生产和纯化活性可溶唾液酸转移酶的方法

专利名称：生产和纯化活性可溶唾液酸转移酶的方法
技术领域：
本发明涉及生产和纯化唾液酸转移酶多肽，特别是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)-a-2，6唾液酸转移酶I(ST6GalNAcI)多肽的方法。方法包括在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中生产唾液酸转移酶多肽和用色谱步骤的组合来纯化多肽的步骤。方法导致高产量的高纯度和酶促活性的唾液酸转移酶多肽。获得的唾液酸转移酶，特别是ST6GalNAcI可用于治疗蛋白例如G-CSF的糖基化。

背景技术：
自然界存在多种寡糖结构和许多类型的糖肽，它们部分地由大量糖基转移酶合成。糖基转移酶通过将活化的单或寡糖残基从供体转移到已有的受体分子以起始或延伸糖链，来催化糖脂、糖肽和多糖的合成。认为催化反应涉及糖基转移酶的适当的结构域以及酶的催化位点对供体和受体的识别。超过30%的全部治疗蛋白和许多可能的肽治疗剂是糖基化的肽。本领域熟知，正确的多糖结构的附着可在治疗肽的折叠、生物活性、生物分布和药物学效力中起关键作用。此外，糖基化是影响治疗肽的体内半寿期和免疫原性的关键性重要因素。实际上，人通常只耐受具有特别类型的糖附着物的生物治疗剂，并通常排斥包括非哺乳动物寡糖附着物的糖蛋白。例如，未充分糖基化的肽被肝识别为“旧的”，因而比适当糖基化的肽被更快地从身体清除。相反，过度糖基化的肽或错误糖基化的肽能够是免疫原性的。重组糖肽的生产，与重组非糖基化肽相反，要求对重组生产的肽进行额外的加工步骤，所述步骤在细胞内体内进行或在肽由细胞生产后体外进行。可酶促处理肽，使用糖基转移酶通过将一个或多个糖基基团共价附着到肽上，向肽引入一个或多个糖基基团。由外部的肽加工的体外步骤生产糖肽是费时而昂贵的。这部分地因为生产用于肽和糖肽的体外糖基化以生产糖肽治疗剂的重组糖基转移酶的负担和花费。由于重组糖治疗剂的需求和使用增加，需要新的方法以更高效地制备糖肽。此外，由于越来越多的糖肽被发现用于多种疾病的治疗，存在对降低其生产成本的方法的需求。此外，本领域也存在对开发更高效地生产重组糖肽的方法的需求，所述重组糖肽用于发展和改善糖肽治疗剂。在WO 2003/031464 A2中公开了糖基转移酶及其在蛋白质的糖基化中的用途。唾液酸转移酶构成催化唾液酸(N-乙酰神经氨酸)翻译后转移至位于糖蛋白和糖脂末端位置的受体寡糖底物的糖基转移酶家族(Paulson等人，1989，J.Biol.Chem.264:17615-17618)。据估计人基因组编码超过20种不同的、合成哺乳动物细胞中存在的所有已知唾液-寡糖结构所需的唾液酸转移酶，但仅克隆了 16种不同的人唾液酸转移酶cDNA(Tsuji S 等人，1996，Glycobiology6:5_7 ；Tsuji S，1996，J.Biochem.120:1_13 ；Weinstein J等人，1982，J.Biol.Chem.257 =13835-13844)。最初，唾液酸转移酶是用生物化学方法纯化的，其cDNA是用N端序列克隆的。获得的cDNA序列的比较显示了 2个高度保守的区域，称为L-和S-唾液酰基序，它们参与底物结合。随后，通过使用在唾液酰基序内设计的简并引物的PCR或通过表达克隆,克隆了若干唾液酸转移酶(Nara K等人，1994, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91:7952-7956 ；Nakayama J 等人，1996，J.Biol.Chem.271:3684-3691 ；Nakayama J 等人，1995，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 92:7031-7035)。通过差异展示进行的基因克隆增加了鉴定在疾病相关过程中具有推定的功能意义的新型唾液酸转移酶的完全不同的方法。唾液酸转移酶在其底物特异性和组织分布中存在差异，并且根据其合成的糖键分为四个家族:ST3Gal-、ST6Gal-、ST6GalNAc-和ST8Sia_家族。每个家族的成员显示对某些受体基团的强活性，尽管这些酶的底物特异性重叠；一种键可由多个酶合成。在治疗糖肽的开发和生产中有效用的一种此类特别的唾液酸转移酶是N-乙酰半乳糖胺-α 2，6-唾液酸转移酶(ST6GalNAcI)，它催化唾液酸从唾液酸供体转移到唾液酸受体。全长鸡 ST6GalNAcl 酶，例如，由 Kurosawa 等人公开(1994，J.Biol.Chem.，269:1402-1409)。过去，已为增加用于体外生产糖肽的重组唾液酸转移酶的有效性进行了努力。Institute of Physical&Chemical Research 的 EP 0 737 745 Al 和 US5, 032，519涉及大肠杆菌用于生产分泌形式的蛋白质的用途，所述蛋白质包含源自ST6GaINAcI并且负责其活性的部分，即活性结构域。Neose Technologies Inc.的 WO 2007/056524 A2 描述了生产经修饰的ST6GalNAcI多肽的方法，此方法包括在适于在原核宿主细胞中表达修饰的ST6GalNAcI多肽的条件下培养重组原核宿主细胞。这些经修饰的ST6GalNAcI是嵌合多肽，其包含来自Gal-β l，3GalNAc-a2，3_唾液酸转移酶(ST3GalI)多肽的第一部分和来自GalNAc-α-2，6-唾液酸转移酶I (ST6GaINAcI)多肽的第二部分。经修饰的ST6GalNAcI多肽还能够是真核或原核宿主细胞中缺少全部或部分ST6GalNAcI信号结构域、全部或部分ST6GalNAcI跨膜结构域和/或全部或部分ST6GalNAcI茎结构域的截短的多肽。Neose Technologies In`c.的US 2006/0234345 Al 公开了在具有氧化环境的原核微生物中生产可溶性真核糖基转移酶的方法，所述方法通过a)在原核微生物中表达编码真核糖基转移酶的核酸；然后b)在允许在原核微生物的细胞区室内表达可溶性活性真核糖基转移酶的条件下培养原核微生物。Skretas 等人(2009, Microbial Cell Factories,8:50)涉及在经改造的大肠杆菌菌株中表达人唾液酸转移酶ST6GalNAcI的方法，所述经改造的大肠杆菌菌株拥有特定类型的氧化细胞质或共表达分子伴侣/辅分子伴侣触发因子，DnaK/DnaJ、GroEL/GroES和Skp,并能生产极大增加的量的可溶性ST6GaINAcI。然而，尽管开发了若干用于克服这些限制的工具，大肠杆菌对于蛋白质折叠和形成二硫键的能力不足。此外，重组蛋白质在大肠杆菌表达系统中的高表达产量通常可导致聚集的、不可溶性蛋白质的积累，形成包涵体，这是获得可溶性活性蛋白质的重要阻碍(Brondyk W.H.,2009, Methods in Enzymology, Vol.463, Ch.11)。为克服与大肠杆菌培养物中重组唾液酸转移酶的生产相关的问题，开发了昆虫细胞培养物系统。US2006/0246544A1和US2008/0207487A1公开了制造包括重组多肽(例如唾液酸转移酶)的组合物的方法，其中多肽在昆虫细胞中表达(例如使用杆状病毒表达系统)，并且其中组合物基本没有内切葡聚糖酶活性。方法包括对包括多肽的混合物进行包括以下步骤的混合模式色谱:(i)将混合物与混合模式色谱介质接触；和(ii)从混合模式色谱介质洗脱多肽，生成包含多肽的流通级分。然而，杆状病毒-昆虫表达系统的复杂性、所需病毒种子储备物有限的储存稳定性和有效转染所需的非常高的病毒效价可限制其用于大规模生物生产的用途。此外，病毒载体例如杆状病毒已被证明能感染哺乳动物细胞，特别是人细胞(Boyce FM和Buchner NL,1996, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93:2348-2352 ;Lundstrom 等人,2001，Cytotechnology,35:213-221)。因此，这些载体造成关于安全问题的威胁，特别是当用于大规模重组蛋白生产时，其中要操作大量感染的细胞。克服使用昆虫细胞培养系统的所述限制的备选方案是使用用于制造重组唾液酸转移酶的哺乳动物细胞系统。Neose Technologies Inc.的 W02005/121332A2 公开了在原核和昆虫宿主细胞中生产缺少全部或部分ST6GaINAcI信号结构域、全部或部分ST6GaINAcI跨膜结构域，和/或全部或部分ST6GaINAcI茎结构域的分离的截短ST6GaINAcI的方法，并且大体地提及多肽也可在哺乳动物细胞中生产。加州大学的US5，032，519描述了用携带表达糖基转移酶的基因的载体转染宿主细胞(例如CHO细胞)的方法，所述糖基转移酶以可切割的分泌信号区段取代了膜锚定和大部分茎区域。当获得的可溶性糖基转移酶在细胞中表达时，被细胞分泌。随后将分泌的可溶性糖基转移酶从细胞培养基分离，用于工业应用或糖合成研究。此外，US5，032，519公开了通过使用亲和色谱来纯化可溶性糖基转移酶的方法。然而，上述涉及在哺乳动物细胞中生产重组唾液酸转移酶的文件无一公开用于提供高活性，纯化至药物级，适于大规模生产的重组唾液酸转移酶的方法。因此，仍然存在对生产具有适于“药物级”方法和反应的活性和纯度的重组唾液酸转移酶，特别是用于生产糖肽治疗剂的有效方法的需求。因此，本发明的问题是提供用于生产重组唾液酸转移酶的此类方法。发明概述根据本发明，在一方面，通过提供生产唾液酸转移酶多肽的方法解决此问题，方法包括以下步骤:a)在CHO细胞中表达唾液酸转移酶多肽；收集含有经表达的唾液酸转移酶多肽的培养基；和b)通过对细胞培养基进行(i)至少一次亲和色谱和/或一次混合模式色谱步骤和
(ii)至少一次阴离子交换色谱和/或一次阳离子交换色谱步骤，从培养基纯化唾液酸转移酶多肽。在一个实施方式中，唾液酸转移酶多肽是缺少全部或部分唾液酸转移酶信号结构域、全部或部分唾液酸转移酶跨膜结构域，和/或全部或部分唾液酸转移酶茎结构域的截短的唾液酸转移酶多肽。优选地，唾液酸转移酶多肽只包含唾液酸转移酶活性结构域。在优选的实施方式中，唾液酸转移酶是ST6GalNAcI。通常，ST6GalNAcI选自以下所组成的组:人、黑猩猩、猩猩、猪、牛、狗、大鼠、小鼠和鸡ST6GalNAcI。在优选的实施方式中，ST6GalNAcI是鸡ST6GalNAcI。最 优选地，ST6GalNAcI多肽包含根据SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列。根据本发明的实施方式，编码EPO信号序列和唾液酸转移酶多肽序列的表达盒被用于在CHO细胞中表达唾液酸转移酶多肽。优选地，通过使用无血清补料分批培养和/或通过在达到预定的细胞密度后进行从37°C +/_1°C至32°C +/-1°C的孵育温度改变来进行生产方法的步骤a)。此外，本发明包括方法，其中步骤c)包括两次亲和色谱过程或一次亲和色谱过程和一次混合模式色谱过程，一次阴离子交换色谱过程和一次阳离子交换色谱过程。在最优选的实施方式中，步骤c)按以下顺序进行:1.阴离子交换色谱；i1.第一次亲和色谱；ii1.第二次亲和色谱或混合模式色谱；iv.阳离子交换色谱。通常，用含有二乙胺基乙基基团(DEAE)、季胺基乙基基团(QAE)、季铵基团(Q)、二甲胺基乙基基团(DMAE)和/或三甲基铵乙基基团(TMAE)作为功能基团的阴离子交换树脂或膜进行阴离子交换色谱。优选地，它是用可商购的Q-Sepharose Fast Flow树脂进行的，使用pH在7.0和8.0之间的范围的NaCl/Tris-HCl缓冲液作为洗脱剂。通常，用N1-NTA树脂、Talon树脂、染料色谱树脂、抗体亲和树脂、凝集素亲和树脂和/或肽配体亲和树脂进行亲和色谱。在优选的实施方式中，(第一次)亲和色谱是用可商购的Blue Sepharose FF树脂进行的,优选地使用pH在7.0和8.0之间的范围的盐酸L-精氨酸/磷酸钾缓冲液作为洗脱剂而混合模式色谱是用可商购的羟磷灰石树脂进行的，优选地使用pH在7.0和8.0之间的范围的NaCl/磷酸钾缓冲液作为洗脱剂。通常，阳离子交换色谱 是用含有磺丙基阳离子交换材料的树脂或具有类似性质的树脂进行的。优选地，它是用可商购的SP-Sepharose High Performance树脂进行的,更优选地使用PH在6.0和7.0之间的范围的NaCl/磷酸钾缓冲液作为洗脱剂。另一方面，本发明提供通过根据本发明的任一方法生产的唾液酸转移酶多肽，其中唾液酸转移酶多肽至少98%纯，优选地至少99%纯，最优选地高于99%纯。在优选的实施方式中，唾液酸转移酶多肽是ST6GalNAcI。在另外的方面，本发明包括通过根据本发明的任一方法生产的ST6GalNacI多肽用于治疗蛋白的糖基化，例如用于人细胞因子的糖基化，特别是用于人粒细胞集落刺激因子G-CSF的糖基化的用途。发明详述本发明提供生产和纯化高活性和纯度的经改善的唾液酸转移酶的方法。此目标是通过下述实现:在CHO细胞中表达唾液酸转移酶多肽，收集含有经表达的唾液酸转移酶多肽的细胞培养基，以及通过对培养基进行(i)至少一次亲和色谱和/或一次混合模式色谱过程和(ii)至少一次阴离子交换色谱和/或一次阳离子交换色谱过程，从培养基纯化唾液酸转移酶多肽。更具体地，本发明涉及方法，其中唾液酸转移酶多肽的纯化是按以下顺序进行的:1.阴离子交换色谱；i1.第一次亲和色谱；ii1.第二次亲和色谱或混合模式色谱；
iv.阳离子交换色谱。除非另有限定，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文说明的类似或等价的任何方法或材料可用于实施或测试本发明，本文描述了优选的方法和材料。A.唾液酸转移酶多肽和表达盒在一个实施方式中，唾液酸转移酶多肽是缺少全部或部分唾液酸转移酶信号结构域、全部或部分唾液酸转移酶跨膜结构域，和/或全部或部分唾液酸转移酶茎结构域的截短的唾液酸转移酶多肽。优选地，唾液酸转移酶多肽只包含唾液酸转移酶活性结构域。唾液酸转移酶多肽还可包含信号肽。在优选的实施方式中，编码EPO信号序列和唾液酸转移酶多肽序列的表达盒用于在CHO细胞中表达唾液酸转移酶多肽。“多肽”，备选地称为“蛋白质”，指其中单体是氨基酸并且通过酰胺键联接的聚合物。此外，也包括非天然氨基酸，例如P-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸。非基因编码的氨基酸也可用于本发明。此外，已经被修饰以包括反应基团、糖基化位点、聚合物、治疗部分、生物分子等的氨基酸也可用于本发明。所有用于本发明的氨基酸可以是D-或L-异构体。L-异构体通常是优选的。此外，其他肽模拟物(peptidomimetics)也用于本发明。如本文所用，“肽”指糖基化和未糖基化的肽。也包括由表达肽的系统不完全糖基化的肽。一般性综述参见 Spatola, A.F.,于“Chemistry and biochemistry of amino acids, peptides andproteins” 中，B.Weinstein 编辑，Marcel Dekker, New York,第 267 页(1983)。术语多月太包括通常称为蛋白质或肽的分子。唾液酸转移酶多肽可是本领域普通技术人员知晓的任何唾液酸转移酶多肽，包含但不限于:α _(2，3)唾液酸转移酶(ST3Gal3) (Kitagawa 和 Paulson, 1994，J.Biol.Chem.269:1394-1401)、a -N-乙酰半乳糖胺 α -2，6-唾液酸转移酶 I (ST6GalNAcI)(Kurosawa等人，1994，J.Biol.Chem.，269:1402-1409)和 β 1，3GalNAc_ α 2，3-唾液酸转移酶(ST3GalI) (Gillespie 等人，1992，J.Biol.Chem.267 (29):21004-10)。“截短的唾液酸转移酶多肽”指具有比天然存在的唾液酸转移酶少的氨基酸残基但保留酶促活性的唾液酸转移酶。只要酶保留活性，可缺失任何数量的氨基酸残基。在一些实施方式中，可缺失结构域或结构域的部分。在本发明的优选实施方式中，唾液酸转移酶多肽只包含唾液酸转移酶活性结构域。“活性结构域”或“催化结构域”指催化由酶进行的酶促反应的蛋白质结构域或其子序列。例如，唾液酸转移酶的催化结构域将包括足以将唾液酸残基从供体转移到受体糖类的唾液酸转移酶的子序列。催化结构域可以包括整个酶，其子序列，或者可以包括不附着于天然存在的酶的额外的氨基酸序列，或其子序列。示例性催化区域是，但不限于鸡ST6GalNacI的催化结构域，其包含根据SEQ ID NO:2的全长序列的氨基酸残基232至566。鸡ST6GalNacI的催化结构域在SEQ ID N0.4中进行描述。在优选的实施方式中，唾液酸转移酶是ST6GalNAcI。通常，ST6GalNAcI选自以下所组成的组:人、黑猩猩、猩猩、猪、牛、狗、大鼠、小鼠和鸡 ST6GalN AcI (Kurosawa 等人，1994，J.Biol.Chem.，269:1402-1409 ；Skretas等人，2009，Microbial cell factories, 8:50 ；W02005/121332) 在最优选的实施方式中，ST6GalNAcI是鸡ST6GalNAcI，其由SEQ ID NO:1的核苷酸序列编码。优选地，ST6GalNAcI分别由根据SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的核苷酸序列编码，并分别具有根据SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列。B.表达系统根据本发明，唾液酸转移酶多肽在CHO细胞或本领域普通技术人员知晓的等价的细胞系中表达。用于将各个遗传材料引入宿主细胞以表达可溶性唾液酸转移酶的特别方法不是特别关键。如本领域技术人员所理解，启动子的选择，以及用于将遗传材料引入用于表达本发明的唾液酸转移酶多肽的宿主细胞的方法和策略在本领域众所周知。这些包括使用质粒载体、病毒载体和任何其他用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成的DNA或其他外源遗传材料引入宿主细胞的众所周知的方法。只需要所利用的特别的遗传改造方法能将至少一个基因成功引入能表达全长或经遗传修饰或截短的唾液酸转移酶的宿主细胞。“载体”是包含分离的核酸并能用于将分离的核酸递送到细胞内部的物质组合物。本领域熟知多种载体，包括但不限于线性核酸、与离子或两亲的化合物缔合的核酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制质粒或经遗传修饰的病毒。术语也应当被理解为包括帮助将核酸转移入细胞的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。适当的载体包括连同例如，CMV启动子的pSV40、pEF_l_ α、pSV2、pT-Rex、pSecTag2、pBudCE4.1或pCDNA/His Max载体。在本发明的优选实施方式中，设计用于异源基因的高水平表达的PM0Z-G8载体用于表达唾液酸转移酶多肽。其中适当的选择标志物是新霉素、嘌呤霉素、潮霉素和二氢叶酸还原酶(DHFR)。C.CHO细胞 培养物根据本发明的实施方式，通过使用无血清补料分批培养和通过在达到预定的≥5xl05活细胞/mL，优选地≥1.5xl06活细胞/mL的细胞密度后，进行从37°C +/_1°C至32°C +/-1 °C的孵育温度改变，来实施生产方法的步骤a)。本发明人发现此温度改变增加细胞的生存力，使得它们可在培养物中保持更长时间。这反过来导致更高的产品产量。例如，没有温度改变，细胞只能培养5天，获得约24mg/l的产品产量。相反，如果使用温度改变，细胞可培养9天，获得68mg/l的产品产量。在无血清补料分批培养中，使用经改造以过表达ST6GalNAcl的源自CHO的细胞系生产唾液酸转移酶多肽。使用T烧瓶或旋转烧瓶从一小瓶主细胞库(MCB)生长用于发酵过程的接种物，然后在种子生物反应器中培养。然后将接种物转移到生产生物反应器，在此进行进一步细胞扩增直到细胞密度达到 适于生产的水平。在限定的细胞密度时开始温度改变，并且通过补加葡萄糖溶液将葡萄糖水平维持在限定的范围内。在培养结束时收获培养物。通过深度过滤从收获物移除培养物中的细胞和碎片。将收获物储存在2-8 °C直到开始蛋白质纯化。

图1图示了本发明的优选实施方式的不同的细胞培养和收获步骤。D.唾液酸转移酶的纯化根据本发明的另外的方面，通过对培养基进行至少一次亲和色谱和/或一次混合模式色谱步骤和至少一次阴离子和/或阳离子交换色谱步骤从培养基纯化唾液酸转移酶多肽。在优选的实施方式中，纯化是按以下顺序完成的:
1.阴离子交换色谱，其浓缩含有酶的溶液，并且提供污染物例如DNA、宿主细胞蛋白质(HCP)和发酵培养基化合物的第一次减少； .第一次亲和色谱，其用作中间纯化步骤以富集唾液酸转移酶多肽并耗尽宿主细胞蛋白；ii1.第二次亲和色谱或混合模式色谱，其用于有效降低宿主细胞蛋白水平；和iv.阳离子交换色谱，其用于移除任何残余宿主细胞蛋白质和其他污染物。图2图示了本发明的优选实施方式的不同纯化步骤。1.阴离子交换色谱步骤根据本发明的实施方式，唾液酸转移酶多肽纯化过程包括阴离子交换色谱(AEC)步骤。5AEC依靠样品 中的蛋白和固定于树脂上的电荷之间的电荷-电荷相互作用。在阴离子交换色谱中，蛋白质的结合离子是负的，固定在树脂上的功能基团是正的。常用的阴离子交换树脂是Q树脂，季胺和DEAE树脂(二乙胺基乙烷)。然而，通常阴离子交换色谱步骤可用所有常见可商购的阴离子交换树脂或膜进行。阴离子交换树脂可以预装柱的形式使用。备选地，柱可以是自制的。除了常见的，诸如柱的容量和几何形状没有具体限制。本领域技术人员知晓，待使用的阴离子交换树脂的量取决于在捕获步骤中对柱施用的细胞培养物液体或任何其他液体(例如先前色谱步骤的洗脱液)的总体蛋白质含量。可用于本发明目的的典型的强阴离子交换树脂包含功能基团例如:季胺基乙基(QAE)部分、季铵(Q)部分和三甲基铵乙基(TMAE)基团。 具有季胺基乙基(QAE)部分的树脂包括例如，Toyopearl QAE (可从TosohBioscience,德国获得)、Selectacel QAE (纤维素的季胺基乙基衍生物,可从美国宾夕法尼亚Polysciences Inc.获得)等。具有季铵(Q)部分的树脂包括，例如Q Sepharose XL、QSepharose FF、Q Sepharose HP、Resource Q(可从GE Healthcare,德国获得)、Macro PrepHigh Q(Bio_Rad,美国加利福尼亚)、Toyopearl Super Q (可从 Tosoh Bioscience,德国获得)和UNOsphere Q(可从美国加利福尼亚Bio-Rad获得)。具有三甲基铵乙基(TMAE)基团的树脂包括，例如Fractogel EMD TMAE (可从Merck，德国获得)。阴离子交换色谱优选地是用具有N+(CH3)3功能基团的强阴离子交换树脂或具有类似性质的树脂进行的强阴离子交换色谱。可用于本发明目的的强阴离子交换树脂的优选的实例是季铵强阴离子交换树脂，如本领域所知的UNOsphere Q、Q Sepharose HP、QSepharose FF和其他具有季铵(Q)部分的树脂。在本发明的最优选的实施方式中，阴离子交换色谱是用可商购的Q-Sepharose Fast Flow树脂进行的。优选地用具有温和碱性pH的平衡缓冲液进行阴离子交换色谱步骤。适当的缓冲液包括例如，硼酸盐缓冲液、三乙醇胺/亚胺基二乙酸、Tris、醋酸铵、三羟甲基甲基甘氨酸(tricine)、二羟乙基甘氨酸(bicine)、TES、HEPES、TAPS。优选地使用Tris缓冲液，更优选地，缓冲液含有20mMTris，pH为7.6。用平衡缓冲液洗涤阴离子交换树脂一次或多次，并丢弃流通级分。通常是通过加入盐，优选地氯化钠，来增加流动相的电导率来完成从阴离子交换树脂洗脱。优选地，用pH在7.0和8.0之间的范围的NaCl/Tris-HCl缓冲液作为洗脱剂进行阴离子交换色谱。更优选地，洗脱缓冲液含800mM NaCl和20mM Tris/HCl，pH为7.6。I1.第一次亲和色谱步骤
根据本发明的实施方式，唾液酸转移酶多肽纯化过程包括亲和色谱步骤，其优选地是染料亲和色谱。在优选的实施方式中，纯化唾液酸转移酶多肽的方法包括单个亲和色谱步骤，更优选地单个亲和色谱步骤是染料亲和色谱步骤。染料亲和色谱基于固定化的染料对样品的蛋白质上的结合位点的高亲和性。使用具有作为固定化的配体的本领域技术人员熟知的染料化合物(例如Cibacron Blue F3G-A)的树脂进行染料亲和色谱的步骤。本领域技术人员充分理解术语“固定化的”，它表示以化学连接至树脂的方式衍生化配体。特别优选的树脂是Blue Sepharose FF (可从AmershamBiosciences Inc.获得)。应当理解，方法可用具有类似性质的备选树脂进行。备选树脂的实例包括:Toyopearl AF-blue-HC-650M(Tosoh Bioscience)、Toyopearl SuperButyl550>Toyopearl Phenyl650> Blue Cellthru BigBead(Sterogene)、SwellGel Blue (Pierce)、Cibachrome blue3GA-agarose 100 (Sigma) > Aff1-Gel Blue (BioRad)、Econo-Pac bluecartridges (Bio-Rad)、Blue sepharose HP (Amersham)、Cibacron Blue 3GA (Sigma)、Blue Sepharose 6FF (GE Healthcare)> ProSep PB (Millipore)> Methyl Sepharose 和 CDPSepharose(Calbiochem)。优选地用具有温和碱性pH的平衡缓冲液进行染料亲和色谱步骤。适当的缓冲液包括例如，MES、Bis-Tris, ADA、PIPES、ACES、BES, MOPS、TES, HEPES0 优选地，平衡缓冲液包含磷酸钾缓冲液和NaCl。更优选地，平衡缓冲液包含25mM磷酸钾缓冲液，pH7.5和50mMNaCl。用平衡缓冲液洗亲和树脂一次或多次，并丢弃流通级分。在更优选的实施方式中，用pH为7.0和8.0之间的范围的盐酸L-精氨酸/磷酸钾缓冲液作为洗脱液进行染料亲和色谱。最优选地，用含有500mM盐酸L-精氨酸和25mM磷酸钾，pH7.5的缓冲液洗脱蛋白质。II1.第二次亲和色谱步骤或混合模式色谱

根据本发明的实施方式，唾液酸转移酶多肽纯化过程包括如上文II所述的第二次亲和色谱步骤或混合模式色谱，优选地羟磷灰石色谱。羟磷灰石色谱是利用形成基质和配体的不可溶的羟基化的磷酸钙Caltl (PO4) 6 (OH) 2的混合模式色谱。功能基团由成对的带正电的钙离子(C位点)和成簇的带负电的磷酸盐基团(P位点)组成。羟磷灰石和蛋白质之间相互作用是复杂和多模式的。在一种相互作用方法中，蛋白质上带正电的氨基酸基团与带负电的P位点缔合，并且蛋白质上带负电的羧基基团通过配位络合作用与C位点相互作用(Shepard(2000) J.0f Chromatography 891:93-98)。结晶的羟磷灰石是色谱中使用的第一类羟磷灰石。陶瓷羟磷灰石色谱是羟磷灰石色谱的进一步发展。陶瓷羟磷灰石指羟磷灰石的形式，其中纳米晶体团聚成颗粒并且在高温融合以产生适于色谱应用的稳定的陶瓷微球体。陶瓷羟磷灰石的商业实例包括但不限于I 型 CHT 和 II 型 CHT。陶瓷羟磷灰石具有高耐久性，良好的蛋白质结合容量，并能够在比结晶的羟磷灰石更高的流速和压力下使用。(VoIa等人.(1993)BioTechniquesl4:650-655)。轻磷灰石已经被用于蛋白质、核酸以及抗体的色谱分离。在羟磷灰石色谱中，通常使柱平衡，并且在低浓度的磷酸盐缓冲液中施用样品，然后在磷酸盐缓冲液浓度梯度中洗脱被吸附的蛋白质(Giovannini, (2000)Biotechnology and Bioengineering73:522-529)。任何羟磷灰石树脂可用于实施根据本发明的方法的混合模式色谱步骤。在优选的实施方式中，其是在陶瓷羟磷灰石，例如I型或II型羟磷灰石树脂上进行的。羟磷灰石树脂可具有任何尺寸(例如20、40或80μπι)的颗粒。在极优选的实施方式中，陶瓷羟磷灰石树脂包含具有40 μ m尺寸的颗粒。特别适用的羟磷灰石树脂是以名称CHT I型陶瓷羟磷灰石，40μπι可商购的柱。平衡缓冲液优选地包含pH在6.3和7.3之间的磷酸钾缓冲液，更优选地，它包含5mM磷酸钾缓冲液，pH6.8。用平衡缓冲液洗羟磷灰石树脂一次或多次，并丢弃流通级分。在本发明更优选的实施方式中，使用pH在6.3和7.3之间的范围的NaCl/磷酸钾缓冲液作为洗脱剂进行羟磷灰石色谱。最优选地，洗脱缓冲液含有5mM磷酸钾缓冲液和IM NaCl，pH为6.8。IV.阳离子交换色谱步骤根据本发明的实施方式，唾液酸转移酶多肽纯化过程包括阳离子交换色谱(CEC)步骤。CEC依靠样品中的蛋白质和固定于树脂上的电荷之间的电荷-电荷相互作用。在阳离子交换色谱中，蛋白质的结合离子是正的，而固定化的功能基团是负的。常用的阳离子交换树脂是S树脂、硫酸盐衍生物和CM(羧甲基)树脂、羧基化的衍生的离子。然而，通常可用所有常见的可商购的阳离子交换树脂或膜进行阳离子交换色谱步骤。可以以其上固定了功能基团例如磺酸的预灌的柱或膜的形式使用阳离子交换树脂。备选地，柱可以是自制的。除了常见的，诸如柱的容量和几何形状没有具体限制。本领域技术人员知晓，待使用的阳离子交换 树脂的量取决于细胞培养物液体或任何其他液体(例如先前色谱步骤的洗脱液)的总体蛋白质含量。可以不同的名称和从多个供应商获得不同类型的阳离子交换材料，例如BiO-Rex.RTM.(例如 70 型)、Chelex.RTM.(例如 100 型),Macro-Prep.RTM.(例如 CM 型，High S 型，25S 型)、AG.RTM.(例如 50W 型、MP 型)(均可从 BioRad Laboratories 获得)；WCX2 (可从 Ciphergen 获得)、Dowex.RTM.MAC-3 (可从 Dow Chemical 公司获得)、Mustang C 和Mustang S (可从 Pall Corporation 获得)、Cellulose CM(例如 23 型、52 型)、hyper-D、parti sphere (可从 Whatman pic.获得)、Amberl ite.RTM.1RC (例如 76 型、747 型、748型)、Amberlite.RTM.GT 73、Toyopearl.RTM.(例如 SP 型、CM 型、650M 型)(均可从 TosohBioscience GmbH 获得)、CM 1500 和 CM 3000 (可从 BioChrom Labs 获得)、SP_Sepharose.TM.、CM-Sepharose.TM.(可从 GE Healthcare 获得)、多孔树脂(可从 PerSeptiveBiosystems 获得)、Asahipak ES(例如 502C 型)、CXpak P、IEC CM(例如 825 型、2825 型、5025 型、LG 型)、IEC SP(例如 420N 型、825 型)、IEC QA(例如 LG 型、825 型)(可从 ShokoAmerica Inc.获得)、50W阳离子交换树脂(可从Eichrom Technologies Inc.获得)。优选地，阳离子交换材料是强阳离子交换材料例如Macro-Prep.RTM.High S或25S、MacroCapSP、Toyopearl.RTM.SP 650M、Source S、SP Sepharose 或 P0LYCAT A。在本发明的优选实施方式中，用含有磺丙基阳离子交换材料的树脂或具有类似性质的树脂进行阳离子交换步骤。在本发明的最优选的实施方式中，阳离子交换色谱是用可商购的 SP-Sepharose High Performance 树脂进行的。
优选地使用具有温和酸性pH的平衡缓冲液进行阳离子交换色谱步骤。适当的缓冲液包括例如马来酸、丙二酸、柠檬酸、乳酸、甲酸、丁二酸、乙酸、磷酸盐、HEPES和BICINE。优选使用磷酸盐缓冲液，更优选地，平衡缓冲液含有25mM磷酸钾缓冲液，pH为6.0。用平衡缓冲液洗阳离子交换树脂一次或多次，并丢弃流通级分。通常通过加入盐，优选地氯化钠，来增加流动相的电导率来完成从阳离子交换树脂洗脱。优选地，用PH在6.0和7.0之间的范围的NaCl/磷酸钾缓冲液作为洗脱液进行阳离子交换色谱。更优选地，洗脱缓冲液含有250mM NaCl 和 25mM 磷酸钾，pH 为 6.0。V.进一步纯化步骤此外，方法能够包括过滤步骤。本领域技术人员熟知过滤过程，可使用所有常用方法。方法能够在其多个步骤中包括一次或多次超滤过程。方法能够包括纳米过滤，例如用于最终除去病毒。超滤是膜过滤形式，其中流体静压力迫使流体流向半透膜。悬浮的固体和高分子量的溶质被保留，而水和低分子量溶质通过膜。超滤是用于纯化和浓缩大分子溶液，特别是蛋白质溶液的常用的分离方法。超滤与纳米过滤类似，然而在其所保留的分子尺寸方面不同。在本发明的框架内，优选IOkDa的截断(cut-off)分子量(IOkDa UF)。UF膜也可用于渗滤，以通过反复或连续的稀释和再浓缩从溶液中移除盐和其他小种。优选地，纯化过程包括一个或多个超滤/渗滤步骤。这些过滤步骤能够在色谱步骤之前，之间和/或之后进行。优选地，一个渗滤步骤在色谱步骤之间进行，例如在混合模式色谱步骤和阳离子交换色谱步骤之间，并且一个超滤/渗滤步骤在色谱步骤之后进行。可以使用可商购的过滤装置，例如可从GE Healthcare或Sartorius获得的装置进行这些过滤步骤。优选地使用由Sartorius提供的Sartocon盒和Sartocon Slice盒进行超滤。E.生产的唾液酸转移酶多肽在另一方面，本发明提供由根据本发`明的任一方法生产的唾液酸转移酶多肽。在一个实施方式中，唾液酸转移酶多肽是缺少全部或部分唾液酸转移酶信号结构域、全部或部分唾液酸转移酶跨膜结构域，和/或全部或部分唾液酸转移酶茎结构域的截短的唾液酸转移酶多肽。在本发明的优选实施方式中，唾液酸转移酶多肽只包含唾液酸转移酶活性结构域，所述多肽是可溶的。在最优选的实施方式中，唾液酸转移酶是ST6GalNAcI，优选地来自鸡，最优选地唾液酸转移酶是根据SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的蛋白质。根据本发明的方法生产的唾液酸转移酶多肽与来自现有技术的唾液酸转移酶多肽相比具有多个优势。本发明的新的和改善的生产方法提供高活性、纯化到药物级和适于大规模生产的唾液酸转移酶多肽。术语“纯的”指基本或实质上不含下述组分的唾液酸转移酶多肽，所述组分通常伴随用于制备多肽的混合物中的材料，例如DNA或宿主细胞蛋白质。通常通过本发明的方法制备的唾液酸转移酶多肽至少98%纯，优选地至少99%纯。纯度是通过任何本领域认可的分析方法(例如银染胶上的带强度、聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC、RP-HPLC、ELISA或类似方法)确定的。术语“活性”指通过本发明的方法生产的唾液酸转移酶多肽的比活性，意为唾液酸转移酶的催化活性，即将唾液酸部分从供体分子转移到受体分子。
ST6GalNAcI的催化活性指将唾液酸部分通过α 2，6键从CMP-唾液酸转移到与糖蛋白的氨基酸苏氨酸/丝氨酸O-链接的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)残基上。比活性可以活性单位表示。如本文所用，在给定的受体-底物、温度和PH值下，一个活性单位每分钟催化形成I μ mo I的产品。在本发明中，ST6GalNAcI的比活性在5U/mg和10U/mg范围之间，优选地6U/mg至9U/mg,最优选地7U/mg至8U/mg。唾液酸转移酶活性可用已知方法确定。此类方法包括荧光测定，基于RP-HPLC的测定和放射性方法(Spiegel 等人，1992, T Chromatogr., 573 (I):23-7 ；Gross 等人，1990,Anal Biochem., 186 (I):127-34 ;Skretas 等人，2009, Microbial cell factories, 8:50)。F.唾液酸转移酶的用途在另外的方面，本发明包括用根据本发明的方法生产的ST6GalNacI用于治疗蛋白质的糖基化的用途，特别地用于人G-CSF、促红细胞生成素、IFN、hGH、FSH、胰岛素或抗体的糖-聚乙二醇化(glyco-PEGylation)。糖基转移酶ST6GalNacI是治疗蛋白质糖基化的必要试剂。此外，ST6GalNacI是研究和开发治疗上重要的糖肽和寡糖治疗剂的重要的试剂。本发明的经修饰的ST6GalNacI唾液酸转移酶用于体内和体外制备糖基化肽，以及用于生产含有特异性糖基残基的寡糖，所述特异性糖基残基可被本发明的经修饰的糖基转移酶所转移。ST6GalNacI多肽的经修饰的形式可具有与其全长多肽对应物可比的，并且在某些情况下超出其全长多肽对应物的生物活性。如本文所用的术语“糖基化”指通过由本发明的方法制备的唾液酸转移酶所酶促介导的经修饰的糖种类与多肽(例如促红细胞生成素肽)的氨基酸或糖基残基的缀合。糖基化的亚属是“糖缀合”和“糖-聚乙二醇化”，其中经修饰的糖的修饰基团是聚乙二醇、其烷基衍生物(例如m-PEG)或反应性衍生物(例如H2N-PEG、H00C-PEG)。如本文所用的“治 疗蛋白质”指向对象施用以治疗疾病或机能障碍或改善对象健康的蛋白质、肽、糖蛋白或糖肽。在优选的实施方式中对象是人。在另外的优选的实施方式中，治疗蛋白质是人蛋白质。在额外的实施方式中，治疗蛋白质被在CHO细胞中生产的一个或多个糖基转移酶糖基化或其他修饰。G-CSF (粒细胞集落刺激因子)是造血生长因子，它刺激造血前体细胞的增殖和分化，以及成熟嗜中性粒细胞的活化。G-CSF能在体外和体内支持嗜中性粒细胞增殖。人形式的G-CSF于1986年被来自日本和美国的小组克隆(参见例如Nagata等人，1986，Nature319 =415-418)。天然人糖蛋白以两种形式存在，一种具有174个氨基酸，另一种具有177个氨基酸。已经通过重组DNA技术将更丰富和更有活性的174个氨基酸的形式用于开发药物
女口
广叩ο以下实施例涉及截短的鸡ST6GalNAcI多肽的生产和纯化，并且仅供进一步说明本发明的方法。本发明的范围不应被理解为只由以下的实施例组成。
实施例1.表达盒的构建生成了表达盒用于表达ST6GalNAcI多肽，所述ST6GalNAcI多肽由在N端附着了 8个氨基酸的间插序列的、在氨基酸K232处N端截短的鸡糖基转移酶(α -N-乙酰-神经氨酸-2, 3-β -半乳糖基-1, 3-N-乙酸半乳糖胺α-2,6_唾液酸转移酶I)组成。用于表达的整个氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。为加入翻译起始信号并增加表达率，将编码截短的ST6GalNAcI多肽的核酸序列引入基因组人促红细胞生成素(EPO)表达盒，以取代EPO的编码序列。总体上,设计ST6GalNAcI转录单位含有下列元件:-EPO信号序列(由人促红细胞生成素外显子I [编码4个氨基酸]、内含子I和部分外显子2 [编码27个氨基酸:MGVHECPAWLWLLLSLLSL PLGLPVLG]组成);
_ST6GalNAcI和间插序列核苷酸序列(SEQ ID NO:5)；-人促红细胞生成素的3’_UTR，285bp ；-45bp的接头，具有5' -Not I位点；3’ -MunI位点是SV40序列的组成部分。基于如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，为了 CHO细胞中的密码子使用对成熟ST6GalNAcI的核苷酸序列进行优化。然而，源自基因组EPO序列的核苷酸未被改变并对应于天然人促红细胞生成素序列。获得的表达盒简称为EcST6。通过测序确认EcST6的核苷酸序列(SEQ ID NO:7) 0序列符合度为100%。2.表汰载体的构律将合成的EcST6片段作为Notl/Mnul片段克隆到表达载体pM0Z_G8中。此载体基于pSV2骨架，其含有赋予氨苄青霉素抗性的β内酰胺酶表达单位和PBR322复制起点作为原核元件，以及由SV40早期基因启动子和相应的SV403’_UTR驱动的真核选择标志物二氢叶酸还原酶(DHFR)。通过与CHO DHFR基因部分融合，对原始的小鼠DHFR选择标志物进行了修饰，以获得重组杂交DHFR(DHFRec)，其表现出对选择剂甲氨蝶呤(MTX)低10倍的亲和性。可以用更高量的MTX选择用DHFRec选择标志物转染的细胞，所述更高量的MTX首先阻断存在于先祖CHOSI CHO DHFR细胞系中的内源DHFR，并富集只携带源自质粒的DHFRec的遗传改变的细胞。基因表达受强mCMV启动子控制。mCMV启动子的下游是多克隆位点(MCS)和兔β球蛋白内含子，以及允许cDNA转录物高效表达的3’ UTR0盒插入载体PM0Z-G8是用PCR验证的。用表达载体pM07_G8EcST6转化大肠杆菌细胞。进行不同转化体的菌落筛选，并从所选择的克隆制备质粒DNA。为确认pM07-G8EcST6的身份，用DNA测序验证了整个核苷酸序列。3.CHO 细朐系为表达分泌形式的鸡ST6Gal_NAcI,使用中国仓鼠卵巢细胞系。用于生产ST6Gal-NacI的亲本细胞系是CH0SI4的衍生物，所述CH0SI4是已经适应在无血清和无蛋白质培养基中生长的二氢叶酸还原酶(dhfr)活性缺陷的中国仓鼠卵巢细胞系(CHO dhfr-)。宿主细胞系CH0SI4概述:-CHOS14 宿主细胞系源自 CHO dhfr- (ATCC 号 CRL-9096 ；ACC126 来自 DSMZ，德国Braunschweig)。-通过在MAM-PF2培养基中长期培养，使CH0SI4宿主细胞系适应于在化学限定的、无血清和无蛋白质培养基中生长。-CH0SI4的形态学为圆形。培养物作为单个细胞悬液生长。-使CH0SI4适应于在不含动物组分、化学限定的MAM-PF培养基中生长，此培养基不含血清、蛋白质或水解产物。然而，细胞系可以在其他可商购的无血清培养基中培养。-以每周1: 50的总分传比传代培养CH0SI4。细胞首先1: 20分传进入新瓶，并在4天后获得初始体积3/2的新鲜培养基。CH0SI4显示每天多于I的比生长速度(D >IxcT1)，并且在搅拌的培养物系统中，分批模式细胞密度为2xl06细胞/mL，而补料分批模式细胞密度为IxlO7细胞/mL。-向细胞培养基中添加附着因子或胎牛血清导致细胞形态学的变化，并且CH0SI4恢复为上皮层。4.细胞培养与收获融化细胞和在T烧瓶和旋转烧瓶中扩增接种物取出储存于液氮的气相中的一小瓶MCB，并在37±1°C的水浴中加热。通过离心到含有新鲜的，预热培养基的T烧瓶中收集细胞。通过在旋转烧瓶中的稀释和转种步骤完成进一步接种物扩增，所述旋转烧瓶中含有体积增加的培养基，至足以用作生物反应器中的种子的最终体积。种子生物反应器中的细胞扩增在旋转烧瓶中细胞扩增后，将接种物转移到种子生物反应器中并用新鲜培养基将体积扩增至IOL的最终工作体积。在种子生物反应器中培养细胞3天，直到已达到足以接种生产生物反应器的细胞数量。生产生物反应器中的培养在种子生物反应器中生长后，将种子生物反应器内容物无菌转移到生产生物反应器中，并且用新鲜培养基将转移的培养物扩大到最终工作体积。在达到活细胞> 1.5xl06活细胞/mL的预定的细胞密度后，将孵育温度从37°C ±1°C降低至32°C 土 1°C。通过补加浓度在4g/L和8g/L之间的葡萄糖溶液，将葡萄糖水平维持在限定的范围内。在生产生物反应器中的培养开始后14-17天终止发酵过程。收获和储存在终止发酵后，通过在无菌一次性袋中深度过滤收获物，清除生产生物反应器的细胞悬液中的细胞和碎片。用一次性深度滤器进行收获物的过滤。将收获物储存于2-8°C直至进一步的下游处理。5.钝化>钝化-实施例1用使用阴离子交换柱的捕获色谱步骤开始ST6GalNAcI的纯化过程。随后的纯化步骤包括亲和色谱、混合模式色谱、超滤/渗滤、阳离子交换色谱和通过I5nm Planova ,膜的最终纳米过滤。色谱步骤是使用梯度色谱系统进行的，并自动运行。用适当的软件记录在每个色谱步骤的UV吸收、电导率、pH、流速和反压力。使用的柱类型和树脂如表I所示:
权利要求
1.生产唾液酸转移酶多肽的方法，所述方法包括以下步骤: a)在CHO细胞中表达唾液酸转移酶多肽；收集含有经表达的唾液酸转移酶多肽的细胞培养基；和 b)通过对细胞培养基进行(i)至少一次亲和色谱和/或混合模式色谱步骤和(ii)至少一次阴离子交换色谱和/或阳离子交换色谱步骤，从细胞培养基纯化唾液酸转移酶多肽。
2.根据权利要求1的方法，其中唾液酸转移酶是ST6GalNAcI。
3.根据权利要求2的方法，其中ST6GalNAcI选自以下所组成的组:人、黑猩猩、猩猩、猪、牛、狗、大鼠、小鼠和鸡ST6GalNAcI。
4.根据权利要求3的方法，其中ST6GalNAcI是鸡ST6GalNAcI。
5.根据权利要求4的方法，其中ST6GalNAcI多肽包含根据SEQID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中唾液酸转移酶多肽只包含唾液酸转移酶活性结构域。
7.根据权利要求1至6中任一项的方法，其中编码EPO信号序列和唾液酸转移酶多肽序列的表达盒被用于在CHO细胞中表达唾液酸转移酶多肽。
8.根据权利要求1至7中任一项的方法，其中通过在达到预定的细胞密度后应用从370C +/_1°C至32°C +/ -1°C的孵育温度改变来实施步骤a)。
9.根据权利要求1至8中任一项的方法，其中步骤b)包括:(i)两次亲和色谱步骤或一次亲和色谱步骤和一次混合模式色谱步骤，( ) 一次阴离子交换色谱步骤和(iii) 一次阳离子交换色谱步骤。
10.根据权利要求1至9中任一项的方法，其中按以下顺序实施步骤b): 1.阴离子交换色谱； .第一次亲和色谱； ii1.第二次亲和色谱或混合模式色谱； iv.阳离子交换色谱；
11.根据权利要求1至10中任一项的方法，其中使用携带季铵作为功能基团的树脂进行阴离子交换色谱。
12.根据权利要求11的方法，其中使用pH处于7.0和8.0之间的范围的NaCl/Tris-HCl缓冲液作为洗脱剂实施阴离子交换色谱。
13.根据权利要求1至12中任一项的方法，其中使用染料亲和色谱实施第一次亲和色-1'TfeP曰。
14.根据权利要求13的方法,其中使用BlueSepharose Fast Flow树脂实施第一次亲和色谱。
15.根据权利要求14的方法，其中使用pH处于7.0和8.0之间的范围的盐酸L-精氨酸/磷酸钾缓冲液作为洗脱剂实施Blue Sepharose亲和色谱。
16.根据权利要求1至15中任一项的方法，其中使用羟磷灰石树脂实施混合模式色谱。
17.根据权利要求16的方法，其中使用pH处于6.3和7.3之间的范围的NaCl/磷酸钾缓冲液作为洗脱剂实施羟磷灰石亲和色谱。
18.根据权利要求1至17中任一项的方法，其中使用含有磺丙基阳离子交换材料的树脂进行阳离子交换色谱。
19.根据权利要求18的方法,其中使用SP-SepharoseHigh Performance树脂实施阳离子交换色谱。
20.根据权利要求19的方法，其中使用pH处于6.0和7.0之间的范围的NaCl/磷酸钾缓冲液作为洗脱剂实施阳离子交换色谱。
21.根据权利要求1至20中任一项的方法，其中按以下顺序实施步骤b): 1.使用Q-SepharoseFast Flow树脂的阴离子交换色谱； i1.使用BlueSepharose Fast Flow树脂的第一次亲和色谱； ii1.使用羟磷灰石树脂的混合模式色谱； iv.使用SP-SepharoseHigh Performance树脂的阳离子交换色谱；
22.通过根据权利要求1至21的任一项的方法生产的唾液酸转移酶多肽。
23.根据权利要求22的唾液酸转移酶多肽，所述唾液酸转移酶多肽至少98%纯。
24.根据权利要求22或23的唾液酸转移酶多肽，所述唾液酸转移酶多肽是ST6GalNAcI。
25.根据权利要求22至24中任一项的唾液酸转移酶多肽用于治疗多肽的糖基化或糖聚乙二醇化(glycopegylation)的用途。
26.根据权利要求25的用途 ，其中治疗多肽是人G-CSF。
全文摘要
本发明涉及生产和纯化唾液酸转移酶，特别是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)-α-2，6-唾液酸转移酶I(ST6GalNAcI)多肽的方法。方法包括在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中生产唾液酸转移酶多肽的步骤和用色谱步骤的组合纯化多肽的步骤。方法导致高产量的唾液酸转移酶多肽，所述唾液酸转移酶多肽是高纯度和活性的。获得的唾液酸转移酶，特别是ST6GalNAcI可用于治疗蛋白质例如G-CSF的糖基化。
文档编号C07K1/22GK103154017SQ201180047627
公开日2013年6月12日 申请日期2011年8月2日 优先权日2010年8月2日
发明者A·安格曼, C·谢克曼, K·施密特 申请人:拜奥吉耐里克斯有限公司