专利名称：：从刚果锥虫获得的转唾液酸酶的制作方法发明主题本发明涉及将唾液酸从供体分子(如寡糖、聚唾液酸、糖基化蛋白、糖基化肽、糖基化脂(如神经节苷脂)和其他糖基化的低或高分子量分子)转移到受体分子(如寡糖和多糖、糖基化蛋白、糖基化肽、糖基化脂和其他糖基化的低或高分子量分子)的新酶(转唾液酸酶)。所述酶分离自原生动物刚果锥虫(Trypanosomacongolense)。本发明还涉及所述酶的功能等同物；编码这些酶及其功能性等同物的核酸序列；含有所述序列的表达构建体和载体；携带本发明的编码核酸序列的重组微生物；重组生产本发明的酶的方法；从刚果锥虫分离本发明所述酶的方法；使用本发明的酶对受体分子进行酶促唾液酸化的方法；本发明的转唾液酸酶的效应子；所述核酸序列、酶、效应子或唾液酸化产物在制备疫苗，药物、食品或食品添加剂中的应用；及根据本发明的方法产生的制剂。
背景技术：
：转唾液酸酶能将唾液酸优选为α-2，3-结合的唾液酸，从供体分子转移到受体分子，由此再次形成α-2，3-糖苷键，优选形成于半乳糖残基的β-端。术语唾液酸包括神经氨酸的所有N和O衍生物(Blix等，1957)。神经氨酸(5-氨基-3，5-二脱氧-D-甘油基-D-半乳糖基-nonulo-pyranosonic酸)是带有9个碳原子组成骨架的氨基糖，由于2号C原子上的羧基使其具有pK值2.2的较高酸度值，因此在生理条件下带负电荷。未取代的形式是非常不稳定的，并且在自然条件下不以游离形式存在(Schauer，1982)。不过，超过40种神经氨酸的衍生物是已知的(Schauer和Kamerling，1997)。自然界出现最频繁的两种唾液酸是所有糖苷键结合的唾液酸的前体(Schauer，1991)N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)，以及N-乙醇酰神经氨酸(Neu5Gc)，其通过CMP-Neu5Ac的N-乙酰残基的甲基羟基化而得到(ShawandSchauer，1988)。这两个神经氨酸的羟基可被乙酰基、乳酰基、甲基、磺酸和磷酸残基以不同的组合取代，而这将产生唾液酸结构的广泛的多样性(Schauer，1991；Schauer和Kamerling，1997)。绝大多数天然存在的唾液酸结合作为寡糖、多糖，尤其是糖缀合物的组成部分(Schauer，1982)。不过，聚唾液酸也已知可从转基因微生物产生。唾液酸化的糖缀合物主要出现在细胞外膜中，但也是粘膜浆液的重要组分(TravingandSchauer，1998)。唾液酸保护糖蛋白和细胞免受蛋白酶和其他酶的攻击，从而免于降解(Reuter等，1988)。含有唾液酸的胃肠道粘膜不仅形成对消化酶的有效保护，也保护位于这些粘膜之间的组织不被致病性细菌侵入(Kalm和Schauer，1997)。唾液酸在分子和细胞鉴定方法中起重要的功能。它们隐藏受体并由此防止受体和配体的相互作用(Schauer，1985；KelmandSchauer，1997)。因此唾液酸通过隐藏所存在的半乳糖残基保护例如血清糖蛋白和红细胞免受降解和胞吞作用。如果末端的唾液酸被分离，亚末端的半乳糖残基可通过凝集素结合到肝细胞或巨嗜细胞上，而导致对血清蛋白或红细胞的胞吞作用。另一个例子是保护免疫系统识别之前的机体自身组织，以及高度唾液酸化的肿瘤(Pilatte等，1993)。如果保护性的唾液酸层缺失，则发生自身免疫反应。唾液酸还用作机体自身细胞和激素的鉴别点，并在细胞间相互作用中起着重要作用(Kelm和Schauer，1997)。在产生炎症时，内皮细胞在其表面表达能识别白细胞上特定唾液酸化结构(如唾液酸LewisX)的凝集素，以使其结合到内皮细胞并透入到组织中((Lasky，1995)。此外，体液免疫防卫的T细胞活化受转唾液酸酶的影响(Gao等，2001)。唾液酸粘附素(siglecs)如髓磷脂相关的糖蛋白(MAG)也高度特异地结合到唾液酸化的多糖上(Kelm等，1996；Crocker等，1998)。在神经系统中，髓磷脂相关的糖蛋白尤其参与髓鞘形成和轴突生长调控。因此，最近发现转唾液酸酶通过转移唾液酸参与神经细胞和神经胶质细胞的分化就没有什么可惊讶的了(Chuenkova等，2001)。CD-22是出现在淋巴细胞上并且帮助实现T细胞和B细胞之间的“对话”的另一种唾液酸结合受体。Siglecs家族由大约超过10个的分子生物学特征性代表分子组成。然而，唾液酸不仅是对机体的自身鉴定过程有用，同时也是某些细菌、病毒和毒素的受体。例如，通过唾液酸破伤风毒素结合到神经突触的神经节苷脂(Schauer等，1995)。通过微生物的凝集素进行的唾液酸特异性黏附常常是感染性疾病的重要步骤，例如一些大肠杆菌(E.coli)引起的新生儿脑膜炎或通过幽门螺杆菌(helicobacterpylori)产生的胃粘膜感染。尤其是，流感病毒A和B病毒通过唾液酸结合到受感染的细胞上(Schauer，2000)。唾液酸的修饰，尤其是O-乙酰化对于分子和细胞识别的调控非常重要(Schauer，1991)。流感病毒因此特异性结合到支气管上皮的9-O-乙酰化唾液酸(Herrier等，1985)，而O-乙酰化阻止流感病毒A和B的结合(Higa等，1985)。然而，首先唾液酸的O-乙酰化对不同组织的形态发生和发育是非常重要的(Varki等，1991)随着神经外胚层肿瘤中含量的增加(Hubi等，2000；Fahr和Schauer，2001)，在结肠癌中其含量下降(Corfield等，1999)。唾液酸是肿瘤生物学行为的关键性调节物(Schauer，2000)。图1显示本发明的转唾液酸酶TS1和TS2的部分氨基酸序列的比较。两个序列中相同的氨基酸表示为黑体，两个部分序列对应(相同的)程度只为大约50％。图2显示唾液酸酶、唾液酸转移酶和转唾液酸酶的不同反应。图3显示从兰戈尔氏锥虫(Trypanosomarangeli(T.r.s))得到的唾液酸酶，从克鲁斯氏锥虫(Trypanosomacruzi(T.cr.TS))得到的转唾液酸酶和从布鲁斯氏锥虫(TrypanosomabruceibruceiT.b.br.TS)得到的转唾液酸酶的氨基酸序列与本发明的从刚果锥虫(TrypanosomacongelenseT.con.TS1和T.con.TS2)得到的转唾液酸酶的部分序列比较的结果。在全部序列中同一的氨基酸表示为在暗灰背景下的白色。5个序列中至少4个一致的氨基酸表示为暗灰背景下的黑色，而对应于5个序列中至少3个氨基酸表示为淡灰色。发明简述本发明的目的是提供能影响由唾液酸调控的生物或致病生物过程的新方法。令人惊讶的是，有可能通过提供具有转唾液酸酶活性的新酶和来自刚果锥虫的该酶的编码序列来实现上述目的。本发明的第一个主题领域涉及编码具有转唾液酸酶活性并能从刚果锥虫分离得到的蛋白的多核苷酸，由此这些蛋白优选催化唾液酸从供体向受体分子转移。优选的多核苷酸包括至少一种SEQIDNO1或3的核酸序列，或者是其包括至少15个连续的核苷酸残基的片段。本发明的主题还包括与这些序列互补的多核苷酸和片段，以及通过简并遗传密码子从这些多核苷酸衍生的核苷酸序列。本发明的主题还包括与本发明的多核苷酸杂交的寡核苷酸，尤其是在严格条件下杂交。本发明的主题还包括与上述定义的寡核苷酸杂交，尤其是在严格条件下杂交，以及编码锥虫属微生物的基因产物的多核苷酸。本发明的主题还包括具有下列特征的多肽及其具有转唾液酸酶活性的功能等同物含有上述定义的核酸序列的多核苷酸编码的多肽；或具有含有SEQIDNO2或4的至少10个连续氨基酸的氨基酸序列多肽。本发明的主题尤其包括转唾液酸酶或其具有转唾液酸酶活性的功能性等同物，其特征在于具有下列的部分氨基酸序列的一种TDTVAKYSTDGGRTWKREVIIPNGR(对应于SEQIDNO2的1到25位)FRIPSLVEIDGVLIATFDTRYLRASDSSLI(对应于SEQIDNO4的1到30位)。优选的转唾液酸酶1(TS1)特征在于具有至少下列一种特性部分核苷酸序列SEQIDNO1部分氨基酸序列SEQIDNO2最适温度30-40℃最适pHpH6.5-8.5等电点pH4-5天然分子量400-600kDa还原性SDS-PAGE中的分子量90kDa另一种优选的转唾液酸酶2(TS2)特征在于具有至少下列一种特性核苷酸序列SEQIDNO3部分氨基酸序列SEQIDNO4最适温度30-40℃最适pHpH6.5-8.5等电点pH5-6天然分子量120-180kDa还原性SDS-PAGE中的分子量90kDa上述的本发明的多核苷酸和多肽，尤其是编码核酸序列和氨基酸序列可从刚果锥虫中得到。然而，它们也可以通过合成尤其是化学、生化、酶学、基因技术和转基因方法得到。本发明的主题还包括本发明的转唾液酸酶的功能性等同物。本发明的主题还包括含有与至少一个调节核酸序列操作性连接的上述定义的核酸序列的表达盒。此外，本发明还包括含有至少一种这些表达盒的重组载体。本发明的主题还包括用至少一种上述定义的载体转化的原核或真核宿主。此外，本发明涉及上述定义的表达盒、载体或宿主在重组制备具有转唾液酸酶活性的蛋白中的应用。本发明的主题还包括对受体分子进行酶法唾液酸化的方法，特征在于将受体分子与含有唾液酸残基的供体分子在上述定义的转唾液酸酶存在的条件下温育，并分离唾液酸化的受体。这类方法的特征在于至少具有下列之一的特性a)供体选自连接到寡糖、多糖、聚唾液酸、糖蛋白和糖脂，如尤其是乳铁蛋白、糖基化乳清蛋白和酪蛋白及其片段的唾液酸；b)受体选自含有β-半乳糖的聚合物，诸如β-半乳糖寡糖、乳糖醇、乳糖酸、甲基-β-乳糖苷、乙酰乳糖胺、半乳糖吡喃糖苷、转-半乳糖寡糖、聚半乳糖和其他末端结合β(1-3)或β(1-4)半乳糖的糖缀合物或半乳糖。本发明的另一方面涉及本发明的转唾液酸酶、编码该酶的核酸序列或根据本发明方法制备的唾液酸化产物在制备药物、食品或食品添加剂中的应用，用于通过唾液酸预防或治疗寄生虫、细菌或病毒感染，用于治疗肿瘤疾病，用于治疗与组织的发育干扰相关的疾病，用于治疗免疫系统疾病，用于治疗自身免疫反应，用于治疗细胞通讯障碍的疾病；和/或用于治疗炎症。尤其是，本发明的主题包括本发明的上述定义的转唾液酸酶在开发锥虫疫苗中的应用或在开发酶抑制剂中的应用，用于治疗或预防锥虫感染。此外，本发明涉及转唾液酸酶、编码所述酶的核酸序列或根据本发明制备的唾液酸化产物在制备药物、食品添加剂或食品以在酶作用之前保护机体的自身细胞或组织或糖蛋白中的应用。本发明的主题还包括转唾液酸酶、编码所述酶的核酸序列或根据本发明制备的唾液酸化的产物在制备药物、食品添加剂或食品以影响机体组织的发育和/或形态发生中的应用。此外，本发明涉及转唾液酸酶的转唾液酸酶活性的效应子，选自a)与上述的本发明转唾液酸酶作用的多肽配体；b)调节上述定义的转唾液酸酶的生物活性的低分子量效应子；c)上述定义的核酸序列的反义核酸序列。此外，本发明涉及这类效应子在制备药物、食品添加剂或食品以治疗或预防与转唾液酸酶活性相关的疾病中的应用。本发明的主题还包括分离具有转唾液酸酶活性的酶的方法，包括a)在培养基中培养刚果锥虫，以及b)通过盐梯度利用离子交换层析从培养物上清中分离所需产物，如果必要随后进行等电聚焦、凝胶过滤、亲和层析和/或蛋白沉淀。最后，本发明涉及在药物或基因治疗的合适载体中含有至少一种上述定义的效应子的药物或基因治疗介质。发明详述i)发明的重要性本发明的重要性在于通过本发明可影响由唾液酸控制的寄生虫、细菌和病毒的感染机制，影响细胞信息交流和免疫系统，以及对人和动物组织和肿瘤的调控和发育机制的改变。这通过在本文描述的转唾液酸酶的作用下将唾液酸靶向转移到生物相关的糖结构(多糖、多糖衍生物和糖缀合物)进行。将唾液酸转移到选定的载体结构产生，例如改变炎性反应的产物，改变人和动物体细胞相互作用的产物，保护机体的自身组织免受自身免疫系统攻击(自身免疫反应)的产物，“暴露”病人体内的癌细胞以使其被机体的自身免疫系统攻击(癌症治疗和癌症预防)的产物，抵抗致病性细菌侵入人或动物体内的产物、预防和抵抗病毒感染的产物，抵抗幽门螺杆菌感染胃粘膜的产物，抵抗细菌和病毒引起的新生儿脑膜炎的产物，对真核和原核致病性生物、细菌、病毒和毒素受体的预防性和治疗性影响以阻止其在人和动物体具有活性的产物，抑制霍乱毒素结合到人和动物消化道粘膜的产物，开发抗锥虫的疫苗的产物，开发抵抗锥虫感染的酶抑制剂的产物，影响人和动物体的分子和细胞识别过程的产物，保护糖蛋白和细胞免受蛋白酶和其他酶攻击的产物，以及保护分子免受人和动物消化道酶降解的产物，影响机体组织发育和形态发生的产物。本发明的转唾液酸酶的特征在于具有下列的DNS和部分氨基酸序列以及其他DNS同源序列，例如与上述部分序列具有60％以上的一致性(同一性)的序列。ii)优选的转唾液酸酶的序列详细资料(1)TS1酶序列的信息TS1部分序列的DNS特征长度1491碱基对类型核酸链形式双链来源刚果锥虫TS1酶的DNS部分序列(SEQIDNO1)5’ACCGACACCGTTGCTAAATACAGCACTGACGGTGGGAGAACGTGGAAGAGGGAGGTTATAATTCCGAATGGTCGTGTGGATGCCCACTACTCCCGCGTCGTTGATCCCACTGTTGTTGCGAAGGGTAATAACATTTATGTTCTCGTTGGGCGGTACAATGTCACGCGGGGCTACTGGCACAATAGGAACAACAAGGCTGGCATAGCCGATTGGGAGCCCTTCGTGTACAAGGGCACGGTGAACGTGGGCACGAAGGGCAATGCCACTGATGTGTCGATCAGCTGGGAGAGGACTGCACTGAAGTCGCTGTACAACTTCCCGGTTTCGGGAAGCCCTGGCACGCAGTTCCTTGGAGGGGCTGGGGGTGGTGTTGTAACATCCAACGGGACGATTGTGCTGCCAGTGCAGGCAAGGAACAAGGCCAACCGTGTTGTGAGCATGATCCTGTACTCGGCTGACGATGGAAAGTCATGGCACTTTGGGAAGGGTGAGGCCGGTGTAGGCACGTCCGAGGCTGCCCTCACTGAGTGGGACGGCAAGCTGCTGATTAGTGCACGATCCGATGGTGGACAGGGCTACCGCATGATATTCGAATCGAGTGACCTTGGTGCGACGTGGAAAGAGATGCTCAACAGCATCTCCCGCGTGATTGGCAACTCTCCGGGTCGCAGTGGTCCTGGCAGCTCGAGTGGCTTCATCACGGTGACAGTGGAGGGTGTGCCTGTGATGCTGATTACCCACCCGAAGAACCTTAAGGGCTCGTATTATCGGGACCGTCTGCAGCTGTGGATGACGGACGGCAATCGTATGTGGCATGTCGGGCAGGTCTCTGAGGGCGACGATAACAGCGCTTACAGCTCCCTGCTGTACACTCCGGACGGGGTCCTGTACTGCTTGCATGAGCAGAACATTGATGAGGTGTACAGCCTCCACCTTGTGCGCCTTGTGGACGAGCTGAAAAGCATTAAATCAACGGCTCTGGTGTGGAAGGCACAGGACGAGCTTCTCCTGGGCAACTGCCTCCCGGGCGATAAATACGATCCCGGGTGTGACGGCATCCCCACCGCTGGGCTTGCCGGGCTGCTGGTAGGACCCCTGACGGAGAAGACGTGGCCCGACGCGTATCGGTGCGTGAACGCTGCAACCAGCGGCGCTGTGAGCACTGCTGAAGGCGTGCGGCTGGACGTGGGTGGCGGTGGCCATGTTGTGTGGCCCGTGAGTGAGCAGGGGCAGGACCAGCGGTATTACTTTACCAACAGCGAGTTCACGCTCGCCGTCACGGTGCGGTTTGACGAGATGCCACGGGGGGAGCTCCCGTTGCTGGGGTTTGTGAACCGCAAAGGGAAGGTGAAGAAGATACTGAAGGTGTCGCTGAGCGGGGTGGAGTGGCTCCTGGCATACGGGAATGAGTACAACAGCACAGCCGCTGAGCCGCTGGACGTGAACGAGAGCCACCAGGTGGTGCTAGCGCTTCACGACGGGATCGTCTCC3’TS1酶的氨基酸部分序列(SEQIDNO2)TDTVAKYSTDGGRTWKREVIIPNGRVDAHYSRVVDPTVVAKGNNIYVLVGRYNVTRGYWHNRNNKAGIADWEPFVYKGTVNVGTKGNATDVSISWERTALKSLYNFPVSGSPGTQFLGGAGGGVVTSNGTIVLPVQARNKANRVVSMILYSADDGKSWHFGKGEAGVGTSEAALTEWDGKLLISARSDGGQGYRMIFESSDLGATWKEMLNSISRVIGNSPGRSGPGSSSGFITVTVEGVPVMLITHPKNLKGSYYRDRLQLWMTDGNRMWHVGQVSEGDDNSAYSSLLYTPDGVLYCLHEQNIDEVYSLHLVRLVDELKSIKSTALVWKAQDELLLGNCLPGDKYDPGCDGIPTAGLAGLLVGPLTEKTWPDAYRCVNAATSGAVSTAEGVRLDVGGGGHVVWPVSEQGQDQRYYFTNSEFTLAVTVRFDEMPRGELPLLGFVNRKGKVKKILKVSLSGVEWLLAYGNEYNSTAAEPLDVNESHQVVLALHDGIVS(2)TS2酶的序列信息TS2的DNS部分序列的特征831个碱基对类型核酸链形式双链来源刚果锥虫TS2酶的DNS部分序列(SEQIDNO3)5’TTCCGAATTCCCTCACTTGTTGAGATAGACGGCGTGCTTATCGCGACATTCGATACACGTTATCTTCGCGCTTCCGACAGCAGTCTCATAGACACAGCTATGAAATACAGTGCCGATCAGGGGAAGACGTGGAAAACTGAAATCATAATAAAAAATGCTAGACTAACTGATAACTTTTCCCGCGTCGTTGATCCAACGGTTGTTGTTAAGGGTGATAACTTGTTTATTTTTGTTGGGAGGTACAACACCTCATCTGCCCCATGGGTCTGGCAGGAAAACGGTAAAGACTGGGATGTACTGTTGTACAAGGCCAAGGTGAGGAAGGAATCAGCGGGTGGGGTACCATCAGTGAGCTTTACATGGGACGAACCCCTATACCTGAAGCATCTGCTCACCTCTGTCGGTAAAATAGACGGCAGGTCCCTCATACAATACATTGGTGGCGTTGGAAATGGTATTGTAACACCGAAAGGTACTATCGTGTTTCCAGTTCAGGTTTTAAACACCAACAAATCCGTCATGAACATGCTTCTGTATTCAAGTAACGACGGAAAAACCTGGGAGTTCAGCAAAACTTCCACACCCGCGGGCACAACTGAGGCCTCCCTTGTTTGGTGGGATGGACAACTACTTCTCACAAGCAGAACAACTCCGGATGTCGGCAGCCGCAAAGTATATTTAACAAGCGACCTCGGAACTTCATGGAATGAAGCGATCGGAAGTATCTCTCGTGTAATTGGTAACTCGCGGTACCGTAACGATCCTGGGGGGTCAGGTAGCTCAATTGCCATAACTGTGGAGGGAGTACCGGTGATGCTGATTACCCACCCG3’TS2酶的氨基酸部分序列(SEQIDNO4)FRIPSLVEIDGVLIATFDTRYLRASDSSLIDTAMKYSADQGKTWKTEIIIKNARLTDNFSRVVDPTVVVKGDNLFIFVGRYNTSSAPWVWQENGKDWDVLLYKAKVRKESAGGVPSVSFTWDEPLYLKHLLTSVGKIDGRSLIQYIGGVGNGIVTPKGTIVFPVQVLNTNKSVMNMLLYSSNDGKTWEFSKTSTPAGTTEASLVWWDGQLLLTSRTTPDVGSRKVYLTSDLGTSWNEAIGSISRVIGNSRYRNDPGGSGSSIAITVEGVPVMLITHPTS1酶和TS2酶的部分氨基酸序列的一致性(一致性)只为大约50％。因此该部分序列清晰地定义了两者不同的物质(参见图1)iii)新发现的酶TS1和TS2的特征描述a)所述物质的物理/化学性质表1两种转唾液酸酶TS1和TS2的基本数据性质TS1TS2最适温度30-40℃30-40℃最适pHpH6.5-8.5pH6.5-8.5等电点pH4-5pH5-6天然分子量400-600kDa120-180kDa还原性SDS-PAGE中的分子量90kDa90kDa盐的影响1MKCl和NaCl降低两种酶50％的活性，脱盐方法再生酶活力金属离子的影响20mMCa2+，Mg2+，Mn2+无影响5mMCu2+，Zn2+，Fe2+，Co2+很少的影响假定抑制剂的影响10mMN-(4-硝基苯基)草氨酸很少的抑制10mMN-乙酰-2，3-双脱氢-2-脱氧神经氨酸很少抑制b)所述物质的生物学性质这里谈到的两种物质是将唾液酸从供体分子转移到受体分子的两种酶。唾液酸在两种酶的作用下，结合到聚糖，例如寡糖、多糖、聚唾液酸、糖蛋白和糖脂上作为供体。糖蛋白中，尤其是乳铁蛋白(来自人、牛、山羊、绵羊、马、骆驼和其他动物)，糖基化乳清蛋白(来自人、牛、山羊、绵羊、马、骆驼和其他动物)，和酪蛋白(来自人、牛、山羊、绵羊、马、骆驼和其他动物)，其他来自人、动物或植物的糖基化的蛋白，如酪蛋白的部分(来自人、牛、山羊、绵羊、马、骆驼和其他动物)，人、动物和植物来源的其它糖蛋白及其部分，诸如例如来自酪蛋白的部分(来自人、牛、山羊、绵羊、马、骆驼和其他动物)，诸如例如来自这些动物的酪蛋白的糖巨肽，是可在酶的作用下被转移的良好的唾液酸的供体。神经节苷脂也可用作供体两种转唾液酸酶都具有对半乳糖寡糖良好的受体特异性，特别是对β-半乳糖寡糖，诸如例如由BorculoDomoIngredients(BDI)公司生产的VivinalGOS和由Yakult.公司生产的Oligomate55。此外，乳糖醇、乳糖酸、甲基β-乳糖苷、乙酰乳糖胺、半乳糖吡喃糖苷、转-半乳糖寡糖、聚半乳糖和其他带有末端结合的β(1-3)或β(1-4)-半乳糖的糖缀合物也可用作受体。半乳糖残基的甲基化使受体功能下降。葡萄糖残基的甲基化(例如与乳糖)对受体的功能具有较小的影响。单糖半乳糖也可以用作受体，只是特异性较低。TS1酶显示出将唾液酸转移到对应的受体上的效率上是TS2酶的大约两倍。底物可以自由地结合，即溶解地，或也可是细胞膜结合的。克鲁斯氏锥虫(Schenkman等，1991；Vadekerckhove等，1992；Scudder等，1993)和布鲁斯氏锥虫(Engstler等，1992，1993，1995)已知在将α-2，3-结合的末端唾液酸转移到β-1，4结合的末端半乳糖残基的过程中起作用。由于不同的DNS和氨基酸序列，TS1和TS2与已知的酶有差异。TS1和TS2被因此清楚表征为新物质(转唾液酸酶)。进一步的区别，参见下一段叙述。iv)本发明与其他转唾液酸酶、唾液酸酶和唾液酸转移酶的区别“转唾液酸酶”首次在美国锥体虫克鲁斯氏锥虫中描述(Schenkmann等，1991)。不久以后，该酶也在非洲型的冈比亚布氏锥虫(Trypanosomabruceigambiense)、罗德西亚布氏锥虫(Trypanosomabruceirhodesiense)和布鲁斯氏锥虫(Trypanosomabruceibrucei)中发现(Engstler等，1993，PontesdeCarvalho等，1993，Engstler等，1995)。此外，转唾液酸酶也在肠锥虫(感染树懒的寄生虫)型(Medina-Acosta等，1994)、白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)(Mattos-Guaraldi等，1998)和人血浆中(Tertov等，2001)发现。通常所称的唾液酸酶在发现转唾液酸酶之前已经是公知的。它们是特异性将唾液酸从供体分子转移到水，并将唾液酸从寡糖和糖缀合物中脱水的糖苷水解酶。此外，一些含有胞嘧啶核苷单磷酸(CMP)活化的唾液酸的酶能转移到其他糖残基，主要是半乳糖和N-乙酰半乳糖。这些酶称作唾液酸转移酶(参见图2.)。此处讨论的转唾液酸酶不像纯的唾液酸酶可以将唾液酸特异性地从供体分子转移到水中。然而，如果没有合适的受体，此处讨论的转唾液酸酶会像基本的唾液酸酶一样水解唾液酸。此处讨论的转唾液酸酶不需要上述提到的唾液酸转移酶在其转移反应所需要的活化的唾液酸，因此可以以非常广泛的方式使用。因此此处讨论的转唾液酸酶比纯唾液酸酶和唾液酸转移酶更具有工业实用性。到目前为止，只知道克鲁斯氏锥虫和布斯氏锥虫转唾液酸酶的DNS和氨基酸序列，及兰戈尔氏锥虫(Trypanosomarangeli)纯唾液酸的DNS和氨基酸序列。此处讨论的TS1酶具有与布斯氏锥虫转唾液酸酶的部分氨基酸序列小于60％的一致性(同一性)，以及与克鲁斯氏锥虫的部分氨基酸序列小于50％的一致性(同一性)。此处讨论的TS2酶具有与布斯氏锥虫转唾液酸酶的部分氨基酸序列小于50％的一致性(同一性)，以及与克鲁斯氏锥虫的部分氨基酸序列小于50％的一致性(同一性)(参见图3)。此外，已知锥虫转唾液酸酶与已知的细菌及病毒的唾液酸酶和转唾液酸酶的氨基酸对应程度为20％到30％(Chuenkova等，1999，Montagna等，2002)。因此此处描述的酶是新定义的物质(酶)，其与其他已知相似功能的酶的DNS和氨基酸序列一致性(同一性)小于60％。v)本发明进一步陈述a)多肽和功能性等同物本发明的“多肽”包括本发明的氨基酸序列的特征性部分片段和本发明的酶及其功能性等同物的氨基酸序列。还包括本发明精确揭示的新多肽和酶的“功能性等同物”或“同源体”。本发明范围内精确揭示的多肽的“功能性等同物”或类似物是与具有上述定义的所需生物学活性(如底物特异性)不同的多肽。本发明的“功能性等同物”应该理解为，尤其是，上述定义的序列至少一个位置的氨基酸具有与上述精确定义的序列不同，但具有此处确定的生物功能中的一种的突变体。因此“功能性等同物”包括通过一种或多种氨基酸添加、替换、删除和/或倒置的方法得到的突变体，其中这些指定的改变可以发生在序列的任何位置，只要产生的突变体具有本发明的特征。如果突变体和未改变的多肽之间的反应性模式是定量对应的，即例如同样底物的改变具有不同的速度，则由此功能性等同物是特别地存在的。上述意义上的“功能性等同物”也包括所描述多肽的前体和多肽的功能性衍生物和盐。术语“盐”理解为羧基的盐和本发明的蛋白质分子的氨基的酸加成盐。羧基的盐可以通过已知的方式生产并包括无机盐，诸如例如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐和锌盐及有机碱盐，诸如例如胺盐如三乙醇胺盐、精氨酸盐、赖氨酸盐、哌啶盐等。酸加成盐，诸如例如，无机酸的盐，诸如盐酸盐或硫酸盐及有机酸的盐，诸如乙酸盐和草酸盐也包括在本发明的主题之内。本发明的多肽“功能性衍生物”可在现有技术下在功能性氨基酸侧链基团或其N-或C-末端上产生。这种类型的衍生物包括，例如，羧酸基团的脂肪族酯、通过用含氨的或与初级或二级胺的转化得到的羧酸基团的酰胺；通过用乙酰基团的转化得到的游离氨基的N-乙酰衍生物、或通过用乙酰基团的转化得到的游离羟基的O-酰基衍生物。当然，“功能性等同物”还包括来自其他生物体的多肽以及天然存在的变体。例如，根据本发明的精确细节可以通过序列比较确定同源序列区域和酶的等同物。“功能性等同物”还包括本发明多肽的具有所需生物学功能的片段，优选独立结构域或序列结构。此外，“功能性等同物”为具有上述确定的多肽序列之一或其功能性等同物以及至少一种其它的功能不同的N-或C-末端连接的异源序列(即，对另一部分不具有任何实质性的负面功能影响的融化蛋白部分)的融合蛋白。这种异源序列的非限制型的例子，如信号肽、酶、免疫球蛋白、表面抗原、受体或受体配体。本发明的转唾液酸酶“功能性等同物”具体的是使用Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad，Sci，(USA)85(8)，1988，2444-2448算法，与SEQIDNO2或4的相应氨基酸序列或部分序列具有至少60％，尤其是65％或至少70％，诸如，例如75％，80％，85％，90％，95％，98％或99％的序列同一性(序列同源性)的氨基酸序列或部分序列的酶。在可能的蛋白糖基化的例子中，本发明的等同物包括上述蛋白去糖基化或糖基化的形式和对糖基化模式进行改变得到的修饰的形式。本发明的蛋白或多肽的同源体可通过致突变的方法产生，例如，通过点突变，加长或缩短该蛋白。此处使用的术语“同源体”涉及用作蛋白活性的激动剂或拮抗剂的蛋白的变体形式。本发明的蛋白的同源体可通过筛选突变体的组合库而鉴定，例如缩短的突变体。例如，蛋白突变体的多样化库可通过在核酸水平进行组合的突变而产生，例如通过酶连接合成的寡核苷酸的混合物。有多种方法可用于从简并的寡核苷酸序列生产潜在的同源体的库。简并基因序列的化学合成可以在DNA合成仪上进行，并且合成的基因然后可以与合适的表达载体连接。使用简并的基因集合可以在一个编码所需集合成为潜在的蛋白序列的混合物中提供所有的序列。合成简并寡核苷酸的方法是本领域技术人员公知的(如Narang，S.A.(1983)Tetrahedron393；Itakura等(1984)Annu.Rev.Biochem.52323；Itakura等，(1984)Science1981056；Ike等(1983)NucleicAcidsRes.11477)。b)多核苷酸本发明的“多核苷酸”包括编码本发明酶氨基酸部分序列的本发明核酸序列的特征性部分片段，和编码酶及其功能性等同物的核酸序列。多核苷酸优选含有大约20个以上，尤其是大约30个以上，诸如例如大约45个以上或大约60个以上的核酸残基。“寡核苷酸”包括尤其少于大约60个核酸残基的序列，优选少于大约45个，特别少于大约30个或少于大约20个核酸残基。此处提到的所有“核酸序列”可以常规的方法从核苷酸构建单元通过化学合成而制备，例如通过单个的重叠的、双螺旋的互补核酸构建单元的片段浓缩的方法制备。寡核苷酸的化学合成可以采用已知的phosphoamidite方法进行(Voet，Voet，第二版，WileyPressNewYork，p896-897)。使用DNA聚合酶的Klenow片段进行合成的寡核苷酸的吸附和间隙的填补，连接反应和通常的克隆方法描述于Sambrook等(1989)，分子克隆实验室手册，冷泉港实验室出版社。本发明的主题还包括编码上述多肽及其功能性等同物之一的核酸序列(单链-和双链DNA和RNA序列，诸如，例如cDNA和mRNA)，如其还可以使用合成的核苷酸类似物得到。本发明涉及编码本发明的多肽或蛋白或其生物活性部分的分离的核酸分子，及可用作例如鉴定或扩增本发明的编码核酸片段的杂交探针或引物。本发明的核酸分子可另外含有编码基因范围的3’端和/或5’端的非翻译序列。“分离的”核酸分子分离自天然来源的核酸中存在的其他核酸分子，并且如果是通过重组技术生产的还基本不含任何其它细胞物质或培养基，或者如果是化学合成的，不含化学前体物质或其他化合物。本发明的核酸分子可通过分子生物学标准技术和本发明提供的序列信息而分离到。例如，可以利用精确描述的全序列或其部分之一用作杂交探针和标准的杂交技术(如描述于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY，1989).从合适的cDNA库分离cDNA。此外含有一种揭示序列或部分序列的核酸分子可以利用聚合酶链式反应得到，其中使用到根据上述序列制备的寡核苷酸引物。这种方法扩增的核酸能克隆到合适的载体中并通过DNA序列分析而确定其特征。本发明的寡核苷酸还可以通过标准的合成方法而制备，如利用自动DNA合成设备。本发明进一步包括精确描述的核酸序列或其部分序列的“互补”核酸分子。本发明的核苷酸序列可以帮助制备用于在其他细胞类型和生物体中鉴定和/或克隆同源序列的探针和引物。这种类型的探针和引物通常包括在严格条件下与至少大约12，优选至少大约25，诸如例如大约40，50或70个本发明的核酸序列的有义链或对应的反义链的连续核苷酸杂交的核苷酸序列区段。此外，本发明的核酸序列来自SEQIDNO1和3，并通过添加、替换、插入或缺失单个或数个核苷酸而与之相区别，但编码具有所需特性的多肽。本发明还包括含有称作沉默突变或与根据特定来源或宿主生物体的使用的密码子精确描述的序列相比的改变，及天然存在的例如剪接突变体或等位基因突变体的那些核酸序列。本发明主题还包括通过保守核苷酸替换的方法(即氨基酸被另一种相同电荷、分子量大小、极性和/或溶解性的氨基酸替换)获得的序列。本发明的主题还包括通过序列多态性方法从精确揭示的核酸产生的分子。这些遗传多态性由于天然的变异能在种群内的个体间存在。这些天然的改变通常在基因的核苷酸序列内产生大约1到5％的差异。此外，本发明还包括与上述指定的编码序列或其互补序列杂交的核酸序列。这些多核苷酸能通过对基因组或cDNA库取样而定位，如果需要，能够使用合适的引物通过PCR方法从此处扩增，并然后能用合适的探针分离到。另外，还有可能利用本发明的多核苷酸或载体转化合适的微生物，通过扩增该微生物而扩增该多核苷酸，并随后分离该多核苷酸。此外，本发明的多核苷酸能通过化学方法合成。可以“杂交”到多核苷酸的性质应当理解为多核苷酸或寡核苷酸在严格条件下结合到接近互补的序列的能力，而在这些条件下，不发生非互补配对之间非特异性的结合。为此，所述序列应当70-100％互补，优选90-100％互补。互补序列能互相特异性结合的性质被用于，例如Northern或Southern印迹技术或与PCR或RT-PCR中与引物结合。总的来说，使用长度至少为30碱基对的寡核苷酸。“严格”条件应当理解为当，例如，在Southern或Northern印迹之后，DNA或RNA片段在膜上与探针在特定条件下杂交，即温度60-70℃(38-42℃，含有50％甲酰胺的50％杂交液)。此外，当在杂交后为洗脱非特异性杂交的DNA或RNA探针而进行的洗涤步骤也特异性进行时，条件也是特异性或严格的。特异性洗涤步骤通常是在20-25℃用含0.1％SDS(十二烷基磺酸钠)的2×SSC缓冲液洗涤5-10分钟，两次，随后用低离子强度的缓冲液(如含有0.1％SDS的0.1×SSC)在更高的温度(如64℃)洗涤两次。[20×SSC3MNaCl，0.3M柠檬酸钠，pH7.0]。这样，只有那些很大程度上互补的核酸还彼此结合。严格条件的设置是本领域技术人员公知的技术，并描述于Ausubel等，分子生物学最新操作，JohnWiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。本发明的另一方面涉及“反义”核酸。其包括与编码的“有义”核酸互补的核苷酸序列。该反义核酸可以与整个编码链互补或只与其一部分互补。通过另一个实施方案，反义核酸分子是核苷酸序列的编码链的非编码区域的反义链。术语“非编码区”指鉴定为5’和3’非翻译区的序列区段。反义寡核苷酸可以是例如大约5，10，15，20，25，30，35，40，45或50核苷酸长度。本发明的反义核酸可以使用此专门领域的技术通过化学合成或酶连接来构建。反义核酸可以是化学合成的，如果天然存在的或不同修饰的核苷酸的形式提高该分子的生物稳定性或提高反义和有义核酸的双螺旋的物理稳定性，则也可以使用。例如，使用phosphorthioate衍生物和吖啶取代的核苷酸。修饰的核苷酸可用于构建反义核酸的例子如5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤，黄嘌呤，4-乙酰胞嘧啶等。本发明的反义核酸分子通常施用到细胞或在原位产生，以使其与细胞内mRNA和/或编码DNA杂交或结合，以抑制蛋白的表达，如通过抑制转录或翻译。在本发明中，术语“表达”或“增强”或“过量表达”描述在微生物中生产或提高一种或多种由对应的DNA编码的酶的细胞内活力。为此，例如，可以向生物体内引入基因，用另外的基因代替存在的基因，提高一个或多个基因的拷贝数，或使用编码具有高活性的酶的基因，即可以在需要的情况下组合这些方案。在本发明中，术语“减弱”和“降低”描述微生物中由相应的DNA编码的一种或者多种酶的细胞内活性的减弱或降低。为此，例如，在生物体中删除基因，用另一基因取代现有的基因，降低一个或多个基因转录本的拷贝数，使用弱的启动子或使用编码具有低活性的对应酶的基因，以及如果需要可以组合这些方案。c)构建体和载体的表达本发明的主题还包括表达构建体，包括在调控性核酸序列的遗传控制下的编码本发明的多肽的核酸序列；及含有至少一个上述表达构建体的载体。优选地，这些本发明的构建体包括各编码序列5’上游的启动子和3’下游的终止子序列，及如果需要，另外的常规调控元件并分别操作性连接到编码序列上。“操作性连接”理解为启动子，编码序列、终止子和如果需要，其他这类的调控元件按顺序排列，以使每个调控元件能根据编码序列的表达的条件实现其功能。可操作性连接的序列的例子是目标序列和增强子、多聚腺苷酸信号等。另外的调控元件包括可选的标记、扩增信号、复制起始点等。合适的调控序列描述于Goeddel，基因表达技术酶学方法，185，AcademicPress，SanDiego，CA(1990)。除人工调控序列之外，天然调控序列也可以出现在目前的结构基因前面。通过遗传改变，如果需要可以抛弃天然调控并提高或降低基因的表达。该基因构建体还能更简单地构建，即在结构基因前不插入另外的调控信号，也没有除去其天然的启动子及其调控序列。此外，天然调控序列以不再发生调控，并且基因表达增强和降低的方式突变。在基因构建体中可以含有一个或多个该核酸序列的拷贝。可用的启动子的例子是可有利地用于革兰氏阴性细菌的cos-，tac-，trp-，tet-，trp-tet-，lpp-，lac-，lpp-lac-，laclq-，T7-，T5-，T3-，gal-，trc-，ara-，SP6-，λ-PR-或imλ-PL启动子；及革兰氏阳性启动子amy和SP02，酵母启动子ADC1，MFalpha，AC，P-60，CYC1，GAPDH或植物启动子CaMV/35S，SSU，OCS，lib4，usp，STLS1，B33，not或泛素或菜豆蛋白启动子。特别优选使用诱导启动子如光和尤其是温度诱导的启动子，如PrP1启动子。一般来说，所有天然启动子可以与其调控序列一起使用。此外，合成的启动子也可以有利的使用。特定的调控序列应该可以使核酸序列靶向表达并表达蛋白。这表明，例如，随宿主生物的不同，基因只在诱导后表达或过量表达，或立即表达和/或过量表达。这里的调控序列和因子优选能具有正面影响并因此提高或降低表达。因此，调控元件的增强可有利地发生在转录水平，其中可使用强转录信号，例如启动子和/或“增强子”。此外，也可能增强翻译，例如通过提高mRNA的稳定性。通过将合适的启动子与合适的编码核苷酸序列和终止子或多聚腺苷酸信号融合的方式产生表达盒。为此，可以使用现有的重组和克隆技术，如描述于T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1989)和T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，基因融合实验，冷泉港Laboratory，冷泉港，NY(1984)和Ausubel，F.M.等，分子生物学最新操作，GreenePublishingAssoc.andWileyInterscience(1987)。为在合适的宿主生物中的表达，重组核酸构建体或基因构建体有利地插入到宿主特异性的能使基因在宿主中最优化表达的载体。“载体”是本领域技术人员公知的，例如，来自“克隆载体”(PouwelsP.H.等，Hrsg，Elsevier，Amsterdam-NewYork-Oxford，1985)。除质粒外，载体被理解为本领域技术人员公知的所有其他载体，例如噬菌体、病毒如SV40，CMV，杆状病毒和腺病毒，转座子，IS元件，噬菌粒，粘粒和线性或环状DNA。这些载体可以在宿主中自动复制或随染色体复制。下面所述可指定作为合适的表达载体的例子。常见的融合表达载体，如pGEX(PharmaciaBiotechInc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene6731-40)，pMAL(NewEnglandBiolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)可以通过这些载体将谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，麦芽糖E结合蛋白或蛋白A与重组的靶蛋白融合。非融化蛋白表达载体如pTrc(Amann等，(1988)Gene69310-315)和pET11d(Studier等基因表达技术酶学方法，185，AcademicPress，SanDiego，California(1990)60-89)。在酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达的酵母表达载体，如pYepSecl(Baldari等，(1987)EmboJ.6229-234)，pMFa(KurjanandHerskowitz(1982)Cell30933-943)，pJRY88(Schultz等(1987)gene54113-123)和pYES2(InvitrogenCorporation，SanDiego，CA)。适合用在其他真菌中如丝状真菌的载体和构建载体的方法，包括那些具体描述于vandenHondel，C.A.M.J.J.&Punt，P.J.(1991)“丝状真菌的基因转移系统和载体发展”(“Genetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi)，inAppliedMolecularGeneticsofFungi，J.F.Peberdy等，Hrsg.，pages1-28，CambridgeUniversityPressCambridge。可以在培养的昆虫细胞(例如，Sf9细胞)中表达蛋白的杆状病毒载体包括pAc序列(Smith等，(1983)Mol.CellBiol..32156-2165)和pVL序列(LucklowandSummers(1989)Virology17031-39)。植物表达载体如那些具体描述于Becker，D.，Kemper，E.，Schell，J.和Masterson，R.(1992)“在靠近左端定位有选择性标记的新的植物二元载体”(“Newplantbinaryvectorswithselectablemarkerslocatedproximaltotheleftborder”)，PlantMol.Biol.201195-1197和Bevan，M.W.(1984)“用于植物转化的二元土壤杆菌载体”(“BinaryAgrobacteriumvectorsforplanttransformation”)，Nucl.AcidsRes.128711-8721。哺乳动物表达载体如pCDM8(Seed，B.(1987)Nature329840)和pMT2PC(Kaufman等，(1987)EMBOJ.6187-195)。其他原核和真核细胞合适的表达系统描述于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.andManiatis，T.，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港Laboratory，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY，1989的第16和17章。d)重组的微生物利用本发明的载体，可以生产重组微生物，例如被至少一个本发明的载体转化并可以用于生产本发明的多肽。上面描述的本发明的重组构建体被有利地引入到合适的宿主中并在其中表达。为此，优选使用本领域技术人员公知的通常使用的克隆和转染方法，例如共沉淀、原生质体融化、电穿孔、逆转录病毒转染等以将指定的核酸引入到各自的表达系统中表达。合适的系统描述于，例如分子生物学最新操作，F.Ausubel等，Hrsg.，WileyInterscience，NewYork1997或Sambrook等分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY，1989。根据本发明，也可以制备同源重组的微生物。为此，制备含有本发明的基因的至少一个片段的载体，或含有至少一个编码序列的载体，如果需要，其中引入至少一个氨基酸缺失、添加或置换以改变本发明的序列，例如破坏其功能(“敲除”载体)。引入的序列还可以是来自相关的微生物的同源体或来自哺乳动物，酵母或昆虫。用于同源重组的载体可以任选的是这样的形式，即在同源重组中内源的基因以另一种方式突变或改变，但还是编码功能蛋白(如位于上游的调控区可以改变内源蛋白表达的方式被改变)。改变的本发明的基因部分位于同源重组载体中。适合用于同源重组的载体的构建描述于Thomas，K.R.和Capecchi，M.R.(1987)Cell51503。作为宿主生物，原则上所有生物体都适合于表达本发明的核酸或其等位基因变体、其功能性等同物或衍生物。宿主生物理解为，例如，细菌、真菌、酵母、植物或动物细胞。优选的生物为细菌，例如埃希氏菌属，如大肠杆菌，链霉菌、杆菌或假单孢菌，真核微生物如酿酒酵母，曲霉，来自动物或植物的高等真核细胞，例如Sf9或CHO细胞。成功转化的生物体的选择可以利用包含在载体或表达盒内的标记基因进行。这类标记基因的例子是抗生素抗性基因和使转化的细胞着色的催化生色反应的酶的基因。可以通过自动细胞分选的方式来选择。成功转化有携带相应抗生素抗性基因(如G418或潮霉素)载体的微生物可以采用含有抗生素或琼脂的相应培养基来选择。细胞表面的标记蛋白可以用于亲和层析方式的筛选。宿主生物体和适合该生物体的载体的组合形成表达系统，所述载体例如为质粒、病毒或噬菌体，如带有RNA聚合酶/启动子系统的质粒，噬菌体8或7，或其他温和噬菌体或转座子和/或其他有益的调控序列。术语“表达系统”应当理解为，例如，哺乳动物细胞的组合，例如CHO细胞和载体，例如适合哺乳动物细胞的pcDNA3neo载体。如果需要，基因产物还可以引入到转基因生物体中表达，如转基因动物，特别使小鼠、绵羊或转基因植物。e)重组生产多肽此外，本发明的主题还包括重组生产本发明的多肽或其功能性生物活性片段的方法，其中培养生产多肽的微生物，如果需要诱导多肽的表达并从培养物分离多肽。如果需要，多肽也可以这种方式大规模生产。重组微生物可以采用已知的方法培养和发酵。细菌可以，例如在TB或LB培养基中在20到40℃，pH值6到9的条件下扩增。合适的培养条件具体描述于，例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆实验室手册，冷泉港Laboratory，冷泉港，NY(1989)。如果多肽没有分泌到培养基中，则裂解细胞并利用已知的蛋白分离方法从裂解物中得到产物。如果这样，细胞通过高频超声波、高压例如在弗氏压碎器(Frenchpressure)中、通过渗透、通过去污剂、裂解酶或有机溶剂、通过匀浆或通过以上数种方式的组合进行裂解。多肽的纯化可以通过使用已知的层析方法，例如分子筛层析(凝胶过滤)，例如Q-Sepharose层析，离子交换层析和疏水层析，以及使用其他常规的方法例如超滤，结晶，盐析、透析和非变性凝胶电泳进行。合适的方法描述于，例如Cooper，F.G.，生物化学工作方法，VerlagWalterdeGruyter，Berlin，NewYork或Scopes，R.，蛋白纯化，SpringerVerlag，NewYork，Heidelberg，Berlin。相同的方法也适用于非重组生产的多肽。为分离重组蛋白，特别有利的是使用通过特定的核酸序列延长cDNA以编码改变的多肽或融合蛋白，其例如利于纯化的载体系统或寡核苷酸。这类合适的修饰可以是，例如，用作锚的“标记”，例如，已知为六-组氨酸锚或能被确定为抗体的抗原的表位的修饰(描述于，例如Harlow，E.和Lane，D.，1988，抗体实验室手册.冷泉港(N.Y.)出版社)。这些锚可以用于将蛋白附着到固体载体如聚合物基质上，其例如能填充到层析柱中或用在微孔板或一些其他的载体上。同时，这些锚可以用于鉴定蛋白。为鉴定蛋白，可以使用常规的标记，例如荧光染料、酶标记，其在与底物反应后形成可检测的反应产物，或放射标记，这些标记单独地或与锚一起可以衍生蛋白。f)从培养物中纯化所需的唾液酸化产物所需的产物可以从微生物体或培养上清液中通过本领域公知的不同方法来获得。如果所需的产物没有与细胞分离，则通过低速离心从培养物中收集细胞，用标准的方法裂解细胞，例如机械力或超声波处理。通过离心除去细胞碎片，含有可溶性蛋白的上清级分用于进一步纯化所需的化合物。如果产物是与细胞分离的，通过低速离心从培养物中除去细胞，将上清级分用于进一步纯化。两种纯化方法的上清液级分都可进行采用合适树脂的层析，其中所需的比杂质具更高选择性的分子或是被层析树脂保留住，或是通过该树脂。这些层析步骤，如果需要可以重复，其中可以使用相同的或其他的层析树脂。本领域的技术人员可以熟练选择合适的层析树脂并将其最有效地应用于待纯化的特定分子。纯化的产物可以通过过滤或超滤浓缩并在使产物保持最大稳定性的温度下保存。许多纯化方法是现有技术已知的。这些纯化技术描述于Bailey，J.E.&Ollis，D.F.基础生物化学工程，McGraw-HillNewYork(1986)。分离的化合物的同一性和纯度可以通过现有技术的方法鉴定。这些技术包括高效液相色谱(HPLC)，分光镜方法，着色方法，薄层层析，NIRS，酶法检测或微生物学检测。这些分析方法综述于Patek等(1994)Appl.Environ.Microbiol.60133-140；Malakhova等(1996)Biotekhnologiya11，27-32；Schmidt等(1998)BioprocessEngineer.1967-70.Ullmann’s工业化学百科全书(EncylopediaofIndustrialChemistry)(1996)Bd.A27，VCHWeinheim，p89-90，p521-540，p540-547，p559-566，575-581和p581-587；Michal，G(1999)生物化学途径生物化学和分子生物学图册(BiochemicalPathwaysAnAtlasofBiochemistryandMolecularBiology)，JohnWileyandSons；Fallon，A.等(1987)HPLC在生物化学中的应用生物化学和分子生物学实验室技术(ApplicationsofHPLCinBiochemistryinLaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology)，Bd.17。下面非限制性的实施例描述了本发明的具体实施方案。本文描述的转唾液酸酶的生产、纯化和应用的实施例。总述本发明范围内进行的克隆步骤，如限制性酶切、琼脂糖凝胶电泳、DNA片段纯化、核酸向硝酸纤维素膜和尼龙膜的转移、DNA片段的连接、转化细胞、细菌培养、噬菌体扩增和重组DNA序列分析，按照Sambrook等(1989)loc.Cit的描述进行。实施例1从刚果锥虫培养物中分离酶刚果锥虫(保存于瑞士巴赛尔热带研究所(STIB)，株系号249)的前循环型可以在含10％胎牛血清和氯高铁血红素的SM/SDM79培养基中于27℃无CO2的条件下培养。培养三到四天后，细胞数量从1×106增加到大约7×106/mL，并通过离心分离培养上清液，过滤并通过超滤浓缩。这种方法获得的培养上清中，可以观察到84％的酶活性，而另外16％的酶活性被发现存在于细胞沉淀上。浓缩的培养上清液直接用作用于转唾液酸酶反应的酶浓缩液。反应后可以从培养上清液分离所需的唾液酸化的分子。实施例2酶的纯化将浓缩的培养上清液引入到离子交换柱(QSepharose)中分离纯的酶。该柱在洗涤后用盐离子梯度洗脱。用最大为0.2M的盐浓度洗脱TS2，用最小为0.2M的盐浓度洗脱TS1。洗脱后，两种酶都通过等电聚焦，凝胶过滤(SephadesG150SF)、亲和层析或蛋白沉淀的方式分离以纯化到具有显著同质性的产物。Example3酶活性的测定将25μL的酶的50mMBisTris缓冲液溶液，pH7.0与作为供体的1mMNeufAc-α(2-3)乳糖和0.5mM的4-甲基伞形糖基半乳糖苷作为受体以终体积50μL在37℃一起温育2小时，测定转唾液酸酶的转移活性。加入1mL冰水终止温育。将反应物引入到预填充有0.3mLQSepharoseFF(乙酸盐形式)和用水预平衡的柱中。在用水洗去受体和去除死体积(200μL1NHCl)后，唾液酸化的产物用1NHCI(700μL)洗脱。用酸在95℃水解该产物45分钟并在冰上冷却后，探针用250-290μL2NNaOH和300μL1M甘氨酸/NaOH缓冲液pH10.0中和。释放的甲基伞形酮的荧光用365nm的激发波长和450nm的发射波长在黑色96孔板(Microfluor，Dynex，U.S.A.)中测量。酶的活性对应于检测到的荧光强度，并以先前建立的校准曲线读取其值(根据Engstler等1992的方法)。实施例4培养用于生产酶的转基因生物(细菌、酵母、真菌、植物)此处描述的TS1和TS2的DNA部分序列首次使得利用通常的标准技术建立酶的全DNS序列(尤其是由于此处使用的DNS序列不含有任何非编码的内含子)。对应的标准技术为如“聚合酶链式反应”技术(PCR技术)、使用基因组DNS或cDNA和mRNA的“Southern印迹”技术，其可以使用市售的试剂盒，例如Invitrogen或Clontech公司生产的试剂盒来进行。该技术是本领域技术人员公知的，描述于Ausubel等，分子生物学最新操作，Edition1989和2001等。各酶的全部DNS或其功能性部分序列通过标准的转化技术(Ausubel等)引入到所需的生产生物体中。转基因生物生产TS1和TS2，并可以从转基因生物和/或其培养上清中分离。作为编码TS1或TS2的DNS的受体生物，可以使用原核的细菌、真核的微生物、酵母和其他真菌、真核的细胞培养物、藻类、植物、种子、动物、动物的部分、组织、杂交瘤、转基因生物和基因生物学、基因治疗及转基因重组子和生物体，从其产生器官、组织和细胞。本文的酶可以从相应的转基因生物的全部或部分、其培养物上清液，器官、组织、细胞、生物液体、分泌物、eiern、血液、淋巴、乳汁、植物、藻类和种子及其部分中分离到。实施例5酶反应的例子6kg糖巨肽(glycomacropeptide)(GMP)与1kg链长度为6-10个糖基的半乳糖寡糖共同溶解于通常使用的50mMBisTris缓冲液pH7.0(如Merk，Darmstadt公司生产的)。用1L含有转唾液酸酶的刚果锥虫的培养上清取代上述溶液，并在37℃温育3小时。经过温育，转唾液酸酶将唾液酸从GMP转移到半乳糖寡糖。唾液酸化的产物可以利用常规的层析方法(Ausubel等)或过滤技术分离和纯化，并以纯的形式用于产物制剂。糖巨肽(glycomacropeptide)(GMP)是从牛奶生产奶酪的废弃产物。在制备奶酪的酪蛋白沉淀后，其可以从剩余的乳清蛋白中通过过滤技术分离到。当乳糖通过市售的β-半乳糖苷酶转化时产生半乳糖寡糖。通过这一转化，一方面，β-半乳糖苷酶将乳糖分解成其单体糖。另一方面，通过这一转化，在转化的副反应中，同时可以生产带有长链的半乳糖寡糖，其可以被分离并用作转唾液酸酶反应的受体。实施例6酶的应用两种分离的酶可以例如，用于对含有β-半乳糖的聚合物(如阿拉伯胶等Gumarabicum)进行唾液酸化，并且尤其用于聚乳糖胺和半乳聚糖，及用于半乳糖寡糖(GOS)，尤其是用于β-半乳糖寡糖，如BorculoDomoIngredients(BDI)公司生产的VivinalGOS和Yakult.公司生产的Oligmate55。这些半乳糖聚合物和新产生的半乳糖寡糖(如实施例5中的描述产生)可以在本发明的转唾液酸酶的作用下被唾液酸化。可以使用上述的所有供体，尤其是来自酪蛋白(人、牛、山羊、绵羊、马、骆驼和其他动物)的糖巨蛋白(glycomacropeptide)作为唾液酸的供体。唾液酸化的糖结构显示与在人体中发现的并具有多种功能的酸糖的相似性增加。参考文献Blix，F.G.，Gottschalk，A.undKlenk，E.(1957).Proposednomenclatureinthefieldofneuraminicandsialicacids.Nature1791088ChuenkovaM.，PereiraM.，(1999).TaylorG.trans-sialidaseofTrypanosomacruziLocationofgalactose-bindingsite(S).BIOCHEMBIOPHYSRESCOMMUN；262549-556.ChuenkovaM.V.，PereiraM.A.(2001).TheT.cruzitrans-sialidaseinducesPC12celldifferentiationviaMAPK/ERKpathway.Neuroreport123715-3718.CorfieldA.P.，MyerscoughN.，WarrenB.F.，DurdeyP.，ParaskevaC.andSchauerR.(1999).ReductionofsialicacidO-acetylationinhumancolonmucinsintheadenoma-carcinomasequence，GlycoconjugateJ.16307-317Crocker，P.R.，Clark，E.A.，Filbin，M.，Gordon，S.，Jones，Y.，Kehri，J.H.，Kelm，S.，LeDouarin，N.，Powell，L.，Roder，J.，Schnaar，R.L.，Sgroi，D.C.，Stamenkovic，K.，Schauer，R.，Schachner，M.，vandenBerg，T.K.，vanderMerwe，P.A.，Watt，S.M.undVarki，A.(1998).Siglecsafamilyofsialic-acidbindinglectins.Glycobiology8，V.Engstler，M.，Reuter，G.undSchauer，R.(1992).PurificationandcharacterizationofanovelsialidasefoundinprocycliccultureformsofTrypanosomabrucei.Mol.Biochem.Parasitol.5421-30.EngstlerM.，ReuterG.，SchauerR.(1993).Thedevelopmentallyregulatedtrans-sialidasefromTrypanosomabruceisialylatestheprocyclicacidicrepetitiveprotein.MolBiochemParasitol；611-13.EngstlerM.，SchauerR.，BrunR.(1995).Distributionofdevelopmentallyregulatedtrans-sialidasesintheKinetoplastidaandcharacterizationofashedtrans-sialidaseactivityfromprocyclicTrypanosomacongolense.ActaTrop；59117-129.FahrC.andSchauerR.(2001).DetectionofSialicAcidsandGangliosideswithSpecialReferenceto9-O-AcetylatedSpeciesinBasaliomasandNormalHumanSkin，J.Invest.Dermatol.116254-260GaoW，PereiraMA.(2001).Trypanosomacruzi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人:N·V·努特里西阿