓，放血处死，用酒精擦拭鲫体表进行消毒，在超净工作台内解剖鲫，并取出肝组织，将分离的肝组织浸泡于葡萄糖洗必泰中IOmin ；
b、采用分步消化法对剪碎的肝组织进行消化获得细胞团
将浸泡过葡萄糖洗必泰的组织用D-hank’S漂洗2次，剪碎成2_3mm3的组织块；为了提高消化效果采用分步消化法消化组织
将剪碎的组织倒入离心管，置入28°C的水浴锅内；首先加入组织量4-5倍体积的胰蛋白酶和EDTA消化，期间不停摇勻，15min消化完毕后，离心弃上清。加入3ml的D-hank’ s 同底部沉淀混勻后离心弃上清，将残留的胰蛋白酶和EDTA去除，终止消化；
向所得沉淀组织中加3-4倍体积的II型胶原蛋白酶和CaCl2置入28°C水浴锅，期间不停摇勻，每隔IOmin后取出3/4的上清液移入另一个离心管；在烧杯中添加新的II型胶原蛋白酶和CaCl2继续消化组织块；
30min消化完毕后，将收集的上清液细胞悬液通过200目孔径不锈钢滤网，滤掉组织块；离心弃上清，加入3ml的无血清培养基同底部沉淀混勻后离心弃上清，将残留的II型胶原蛋白酶和CaCl2去除，终止消化；
c.对获得的细胞团进行纯化和培养
①使用红细胞裂解液去除血细胞向离心管中加IOmlD-hank’ s，将沉淀细胞团用移液器吹打分散成单个细胞悬液，同时加Iml的红细胞裂解液，轻轻吹打混勻，上下颠倒6-8次， 静置5min;离心倒弃红色部分，留下管底白色细胞团；加D-hank’S同白色细胞团混勻，吹打并离心，溶解于3ml的D-hank’ s配成肝细胞悬液；
②加Percoll试剂对分离的肝细胞纯化取肝细胞悬液悬浮于2.5倍体积的Percoll 分离液II上，离心弃上清；取沉淀细胞团用5ml的D-hank’ s重悬，枪头吹打混勻；1500rpm， 5min离心，弃上清，得到纯化过后的肝细胞；
其中，所述的 D-hank，s 溶液为将 8g NaCl,0. 4g KCl、0. 13g Na2HPO4 · 12Η20、0· 06g ΚΗ2Ρ04、0. 35g NaHCO3定容于IL纯水中，高温高压灭菌，待温度下降后于4°C保存；
其中所述的用Percoll分离液II配制为先用Percoll试剂原液和lOXD-hank’ s以 9:1的比例配置分离液I，用配置成的分离液I和lXD-hank’ s按2:3的体积比配置成所需的分离液II ；③将纯化后的肝细胞用培养基再悬浮，其中所述的培养基为DMEM/F12培养基中加入20%新生牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml的链霉素以及20ug/ml促肝细胞生长因子。其中步骤a中所述的葡萄糖洗必泰的浓度优选为0. 1%。其中步骤b中所述的胰蛋白酶浓度优选为0. 25% ；EDTA的工作浓度优选为0. 02% ； 胰蛋白酶和EDTA的体积比优选为1:1。其中步骤b中所述的II型胶原蛋白酶的浓度优选为0. 1%，CaCl2的浓度优选是 3mmol/L0其中步骤c中所述的所述的培养方法的培养温度为28°C。其中步骤c中所述的培养方法的培养基PH值为7-8。其中步骤b中所述的所述消化过程中离心速度为lOOOrmp，5min。其中步骤c中所述的红细胞裂解液离心过程中离心转速为1500rpm，5min。其中步骤c中所述的步骤c中的血清优选用新生牛血清；所述的用培养基为先用DMEM/F12培养基加入20%的新生牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml的链霉素以及20ug/ ml促肝细胞生长因子，8小时后换成DMEM/F12培养基加入10%的新生牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml的链霉素以及20ug/ml促肝细胞生长因子。其中，a步骤中选取组织时选择靠近胆附近的肝组织，该处的肝组织较大，容易和胰脏分开，避免其他细胞的混淆。具体的解剖步骤是用镊子翻开看到绿色的胆，在胆的周围是大片的肝组织。用另一只镊子镊取靠近胆附近的组织。将离体的肝组织浸泡在葡萄糖洗必泰中。其中步骤b中消化酶对组织的消化以及纯化的工艺步骤优选为 (1)将葡萄糖洗必泰溶液倒掉。加入D-hank’ S漂洗2次。(2)用眼科剪将所得组织剪成大约2_3mm3的组织块。28°C的水浴锅中消化。(3)加入组织量4-5倍体积的胰蛋白酶和EDTA消化，期间不停摇勻。(4) 15min消化完毕后，IOOOrpm, 5min离心弃上清。(5)加3ml的D-hank’ s同底部沉淀混勻后1000rpm，5min离心，将残留的胰蛋白酶和EDTA去除，终止消化。(6)在所得的沉淀组织中加入3-4倍体积的II型胶原蛋白酶和CaCl2置入28°C水浴锅，期间不停摇勻。(7)每隔IOmin后取出3/4的上清液移入另一个离心管。(8)在烧杯中添加新的II型胶原蛋白酶和CaCl2继续消化组织块。(9)30min消化完毕后将收集的上清液细胞悬液通过200目孔径不锈钢滤网，滤掉组织块。(10) IOOOrpm, 5min离心弃上清，加3ml的无血清培养基混勻后离心，去除残留的 II型胶原蛋白酶和CaCl2，终止消化。(11)在收集细胞的离心管中加IOml的D-hank’ s，以及Iml的红细胞裂解液混勻， 上下颠倒6-8次后静置5min。(12) 1500rpm,5min离心倒弃红色部分，留下管底白色细胞团；加D-hank’ s溶液同白色细胞团混勻后1500rpm，5min离心，去除残留的红细胞裂解液。(13)如果第一次血细胞分离不彻底，可以重复步骤(11) (12)。(14)用Percoll原液与10XD-hank' s以9:1的比例配置成分离液I。(15)用配置成的分离液I和lXD-hank’ s按2:3的体积比配成分离液II。(16)将红细胞裂解液处理后管底的白色细胞团溶解于3ml的D-hank’ s，加入2. 5 倍体积即7. 5ml的分离液II。(17)4500rpm,5min离心弃上清液。取沉淀细胞团用5ml的D-hank，s重悬，枪头吹打混勻。1500rpm, 5min离心。(18)培养基(20%新生牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml的链霉素以及20ug/ml促肝细胞生长因子的DMEM/F12培养基)再悬浮，计数细胞密度，使其密度达到1 X IO6个/ml。(19)将肝细胞在多孔培养板或培养瓶中培养，所用的培养基配方为先用DMEM/ F12培养基加入20%的新生牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml的链霉素以及20ug/ml促肝细胞生长因子。于28°C的0)2培养箱中培养。(20)过8小时后，换成血清含量低的培养基培养。所述培养基为DMEM/F12培养基加入10%的新生牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml的链霉素以及20ug/ml促肝细胞生长因子。(21)其中，上述分离液I的pH为7. 6，渗透压为335m0sm。(21)其中，消化期间需要经常混勻，IOmin后将3/4的上清液移入另一个离心管。 在烧杯中添加新的消化液继续消化组织块。总共消化30min。本发明鲫肝细胞原代培养的方法采用实验动物鲫，成本低，来源广。细胞培养操作及环境要求高，为了尽可能减少外部带来的污染，保证无菌操作，在本发明中使用葡萄糖洗必泰浸泡离体的肝组织，取得了良好效果，实施期间未发现细胞受污染。当然，葡萄糖洗必泰不是无菌培养的决定因素，但却可以在操作中减少细菌污染的可能，加上它的毒性对细胞存活及生长没有不利的影响，适于对组织的消毒，实验中我们还发现，洗必泰浸泡过的组织块收集细胞后血细胞数量少于未浸泡的肝组织，造成这种现象的原因尚不清楚，但效果是肯定的。所以增加该部分的操作不仅可以减少污染，还可以消除一部分血细胞。0. 25%胰蛋白酶中加入0. 02%EDTA能够螯合Ca2+和Mg2+，能够有利于提高胰蛋白酶的消化效果。因为加入EDTA，所以要用D-hank，s终止消化。离心去除胰蛋白酶和EDTA 后，加入II型胶原蛋白酶和CaCl2, Ca2+能够有效地提高II型胶原蛋白酶的消化能力，并用无血清培养基终止消化。在消化过的细胞悬液中加入红细胞裂解液能够有效的降低分离细胞团中的血细胞含量。使用红细胞裂解液纯化细胞同未使用的相比血细胞数量明显减少。Percoll细胞分离液作为纯化介质，是一种新型的密度梯度分离液，由聚乙酰胺吡咯烷酮的硅胶颗粒构成，颗粒大小不一，通过离心后可形成的不连续密度梯度，将不同密度的细胞分离开，从而达到细胞纯化效果。虽然使用Percoll试剂能够降低肝细胞的数量，但是由于杂质细胞或者血细胞以及细胞碎片对细胞的培养有很大的影响，因此用Percoll试剂对肝细胞进行纯化是必要的一步。使用Percoll纯化鲫肝细胞，细胞存活率和纯度上显著高于非纯化组，在肝细胞功能以及贴壁率上纯化组具有明显优势，随着时间的增加，这种优势越发明显。本发明同时对比了新生牛血清以及胎牛血清对细胞培养的影响，结果发现，培养 24h后，新生牛血清组肝细胞贴壁较胎牛血清组多，所以培养时选择新生牛血清作为培养基血清成分。综上所述，本发明方法原料来自于常见水生实验动物鲫，用葡萄糖洗必泰浸泡离体组织块，对离体的组织块进行消毒，减少污染。利用分步消化法对组织进行消化，使用红细胞裂解液降低细胞中血细胞的含量，并用Percoll梯度离心，纯化肝细胞。联合取材、分步消化法、红细胞裂解液以及Percoll三种方式纯化肝细胞，本发明得到的肝细胞数量充足，且存活率达90%以上，符合原代培养的要求。
图1刚分离的细胞(放大倍数10X20)。图2培养12h的细胞(放大倍数10X40)。图3培养48h的细胞(放大倍数IOX 10)。
具体实施例方式实施例1鲫肝细胞原代培养方法 1主要材料配方及来源
1)无血清培养基DMEM/F12培养基加入100U/ml青霉素、100U/ml的链霉素以及20ug/ml 促肝细胞生长因子。2)培养基配方为在DMEM/F12培养基(上海旭飞生物有限公司)中加入新生牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml的链霉素以及20ug/ml促肝细胞生长因子。3)消化酶0.25%的胰蛋白酶(上海旭飞生物有限公司)，0. 02%的EDTA以及 0. 1% II型胶原蛋白酶(上海旭飞生物有限公司)，3mm0l/LCaCl2。4)红细胞裂解液购买于上海旭飞生物有限公司。5) Percoll分离液用Percoll原液(上海旭飞生物有限公司)与lOXD-hank，s 以9:1的比例配置成分离液I ；用配置成的分离液I和lXD-hank’ s按2:3的体积比配成分离液II。6) D-hank，s 溶液将 8g NaCl,0. 4g KCl、0. 13g Na2HPO4 · 12Η20、0· 06g ΚΗ2Ρ04、 0. 35g NaHCO3定容于IL纯水中，高温高压灭菌，待温度下降后于4°C保存。7)0. 1% II型胶原蛋白酶准确称取II型胶原蛋白酶粉末0. Ig溶于IOOmL的 D-hank’S中，4°C过夜混勻，调节pH值为7.4左右。用注射滤器过滤除菌，小瓶分装(离心管)于-20°C冻存。8 )实验动物健康鲫3只，体重300g。实验操作遵照国家动物保护法执行。2操作步骤
1)采取适当的解剖方式，从健康的鲫中分离出肝组织。试验鱼暂养3天，取健康鲫，首先剪断其鳃部脉弓，放血5min，用酒精擦拭鱼体表消毒，在超净工作台内解剖鲫，并取肝组织，为了减少细菌的污染，用葡萄糖洗必泰(氯苯双胍己烷)浸泡离体组织lOmin。用D-hank’ s漂洗2次至无血色。2)用眼科剪将组织剪成2_3mm3的碎块，置于烧杯中。3)为了提高消化效果采用分步消化的方法消化组织。将剪碎的组织倒入离心管， 置入28°C的水浴锅内。首先加入组织量4-5倍体积的胰蛋白酶和EDTA消化，期间不停摇勻，15min消化完毕后。4)离心去上清，加3ml的D-hank’ s同组织混勻后lOOOrpm，5min离心，去除残留的胰蛋白酶和EDTA，终止消化。5)向所得的沉淀组织中加3-4倍体积的II型胶原蛋白酶和CaCl2置入28°C水浴锅，期间不停摇勻。6)每隔IOmin后取出3/4的上清液移入另一个离心管。在烧杯中添加新的II型胶原蛋白酶和CaCl2继续消化组织块。7) 30min消化完毕后将收集的上清液细胞悬液通过200目孔径不锈钢滤网，滤掉组织块。8)离心弃上清，加3ml的无血清培养基同底部沉淀细胞团混勻后lOOOrpm，5min离心，去除残留的II型胶原蛋白酶和CaCl2，终止消化。9)弃上清，向所得沉淀细胞中加IOml的D-hank’ s重悬细胞。然后加Iml的红细胞裂解液，混勻后，上下颠倒6-8次，静置5min。1500rpm，5min离心，弃上清和红色细胞部分，留下白色的细胞团。10)用3ml的D-hank’ s重悬细胞团，同时加入7. 5ml的Percoll分离液II。 4500rpm，5min离心。弃上清液，取细胞团。11)取细胞团用5ml的D-hank’ s重悬，枪头吹打混勻。1500rpm，5min离心。得到纯化过后的细胞。12)培养基(20%新生牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml的链霉素以及20ug/ml促肝细胞生长因子的DMEM/F12培养基)再悬浮，计数细胞密度，使其密度达到1 X IO6个/ml。13)加入含20%新生牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml的链霉素以及20ug/ml促肝细胞生长因子的DMEM/F12培养基，28°C置于CO2培养箱中。8小时后换成含10%新生牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml的链霉素以及20ug/ml促肝细胞生长因子的DMEM/F12培养基。用本发明所提供的方法，获得了纯度高，数量足，生长状态好的细胞。方法重复三次以上，结果近似，重复率高。测试例
1、活细胞计数用台酚蓝进行活细胞计数。台酚蓝计数细胞从组织消化，经过多次洗涤及离心，会发生一定的损伤，通过细胞分离液的分离可以将完整细胞同破碎细胞，血细胞分离开，纯化的细胞经台盼蓝染色，活细胞数目达90%以上，满足原代培养的要求。2、形态学鉴定在OLYMPUS倒置显微镜下观察所得细胞的外部形态特征。形态学观察光镜下可见刚分离的肝细胞呈圆形或类圆形(图1)，细胞呈单个分散状态，界限清晰，核仁清晰可见，细胞透亮。培养12h后(图2)，细胞形态仍然呈圆形，排列紧密。开始出现贴壁、伸展现象。培养48h后(图3)，细胞紧密相连，形成岛状连接。表明细胞生长情况良好。
权利要求
1.一种鲫肝细胞原代培养方法，它包括以下工艺步骤a.从健康的鲫中分离肝组织首先剪断鲫鳃部脉弓，放血处死，用酒精擦拭鲫体表进行消毒，在超净工作台内解剖鲫，并取出肝组织，将分离的肝组织浸泡于葡萄糖洗必泰中IOmin ；b.采用分步消化法对剪碎的肝组织进行消化获得细胞团将浸泡过葡萄糖洗必泰的组织用D-hank’S漂洗2次，剪碎成2_3mm3的组织块；为了提高消化效果采用分步消化法消化组织将剪碎的组织倒入离心管，置入28°C的水浴锅内；首先加入组织量4-5倍体积的胰蛋白酶和EDTA消化，期间不停摇勻，15min消化完毕后，离心弃上清；加入3ml的D-hank’ s同底部沉淀混勻后离心弃上清，将残留的胰蛋白酶和EDTA去除，终止消化；向所得沉淀组织中加3-4倍体积的II型胶原蛋白酶和CaCl2置入28°C水浴锅，期间不停摇勻，每隔IOmin后取出3/4的上清液移入另一个离心管；在烧杯中添加新的II型胶原蛋白酶和CaCl2继续消化组织块；30min消化完毕后，将收集的上清液细胞悬液通过200目孔径不锈钢滤网，滤掉组织块；离心弃上清，加入3ml的无血清培养基同底部沉淀混勻后离心弃上清，将残留的II型胶原蛋白酶和CaCl2去除，终止消化；c.对获得的细胞团进行纯化和培养①使用红细胞裂解液去除血细胞向离心管中加IOmlD-hank’ s，将沉淀细胞团用移液器吹打分散成单个细胞悬液，同时加Iml的红细胞裂解液，轻轻吹打混勻，上下颠倒6-8次， 静置5min;离心倒弃红色部分，留下管底白色细胞团；加D-hank’S同白色细胞团混勻，吹打并离心，溶解于3ml的D-hank’ s配成肝细胞悬液；②加Percoll试剂对分离的肝细胞纯化取肝细胞悬液悬浮于2.5倍体积的Percoll 分离液II上，离心弃上清；取沉淀细胞团用5ml的D-hank’ s重悬，枪头吹打混勻；1500rpm， 5min离心，弃上清，得到纯化过后的肝细胞；其中，所述的 D-hank，s 溶液为将 8g NaCl,0. 4g KC1、0. 13g Na2HPO4 · 12Η20、0· 06g KH2P04、0. 35g NaHCO3定容于IL纯水中，高温高压灭菌，待温度下降后于4°C保存；其中所述的用Percoll分离液II配制为先用Percoll试剂原液和lOXD-hank’ s以 9:1的比例配置分离液I，用配置成的分离液I和lXD-hank’ s按2:3的体积比配置成所需的分离液II ；③将纯化后的肝细胞用培养基再悬浮，其中所述的培养基为DMEM/F12培养基中加入20%新生牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml的链霉素以及20ug/ml促肝细胞生长因子。
2.根据权利要求1所述的培养方法，葡萄糖洗必泰的浓度为0.1%。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于胰蛋白酶浓度为0.25%，EDTA的工作浓度为0. 02%，胰蛋白酶和EDTA的体积比为1:1。
4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于胶原酶的浓度为0.1%，CaCl2的浓度是 3mmol/L0
5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于所述的培养温度为28°C。
6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于所述的培养基PH为7-8。
7.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，b步骤所述消化过程中离心速度为IOOOrmp，5min。
8.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述的步骤c中加红细胞裂解液离心过程中离心转速为1500rpm，5min。
9.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述的步骤c中的血清选用新生牛血清；所述的用培养基为先用DMEM/F12培养基加入20%的新生牛血清、100U/ml青霉素、 100U/ml的链霉素以及20ug/ml促肝细胞生长因子，8小时后换成DMEM/F12培养基加入10% 的新生牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml的链霉素以及20ug/ml促肝细胞生长因子。
全文摘要
本发明提供了一种新的鲫肝细胞原代培养方法。它主要包括以下步骤a、从鲫中分离出肝组织；b、采用分步消化法对剪碎的肝组织进行消化获得细胞团；c、对获得的细胞团进行纯化和培养。本发明方法原料来自于常见水生实验动物鲫，用葡萄糖洗必泰(氯苯双胍己烷)浸泡离体组织块，对离体的组织块进行消毒，减少污染。利用分步消化法对组织进行消化，使用红细胞裂解液降低细胞中血细胞的含量，并用Percoll梯度离心，纯化肝细胞。联合取材、分步消化法、红细胞裂解液以及Percoll四种方式纯化肝细胞，本发明得到的肝细胞数量充足，且存活率达90%以上，符合原代培养的要求。
文档编号C12N5/071GK102304492SQ201110248769
公开日2012年1月4日 申请日期2011年8月27日 优先权日2011年8月27日
发明者吴婷婷, 孙杨, 郭敏, 魏华 申请人:上海海洋大学