专利名称：新颖的唾液酸酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及新颖的唾液酸酶。
背景技术：
唾液酸包含约40种九碳神经氨酸衍生物的家族。其为具有2.2左右的 pKa的强有机酸。其未经取代的形式~~"神经氨酸在自然界中不存在。氨 基通常被乙酰化得到最普遍形式的唾液酸^N-乙酰基神经氨酸，但是同 样存在其它形式(Traving " a/ Cell Mol Life Sci (1998) 54, 1330-1349)。唾液 酸已在动物界从棘皮动物直到人类中被发现，但是在原口动物 (protostomate)谱系或植物中没有它们的存在迹象。唯一已知的例外是昆虫 Drosophila幼虫中多聚唾液酸的存在。另外，在一些原生动物、病毒和细 菌中存在唾液酸。唾液酸糖缀合物(Sialoglycoconjugates)存在于细胞表面以 及细胞内膜中。在高等动物中，它们也是血清和粘性物质的重要组分。
唾液酸具有多种生物学功能。因为唾液酸带负电荷，所以它们涉及对 带正电的分子(如钙离子)的结合和转运，以及细胞和分子之间的吸引和 排斥现象。除了它们的尺寸和负电荷之外，它们在碳水化合物链中暴露的 末端位置也使得它们能够对分子的亚末端部分或细胞发挥保护屏障的功 能。它们可例如防止糖蛋白被蛋白酶降解，或防止呼吸系统的粘膜层遭受 细菌感染。 一种有趣的现象是由于唾液酸负电荷之间的排斥力作用对唾液 酸的分子所施加的蔓延效应(spreading effect)。这使得酶或膜(糖)-蛋 白质的正确构象稳定，并且对粘性物质的粘性特质和例如在眼表面或粘性 上皮上引起的滑动和保护功能是重要的(Traving W Cell Mol Life Sci (1998) 54, 1330-1349)。显然，用合适的唾液酸酶处理这类含唾液酸的物质能够可 观地影响这类物质的生物学特性和物理特征。用唾液酸酶处理含唾液酸的 蛋白质能够使得它们更容易被蛋白酶降解，用唾液酸酶处理粘性物质可有力地减轻或消除它们的粘性特征。在这类蛋白质需要加工(例如蛋白酶 解)工业过程以获得例如蛋白质水解产物的情况下，这类改变是人们感兴 趣的。
唾液酸参与细胞和分子之间的大量识别过程。因此，免疫系统可根据 它们的唾液酸模式来区分自身和非自身的结构。糖代表抗原决定簇，例如 血型物质，并且是许多内源物质例如激素和细胞因子的受体的必需组分。 另外，许多致病剂如毒素(例如霍乱毒素)、病毒(例如流感)、细菌
(例如五scAen'c/n'a co/z' 、 //e/fcoZ7acter ; y/on') 禾口原生动物(例如 ro^fl^wome cn/d)也通过含唾液酸的受体结合宿主细胞。唾液酸识别分 子的另一重要种类属于凝集素，其通常是来自植物、动物和无脊椎动物的 结合特异糖残基的寡聚体糖蛋白。例子是小麦胚凝集素、Z/m"/w / o(vj: /iemws》疑集素、/S^m6i/ci^ m'gra》疑集素禾口 A/aacha 凝集素。
这些凝集素看起来能帮助植物抵御含有唾液酸的微生物或食用植物的哺乳 动物。凝集素的哺乳动物版本包括选择蛋白和涎免凝集素(siglecs) (Traving W a/ Cell Mol Life Sci (1998) 54， 1330-1349)，并且具有多种生理学 作用。唾液酸也可帮助掩蔽细胞和分子。红细胞被致密的唾液酸分子层覆 盖，所述唾液酸分子层在血细胞的生活周期中被逐步去除。代表降解信号 的倒数第二个半乳糖残基随后成为可见的，并且未被掩蔽的血细胞随后与 巨噬细胞结合并被吞噬。这类掩蔽策略的若干其它例子是已知的。掩蔽也 可能具有有害作用，如从一些肿瘤中可以看出的，所述肿瘤被唾液酸化到 比对应的组织高得多的程度。因此，被掩蔽的细胞是免疫防御系统不可见 的，并且高唾液酸含量也可在进一步细胞生长的抑制缺乏中和蔓延中发挥 作用。唾液酸的掩蔽效应还帮助隐藏寄生虫细胞上的抗原位点，使得它们 成为系统不可见的。这是针对微生物物种如某些￡ 菌株和淋病双球菌 (gonococci) (A/ez'训en'a go"wr/weae)的情况。用唾液酸酶处理这类物种会影 响它们从免疫系统隐藏的可能性。
唾液酸酶(神经氨酸酶，EC 3.2丄18)水解糖蛋白、糖脂、神经节苷 脂、多糖和合成分子中的末端非还原性唾液酸键。 一些被称作反式唾液酸 酶(transsialidases)的唾液酸酶也能够进行转移反应，其中它们将唾液酸残
5基从一个分子转移至另一个分子。唾液酸酶在后口动物谱系(棘皮动物到 哺乳动物)的动物以及大部分作为动物共生体或病原体存在的多种微生物 中是常见的。唾液酸酶及其唾液酰基底物显示在植物和大部分其它后生动 物中缺失。唾液酸酶甚至在细菌中也不规则地存在，从而相关物种或甚至 一个物种的相关菌株在所述特性上也有差异。在病毒和原生动物中也已发
现了唾液酸酶(Tmving " a/ Cell Mol Life Sci (1998) 54， 1330-1349)。含有唾
液酸酶的微生物通常例如作为寄生虫与作为宿主的高等动物接触生活。此 处它们可具有营养功能，所述功能使得它们的所有者以宿主的唾液酸为食 以用作碳源。对一些微生物病原体而言，唾液酸被认为发挥致病因子的作 用。然而，唾液酸作为致病因子的作用是有争议的。 一方面，它们证实了 病原微生物物种如C/oWn'^w/w/^z/nTzge^的影响。另一方面，这些酶是许 多非病原物种，包括高等生物的碳水化合物代谢中的常见因子。然而，它 们不显示直接的毒性效应(Traving W a/ Cell Mol Life Sci (1998) 54, 1330-1349)。取而代之，它们的有害作用取决于在非生理条件下被宿主唾液酸诱 导后与其它毒性因子一起被释放进宿主中的大量酶。
哺乳动物唾液酸酶的大小通常为约40-45 kDa。未曾报道将哺乳动物 唾液酸酶过表达和生产到有工业兴趣的量的尝试。人唾液酸酶可以是与溶 酶体、细胞质或膜结合的酶(Achyuthan and Achyuthan (2001 ) Comp. Biochem.Phys. Part B, 129,29-64)。溶酶体唾液酸酶是糖基化的酶。唾液酸 酶含有保守的基序。最突出的保守基序是所谓的Asp-框，其为通式-S-X-D-X-G-X-T-W-的氨基酸串，其中X代表可变的残基。所述基序在所有微 生物序列中存在四到五次，病毒唾液酸酶例外，在其中仅发现了一次或两 次，或甚至缺失。第三Asp-框比Asp-框2禾B 4更为保守。两个连续的 Asp-框之间的空间在不同的一级结构之间也是保守的(Tmving W a/ Cell Mol Life Sci (1998) 54, 1330- 1349)。 Asp-框可能具有结构作用并且可能不涉及 催化。与Asp-框相反，FRIP-基序位于氨基酸序列的N-端部分。其包含氨 基酸-X-R-X-P-，其中精氨酸和脯氨酸残基绝对保守。精氨酸通过与底物分 子结合直接涉及催化。对催化作用重要的还有asp-框3和4之间富含谷氨 酸的区域以及两个另外的精氨酸残基(Traving " a/ Cell Mol Life Sci (1998)
654, 1330-1349)。
微生物唾液酸酶可根据其大小被分为两组42 kDa左右的小蛋白质和 60-70 kDa的大蛋白质。大唾液酸酶的一级结构在N-端和第二 Asp-框之间 以及第五Asp-框和C-端之间含有额外的氨基酸片段。人们认为它们对大 唾液酸酶更广泛的底物特异性作出贡献。像哺乳动物唾液酸酶一样，细菌 的版本含有F/YRIP基序和若干个Asp-框。细菌唾液酸酶通常与粘膜感染 和毒性相关。因此，更大的细菌唾液酸酶被认为在食物或药物应用中不适 合用作加工助剂。如上所述，在细菌中已鉴定了小唾液酸酶(如哺乳动物 唾液酸酶的小尺寸)。即C/a^Www; w/n'wge/w含有大小为 40 kDa的小 唾液酸酶，没有在其它细菌中对唾液酸酶的常见扩展(extension)。然而， 所述C/(w/nWww唾液酸酶不由细菌分泌，因此也不涉及毒性(Roggentin W a/. (1995) Biol Chem Hoppe Seyler 376, 569-575)。推测只有具有额外扩展的 细菌唾液酸酶才涉及致病性，这是吸引人的。细菌唾液酸酶在五.co"中的 过表达通常导致低生产力；在五.co/,中小C7o愈Wwm唾液酸酶仅可作为细 胞内蛋白质被生产至1 mg/1 (Kruse " a/. (1996) Protein Expr Purif. 7, 415-422)。
Uchida "(Biochimica et Biophysica Acta, vol. 350， no. 2, 1974 pp 425-
431)描述了对被多聚乙酰神经氨酸诱导的微生物神经氨酸酶的筛选。在筛 选的1000个微生物中，从Sporotrichium schenckii、 Penicillium urticae禾口 Streptomyces sp.获得了神经氨酸酶。Penicillium urticae对食品级别的唾液 酸而言不是合适的生产生物，因为其是涉及食物酸败的真菌，而 Sporotrichium schenckii是致病真菌。细菌Streptomyces sp.的种名尚未确 定。所述文章中提到的唾液酸酶的MW是未知的。在Iwamori (J. Biochem. 138， pp327-334)中公开了细菌Arthrobacter ureafaciens唾液酸酶。 然而，已知所述细菌神经氨酸酶涉及HIV-l介导的合胞体形成和病毒结合/ 进入过程(Sun e"/， Virology 284, pp 26-36， 2001)。因此，人们明确需要被 良好生产的、小的、无毒唾液酸酶，用于食物和药物应用。
特别地，发现分泌性真菌唾液酸酶会是有益的，因为可容易地过表达 分泌性酶，并从真菌培养物中大量纯化。这会大大降低生产唾液酸酶的成本费用。
发明内容
本发明涉及具有唾液酸酶活性的经分离的多肽，其选自由以下组成的
组
(a) 具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 3的1 到407位氨基酸具有至少60%的氨基酸同一性；
(b) 由下述多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在低严格度条件下与(i) 或(ii)杂交，所述(i)为SEQ ID NO: 1或2的核酸序列，其在60个、优选地 100个核苷酸上至少80%或90%相同，更优选地在200个核苷酸上至少 90%相同，所述(ii)为与SEQIDNO: l或2的核酸序列互补的核酸序列。优 选地，多肽具有少于55 kDa的MW (分子量)(SDS-Page)，更优选地多肽 具有少于52 kDa的MW (分子量)(SDS-Page)，或多肽具有少于50 kDa 的MW (分子量)(以氨基酸序列为基础计算的)，更优选地多肽具有少 于45kDa的MW (分子量)(以氨基酸序列为基础计算的)。
另外，本发明提供了具有唾液酸酶活性并且无毒的多肽。本发明还有 一部分是具有唾液酸酶活性的下述多肽，所述多肽是具有少于55 kDaMW (分子量)(SDS-page)的真菌唾液酸酶，更优选地真菌唾液酸酶具有少于 52 kDa的MW (分子量)(SDS-Page)，或真菌唾液酸酶具有少于50 kDa的 MW (分子量)(以氨基酸序列为基础计算的)，更优选地真菌唾液酸酶 具有少于45kDa的MW (分子量)(以氨基酸序列为基础计算的)。
优选地，本发明的多肽具有下述氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 3的1到407位氨基酸具有至少65%、优选地至少70%、更优选地 至少80%、进一步更优选地至少90%、最优选地至少95%，和进一步最优 选地至少约97%的同一性。本发明还涉及包含下述核酸序列的经分离的多 核苷酸，所述核酸序列编码权利要求1的多肽，或在低严格度条件下、更 优选地在中 格度条件下、最优选地在高严格度条件下与SEQIDNO: 1或 2杂交。另外，本发明公开了下述核酸构建体，其包含与一个或多个控制 序列可操作地连接的本发明的多核苷酸，所述控制序列指导所述多肽在合适表达宿主中的生产。另外，本发明提供了包含所述核酸构建体的重组表 达载体和包含所述核酸构建体的重组宿主细胞。根据本发明的另一方面， 公开了生产本发明多肽的方法，所述方法包括培养如上所述的菌株/重组宿 主细胞，以生产包含所述多肽的上清液和/或细胞；和回收所述多肽。根据 本发明的又一方面，公开了生产本发明多肽的方法，包括在适合生产所述 多肽的条件下培养包含下述核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含
编码所述多肽的多核苷酸；和回收所述多肽。具有唾液酸酶活性的本发明 的多肽有利地是无毒的。本发明的多肽可用于制备食物或词料，或用作药 物或药物的部分。
发明详述
根据本发明，公开了小尺寸的唾液酸酶，其优选地具有少于55 kDa的 MW (分子量)(SDS-page)，更优选地所述多肽具有少于52 kDa的MW (分子量)(SDS-Page)，或公开了具有少于50 kDa的MW (分子量)(以 氨基酸序列为基础计算的)的唾液酸酶，更优选地所述多肽具有少于45 kDa的MW (分子量)(以氨基酸序列为基础计算的)。有利地，本发明 的唾液酸酶是胞外酶。另外，唾液酸酶优选地是源于真菌的。 一般而言， 本发明的多肽会具有多于35 kDa的MW (分子量)(SDS-page)，更优选地 多肽具有多于40 kDa的MW (分子量)(SDS-page)，或多肽会具有多于 35 kDa的MW (分子量)(以氨基酸序列为基础计算的)，更优选地多肽 具有多于40kDa的MW (分子量)(以氨基酸序列为基础计算的)。
外酶(exoenzyme)或胞外酶是由细胞分泌并在细胞外工作的酶。其 通常被用于分裂不被分裂时不能进入细胞的大分子。其为生物分泌进环境 中并在微生物外发挥作用的酶，外酶的对立面被称作内酶或胞内酶(来源 于Wikipedia)。
本发明人的理论是通常大唾液酸酶涉及粘膜感染和毒性，并因此不适 用于食物或药物应用。与之相反，小唾液酸酶被认为适用于食物或药物应 用。
然而，本发明并不确保或肯定该理论的正确性。本发明提供了具有少
9于55kDa的MW (分子量)(SDS-page)的胞外唾液酸酶，更优选地唾液酸 酶具有少于52 kDa的MW (分子量)(SDS-Page)，或提供了具有少于50 kDa的MW (分子量)(以氨基酸序列为基础计算的)的胞外唾液酸酶， 更优选地唾液酸酶具有少于45 kDa的MW (分子量)(以氨基酸序列为 基础计算的)。
本发明涉及新颖的唾液酸酶，其已在真菌c/ o^ogem/w中 被鉴定。
有利地，本发明满足了可被大量生产的唾液酸酶的要求。优选地，这 样的唾液酸酶由宿主细胞分泌。活性分泌对经济的生产工艺而言是极为重 要的，因为其使得能够以几乎纯净的形式回收酶而不进行繁冗的纯化过 程。这类由食品级别真菌宿主如^^e^7/w活性分泌的唾液酸酶的过表达 产生了食品级别的酶和具有成本效益的生产工艺，因此其是优选的。目前 分泌的唾液酸酶是第一次在丝状真菌中发现。本发明公开了用食品级别生 产宿主^^w^7/w m'gw大量生产唾液酸酶的工艺。
从经济的角度看，明确需要与哺乳动物和细菌唾液酸酶的差生产力相 比，以高数量和相对纯净的形式生产唾液酸酶的改进手段。这样做的一个 优选的方式是通过使用重组DNA技术过量生产这类唾液酸酶。实现此的 一个尤其优选的方式是通过过量生产真菌衍生的唾液酸酶来实现，这样做 的一个最优选的方式是通过过量生产尸emh7/z'twz衍生的唾液酸酶来实现。 为了使得能够进行后一生产途径，尸em'"7/^m衍生的唾液酸酶特有的序列 信息是必需的。更优选地，必须能够获得编码基因的完整核苷酸序列。
改进的以高数量和相对纯净的方式生产新鉴定的分泌性唾液酸酶的手 段是通过使用重组DNA技术过量生产尸e"W〃&m编码的酶。这样做的一 种优选的方式是通过在食品级别宿主微生物中过量生产这样的分泌性唾液 酸酶。公知的食品级别微生物包括J^wgz7/z' 、 7Wc/ o&rma 、 5Vre; fc m_ycas、 5a"'〃z'和酵母例如5"acc/^ra/n少ces禾口 veram少cas。这样做 的一种进一步更优选的方式是通过在食品级别真菌如」^e^7/M中过量生 产分泌的衍生的唾液酸酶。最优选的是在食品级别真菌中过量 生产分泌的唾液酸酶，其中已针对使用的食品级别表达宿主优化了唾液酸
10酶编码基因的密码子选择。通常，为了使得能够进行后一优化途径，分泌 性唾液酸酶的特有序列信息是需要的。更优选地，必须能够获得唾液酸酶 编码基因的整个核苷酸序列。 一旦在优选的宿主中转化编码分泌性唾液酸 酶的基因，则选择的菌株可被用于发酵和从发酵液中分离分泌性唾液酸酶 蛋白质。
一旦新颖的酶能够大量和以相对纯净的形式获得，则可以食品级别和 经济的方式制备具有改进的结构和/或免疫特性的食物、食品(如乳酪)、 蛋白质水解产物。酶也可能被用作防腐剂。通过从细菌壁上去除保护性唾 液酸残基，微生物将被免疫系统识别和消灭。
本发明的具有唾液酸酶活性的多肽可以是经分离的形式。如本文所定 义的，经分离的多肽是内源产生的或重组的多肽，其基本不含其它非唾液
酸酶多肽，并且典型地，通过SDS-PAGE测定为至少约20y。纯净，优选地 至少约40%纯净，更优选地至少约60%纯净，进一步更优选地至少约80% 纯净，仍然更优选地约90%纯净以及最优选地约95%纯净。可通过离心和 色谱方法分离多肽，或通过用于从粗制溶液中获得纯净蛋白质的本领域已 知的任何其它技术来分离。应当理解，多肽可与运载体或稀释剂混合，所 述运载体或稀释剂不影响多肽的预期目的，因此此种形式的多肽应当被认 为是分离的。其通常包括下述制剂中的多肽，其中，按制剂中的蛋白质重 量计，所述制剂中多于20%，例如多于30%、 40%、 50%、 80%、 90%、 95%或99%的多肽是本发明的多肽。
优选地，本发明的多肽可得自具有下述基因的微生物，所述基因编码 具有唾液酸酶活性的酶。更优选地，本发明的多肽由微生物分泌。进一步 更优选地，所述微生物是真菌，并且最好是丝状真菌。优选的供体微生物 因此是尸em'd肌t/m属的，例如是c/zo^ogem/m种的那些。在第 一个实施方案中，本发明提供了具有下述氨基酸序列并且具有唾液酸酶活 性的经分离的多肽，所述氨基酸序列与SEQIDNO:3 (即多肽)的1到 407位氨基酸具有至少60%、优选地至少70%、更优选地至少80%、进一 步更优选地至少90%、仍然更优选地至少95%和最优选地至少97%的氨基 酸序列同一性程度。就本发明的目的而言，两条或更多氨基酸序列之间的同一性程度通过
BLAST P蛋白质数据库搜索程序(Altschul W a/.， 1997, Nucleic Acids Research25: 3389-3402)测定，其中使用矩阵Blosum62和10的期望阈值。
本发明的多肽可包含SEQ ID NO:3中公开的氨基酸序列或基本同源的 序列，或具有唾液酸酶活性的任一序列的片段。通常，SEQIDNO:3中所 示天然存在的氨基酸序列是优选的。
本发明的一个方面是具有SEQ ID NO: 3中所示氨基酸序列的多肽，其 中信号序列被去除。分泌性酶如SEQ ID NO: 3的氨基酸序列通常被合成为 包含前序列或信号序列和/或原序列。这些序列通常在分泌过程期间或之后 从蛋白质上被去除。因此，成熟的分泌性蛋白质通常不再含有这些前序列 和原序列。因此，具有下述氨基酸序列并缺乏可能的前序列或原序列的多 肽是本发明的一部分，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 3的氨基酸1到407 具有至少60%的氨基酸序列同一性。SEQ ID NO: 3氨基酸序列中一个可能 的加工位点是在第33位氨基酸后。在该情况下根据本发明的成熟酶会在 第34位氨基酸处开始。由进一步加工引起的对SEQ ID NO: 3氨基酸序列 的其它修饰(例如氨基酸的去除)是允许的，只要它们不扰乱酶的活性即 可。
本发明的多肽还可包含SEQ ID NO: 3多肽的天然存在的变体或其物种 同源物。
变体是在例如真菌、细菌、酵母或植物细胞中天然存在的多肽，所述 变体具有唾液酸酶活性和与SEQ ID NO: 3蛋白质基本相似的序列。术语 "变体"是指下述多肽并且包括等位基因变体，所述多肽具有与SEQ ID NO: 3的唾液酸酶相同的关键特征或基本生物学功能。优选地，变体多肽 至少具有与SEQ ID NO: 3多肽相同的唾液酸酶活性水平。变体包括等位基 因变体，其来自与SEQ ID NO: 3多肽相同的菌株，或者来自与SEQ ID NO: 3多肽相同的属或种的不同菌株。
相似地，本发明蛋白质的物种同源物是相似序列的等同蛋白质，所述 蛋白质是唾液酸酶并且天然存在于另一物种中。
可使用本文所述的步骤分离变体和物种同源物，并在合适的细胞来源例如细菌、酵母、真菌或植物细胞上进行这类步骤。还可能的是使用本发 明的探针对由酵母、细菌、真菌或植物细胞制成的DNA文库进行探针检
测，从而获得表达SEQIDN0:3多肽变体或物种同源物的克隆。可用于分 离已知基因变体和物种同源物的方法在文献中被广泛描述，并且是本领域 技术人员已知的。可通过常规技术操作这些基因产生本发明的多肽，所述 多肽之后可通过本身已知的重组或合成技术生产。
也可对SEQ ID NO: 3多肽和变体与物种同源物的序列进行修饰，以提 供本发明的多肽。可进行从1、 2或3到10、 20或30个取代的氨基酸取 代。也可制造相同数量的缺失和插入。这些改变可在多肽功能关键性的区 域外进行，使得经修饰的多肽保留其唾液酸酶活性。
本发明的多肽包含上述全长多肽及其变体的片段，包括SEQ ID NO: 3 中公开的序列的片段。这类片段典型地应保留作为唾液酸酶的活性。片段 可以是至少50、 100或200个氨基酸长，或是SEQIDNO:3中所示全长序 列的该数量氨基酸的片段。
如果需要的话，可通过合成手段生产本发明的多肽，尽管通常它们会 如下文所述被重组制造。合成和重组的多肽可以被修饰，例如通过添加组 氨酸残基或T7标签以帮助其鉴定或纯化，或通过添加信号序列以促进其 从细胞分泌。
因此，变体序列可包括衍生自除下述菌株以外的尸抓'"7//騰菌株的变 体序列，SEQIDNO:3的多肽从所述菌株中分离。可如本文所述通过寻找 唾液酸酶活性并克隆和测序，从其它尸emW仏'謂菌株鉴定变体。变体可包 括蛋白质序列中单个氨基酸或氨基酸组的缺失、修饰或添加，只要肽保持 SEQ IDNO:3唾液酸酶的基本生物学功能即可。
可制造例如l、 2或3个到10、 20或30个取代的氨基酸取代。经修饰 的多肽通常会保留作为唾液酸酶的活性。可制造保守的取代；这类取代是 本领域公知的。
更短或更长的多肽序列也在本发明的范围内。例如，长度至少50个 氨基酸或多达100、 150、 200、 300、 400、 500、 600、 700或800个氨基 酸的肽被认为落入本发明的范围内，只要其展示SEQ ID NO:3的唾液酸酶
13的基本生物学功能性即可。具体地，但并非唯一地，本发明的这一方面包 括下述状况，其中蛋白质是完整蛋白质序列的一个片段。
本发明还涉及编码具有唾液酸酶活性的多肽的多核苷酸，所述多核苷
酸包含编码氨基酸SEQ ID NO: 3的多核苷酸序列。
对本发明而言，特别有关的是感兴趣的蛋白质被活性分泌进生长培养 基中。分泌性蛋白质通常是最初作为前蛋白质合成，随后前序列(信号序 列)在分泌过程期间被去除。分泌过程在原核生物和真核生物中是基本相
似的活性分泌性前蛋白质穿过膜，信号序列被特异的信号肽酶去除，成
熟蛋白质被(再)折叠。此外，针对信号序列， 一般结构可被识别。用于
分泌的信号序列位于前蛋白质的氨基端，并且通常长度为15-35个氨基 酸。氨基端优选地含有带正电的氨基酸，并优选地不含有酸性氨基酸。认 为该带正电的区域与膜磷脂的带负电的端基相互作用。该区域接下来是疏 水的跨膜核心区。该区域长度通常为10-20个氨基酸，并且主要由疏水氨 基酸组成。带电的氨基酸通常不存在于该区域中。跨膜区接下来是信号肽 酶的识别位点。识别位点由对小-X-小具有偏好的氨基酸组成。小氨基酸可 以是丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或半胱氨酸。X可以是任何氨基酸。使用这 样的原则写出了能够识别来自真核生物和原核生物的这类信号序列的算法 (Bendtsen， Nielsen,雨Heijne and Brunak. (2004) J. Mol. Biol" 340:783-795)。计算和识别蛋白质中信号序列的SignalP程序通常是可获得的 (http:〃www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。
可从经测序基因演绎的蛋白质序列中识别信号序列是与本发明相关 的。如果基因编码其中使用SignalP程序预测到信号序列的蛋白质，则该 蛋白质被分泌的可能性较高。
在第二个实施方案中，本发明提供了具有唾液酸酶活性并由下述多核 苷酸编码的经分离的多肽，所述多核苷酸在低严格度条件下、更优选地在 中严格度条件下、最优选地在高严格度条件下能够与以下杂交(i) SEQ ID NO:l的核酸序列，(ii)至少包含SEQ ID NO:l的部分的核酸片段，(iii)具有 与SEQ ID NO:l碱基不同的碱基的核酸序列，(iv)具有与SEQ ID NO:l互 补的核酸链的核酸序列。术语"能够杂交"表示本发明的靶多核苷酸能够以显著高于背景的水
平与用作探针的核酸(例如SEQ ID NO:l中公开的核苷酸序列或其片段， 或SEQIDNO:l的互补体或其片段)杂交。本发明还包括编码本发明唾液 酸酶的多核苷酸，以及与之互补的核苷酸序列。核苷酸序列可以是RNA 或DNA，包括基因组DNA、合成DNA或cDNA。优选地，核苷酸序列是 DNA，最优选地是基因组DNA序列。典型地，本发明的多核苷酸包含核 苷酸的连续序列，所述连续序列能够在选择性条件下与SEQIDNO: 1的编 码序列或编码序列的互补体杂交。可根据本领域公知的方法合成这类核苷 酸。
本发明的多核苷酸能够以显著高于背景的水平与SEQIDNO:2的编码 序列或编码序列的互补体杂交。背景杂交可例如由于cDNA文库中存在的 其它cDNA而发生。本发明多核苷酸和SEQ ID NO: 2的编码序列或编码 序列的互补体之间相互作用产生的信号水平典型地比其它多核苷酸和SEQ ID NO: 2编码序列之间的相互作用强至少10倍，优选地至少20倍，更优 选地至少50倍，进一步更优选地至少100倍。例如可通过放射性标记探 针，例如用32P标记探针来测量相互作用的强度。选择性杂交典型地可使 用低严格度条件(0.3 M氯化钠和0.03M柠檬酸钠在约4(TC下)、中严格 度(例如0.3M氯化钠和0.03M柠檬酸钠在约5(TC下)或高严格度(例如 0.3M氯化钠和0.03M柠檬酸钠在约6(TC下)实现。
本发明的多核苷酸还包括编码SEQ ID NO: 3多肽或其变体的合成基 因。有时，优选地，使基因密码子选择适应生产宿主中优选的偏好。设计 和构建合成基因的技术通常是可获得的(即 http:〃www.dnatwopointo.com/)。
修饰
本发明的多核苷酸可包括DNA或RNA。它们可以是单链或双链的。 它们也可以是其中包括合成或经修饰的核苷酸的多核苷酸，包括肽核酸。 对多核苷酸的大量不同类型的修饰是本领域已知的。这些修饰包括甲基磷 酸酯和硫代磷酸酯主链，分子3'和/或5'端吖啶或多聚赖氨酸链的添加。就
15本发明的目的而言，应当理解，可通过本领域能够获得的任何方法来修饰 本文所述的多核苷酸。
应当理解，技术人员可以使用常规技术制造不影响本发明多核苷酸编 码的多肽序列的核苷酸取代，以反映其中要表达本发明多肽的任何具体宿 主生物的密码子选择。
可通过例如l、 2或3个到10、 25、 50、 IOO或更多个取代的核苷酸取 代，来修饰SEQ ID NO: 2的编码序列。可通过一个或多个插入和/或缺失 和/或通过一端或两端的延伸，可选地或额外地修饰SEQ ID NO: 2的多核 苷酸。经修饰的多核苷酸通常编码具有唾液酸酶的多肽。可制造简并取代 和/或制造下述取代，所述取代在经修饰的序列被翻译时产生保守的氨基酸 取代，例如如下文关于多肽所讨论的。
同源物
能够与SEQ ID NO:2的DNA编码序列的互补体选择性杂交的核苷酸 序列被包括在本发明中，并通常在SEQ ID NO:2的至少60个、优选地至 少100个、更优选地至少200个连续核苷酸或最优选地在其全长的区域上 与SEQ ID NO:2的编码序列具有至少50%或60%、至少70%、至少 80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性。同样， 下述核苷酸也是本发明所包括的，所述核苷酸编码活性唾液酸酶并且能够 与SEQ ID NO:2的DNA编码序列互补体的片段杂交。
上述同一性程度和最小尺寸的任何组合可被用于定义本发明的多核苷 酸，更严格的组合(即在更长长度上的更高同一性)是优选的。因此，例 如在60个、优选地100个核苷酸上至少80%或90%相同的多核苷酸形成 了本发明的一个方面，在200个核苷酸上至少90%相同的核苷酸也一样。
可使用BLAST N算法来计算序列同一性或比对序列(例如鉴定等同 或对应的序列，例如在其默认设置上进行)。
公众可通过 National Center for Biotechnology Information (http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得用于进行BLAST分析的软件。该算法涉 及首先通过鉴定查询序列中长度为W的短词鉴定高评分序列对(HSPs)，
16所述短词与数据库序列中相同长度的词比对时匹配或满足一些正值的阈值
评分T。 T被称作邻域词评分阈值(neighborhood word score threshold)。这 些初始邻域词命中(neighborhood word hit)发挥种子的作用，起始了寻找含 有它们的HSP的搜索。词命中沿着各条序列在两个方向上延伸，直至能够 提高累积的比对评分。下述情况时停止各个方向上词命中的延伸累积的 比对评分从其达到的最大值下跌X的量；累积的评分达到零或以下，归因 于一个或多个负评分残基比对的累积；或达到任一序列的末端。BLAST算 法参数W、 T和X确定了比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用11的词 长(W)、 50的BLOSUM62品分矩阵比对(B)、 10的预期(E)、 M=5、 N=4 和两条链的比较作为默认值。
BLAST算法在两条序列之间进行相似性的统计学分析。BLAST算法 提供的一种相似性度量是最小概率和(P(N))，其提供了两条核苷酸或氨基 酸序列之间会随机发生匹配的概率的指征。例如，如果第一序列与第二序 列相比最小概率和少于约1、优选地少于约O.l、更优选地少于约O.Ol、最 优选地少于约0.001，则认为序列与另一序列相似。
引物和探针
本发明的多核苷酸包括引物并可被用作引物，例如作为聚合酶链式反 应(PCR)的引物，作为可选的扩增反应的引物，或作为例如使用放射性或 非放射性标签通过常规手段用揭示性标签标记的探针，或多核苷酸可被克 隆进载体中。这类引物、探针和其它片段长度应为至少15个、例如至少 20、 25、 30或40个核苷酸。它们典型地长度为至多40、 50、 60、 70、 100、 150、 200或300个核苷酸，或甚至多达比SEQ ID NO: 2的编码序列 短少许核苷酸(例如5或10个核苷酸)。
通常将通过合成手段生产引物，所述合成手段涉及一次一个核苷酸地 分步制造期望的核酸序列。实现该手段的技术和方案是本领域容易获得 的。更长的多核苷酸通常使用重组手段来产生，例如使用PCR克隆技术产 生。这会涉及制造用于扩增待克隆唾液酸酶期望区域的一对引物(典型地 约15-30个核苷酸)，将该引物与得自酵母、细菌、植物、原核生物或真菌细胞(优选地尸em'cZ〃&m菌株)mRNA、 cDNA或基因组DNA接触，在 适合扩增期望区域的条件下进行聚合酶链式反应，分离被扩增的片段(例 如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)并回收被扩增的DNA。引物可 以被设计为含有合适的限制性酶识别位点，从而可以将被扩增的DNA克 隆进合适的克隆载体中，如实施例l中所述。
备选地，可构建包含分泌性唾液酸酶或其变体的编码区域的合成基 因。可使用这些技术便利地设计和构建下述多核苷酸，所述多核苷酸在许 多位置上改变但是仍然编码相同的蛋白质。这具有下述优点密码子选择 可适应优选的表达宿主，从而改善宿主中蛋白质的生产力。还可改变基因 的多核苷酸序列，以改善mRNA稳定性或降低代谢。这可导致期望的蛋白 质或其变体的改进的表达。另外，可改变合成基因中的多核苷酸序列从而 在蛋白质序列中制造下述突变，所述突变对分泌效率、稳定性、蛋白水解 易损性、最适温度、比活性或蛋白质工业生产和应用的其它相关特性具有 积极的作用。提供构建合成基因和优化密码子选择服务的公司通常是可获 得的。
这类技术可被用于获得全部或部分编码本文所述唾液酸酶序列的多核 苷酸。内含子、启动子和拖尾(trailer)区属于本发明的范围内，并且也可以 从来自真菌、酵母、细菌植物或原核细胞的基因组DNA开始，以类似的 方式(例如通过重组手段、PCR或克隆技术)获得。
多核苷酸或引物可带有揭示性标签。合适的标签包括放射性同位素如 32P或35S、荧光标签、酶标签或其它蛋白质标签如生物素。这类标签可被 添加至本发明的多核苷酸或引物上，并可使用本领域技术人员已知的技术
、、带有标签或不带有标签的多核苷酸或引物(或其片段)可在基于核酸 的测试中被用于检测或测序真菌样品中的唾液酸酶或其变体。这类检测测 试通常会包括，在杂交条件下将怀疑含有感兴趣的DNA的真菌样品与包 含本发明多核苷酸或引物的探针接触，并检测探针和样品中核酸之间形成 的任何双链体。可使用如PCR的技术或如下实现检测将探针固定在固体 支持物上，去除样品中不与探针杂交的任何核酸，然后检测与探针杂交的任何核酸。或者可将样品核酸固定在固体支持物上，使探针杂交，并在去 除任何未结合的探针后检测与这类支持物结合的探针量。
本发明的探针可便利地以测试试剂盒的形式被包装在合适的容器中。 在这样的试剂盒中，探针可以与固体支持物结合，其中该试剂盒所设计的 测定模式需要这类结合。试剂盒也可含有合适的下述溶剂、对照溶剂、说 明书等，所述溶剂用于处理要被探针检测的样品、用于将探针与样品中的 核酸杂交。本发明的探针和多核苷酸也可以用于微量测定中。
优选地，本发明的多核苷酸可得自与多肽相同的生物，例如真菌，尤
其是^s/ ergW/ws属的真菌。
多核苷酸的生产
可以通过大量方式获得与SEQ ID NO: 2不具有100%同一性但是落入 本发明范围内的多核苷酸。因此，例如可通过对从多种生物制成的基因组 DNA文库进行探针检测获得本文所述的唾液酸酶序列的变体，所述生物例 如作为本发明多肽的来源被讨论的生物。另外，可获得唾液酸酶的其它真 菌、植物或原核生物同源物，并且这类同源物及其片段通常会能够与SEQ IDNO:l杂交。可如下获得这类序列在低、中到高严格度(如前文所 述)下用探针检测来自其它物种的cDNA文库或基因组DNA文库，并用 包含SEQ ID NO:l全部或部分的探针对这类文库进行探针检测。包含SEQ ID NO:l全部或部分的核酸探针可被用于对来自其它物种的cDNA或基因 组文库进行探针标记，所述物种例如被描述为本发明多肽来源的物种。
也可使用简并PCR获得物种同源物，所述简并PCR使用被设计为靶 向变体和同源物中序列的引物，所述变体和同源物编码保守的氨基酸序 列。所述引物可含有一个或多个简并位置，并且应在比下述条件更低的严 格度条件下使用，所述条件用于使用针对已知序列的单序列引物克隆序 列。
或者，可通过唾液酸酶序列或其变体的定点诱变获得这类多核苷酸。 例如当需要沉默密码子改变从而针对表达多核苷酸的具体宿主细胞来优化 密码子偏好时这可以是有用的。可制造其它序列改变从而引入限制性酶识
19别位点，或者改变多核苷酸编码的多肽的特性或功能。
本发明包括包含本发明的多核苷酸及其互补体的双链多核苷酸。 本发明还提供了编码上述本发明多肽的多核苷酸。因为这类多核苷酸
适合用作重组生产本发明多肽的序列，所以它们并不必须能与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的序列杂交，尽管通常这是所期望的。或者，期望时可 如上所述用标签标记、使用和制造这类多核苷酸。
重组多核苷酸
本发明还提供了包含本发明多核苷酸的载体，包括克隆载体和表达载 体，并且在另一方面中提供了将这类载体转化或转染进合适宿主细胞中的 方法，和例如在本发明多肽或本发明序列编码的多肽被表达的条件下培养 合适宿主细胞的方法。还提供了包含本发明多核苷酸或载体的宿主细胞， 其中所述多肽对宿主细胞的基因组是异源的。通常关于宿主细胞时，术语 "异源的"表示多核苷酸并非天然存在于宿主细胞的基因组中，或多肽并 非天然地由所述细胞生产。优选地，所述宿主细胞是酵母细胞(例如 A7w少veramycas、尸z'cA/a、 77<ms^"M/a或5"accAflro，ces属的酵母细胞)或丝 状真菌细胞(例如 J5/ erg〃/t 、 Pem'c〃/z'M n、 7Wc/joc/emza或Fwsan'wm的 属)。
载体
插入本发明表达盒的载体可以是可以便利地进行重组DNA步骤的任 何载体，并且载体的选择通常会取决于要引入所述载体的宿主细胞。因 此，载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复 制不依赖于染色体复制，如质粒。或者，载体可以是被引入宿主细胞中后 整合进宿主细胞基因组中并与整合了所述载体的染色体一起复制的载体。
优选地，当本发明的多核苷酸处于载体中时，其与能够提供宿主细胞 对编码序列表达的调节序列有效连接，即载体是表达载体。术语"有效连 接"是指一种并列(juxtaposition)，其中所述组分处于允许它们以其预期的 方式发挥功能的相互关系中。与编码序列"有效连接"的调节序列例如启动子、增强子或其它表达调节信号以下述方式放置，所述方式使得在生产 条件下达成编码序列的表达。
例如在质粒、粘粒、病毒或噬菌体载体的情况下，载体可具有复制起 点，任选地具有用于多核苷酸表达的启动子，任选地具有增强子和/或启动 子的调节子。可存在终止子序列，如多聚腺苷酸化序列。载体可含有一个 或多个可选择标记物基因，例如在细菌质粒的情况下含有氨苄青霉素抗性 基因，或对哺乳动物载体而言含有新霉素抗性基因。载体可体外使用(例
如用于生产RNA)，或可以被用于转染或转化宿主细胞。
编码多肽的DNA序列优选地作为表达构建体的部分被引入合适的宿 主中，所述表达构建体中DNA序列与能够指导DNA序列在宿主细胞中表 达的表达信号有效连接。对于用表达构建体转化合适的宿主细胞而言，可 获得本领域技术人员公知的转化步骤。表达构建体可作为带有可选择标记 物的载体的部分被用于转化宿主，或表达构建体作为独立的分子与带有可 选择标记物的载体一起被共转化。载体可含有一个或多个可选择标记物基 因。
优选的可选择标记物包括但不限于补偿宿主细胞中缺陷或赋予药物抗 性的标记物。它们包括例如可用于转化大部分丝状真菌和酵母的万能标记 物基因，例如乙酰胺酶基因或cDNA (来自爿.m'卤/a似、A0/7加e或 的amdS、 niaD、 facA基因或cNDA)，或提供对抗生素抗性如G418、潮 霉素、博来霉素、卡那霉素、腐草霉素或苯菌灵(benomyl)抗性的基因 (benA)。或者可使用特异的选择标记物，如需要相应突变体宿主菌株的营 养缺陷型标记物例如URA3 (来自5".cewWW^或来自其它酵母的类似物 基因)、pyrG或pyrA (来自 AmV/w/ara或Aw&er) 、 argB (来自 AwW"/a朋或A"&w)或trpC。在一个优选的实施方案中，在引入表达构 建体后选择标记物从经转化的宿主细胞中被删除，从而获得下述经转化的 宿主细胞，其能够生产不含选择标记物基因的多肽。
其它标记物包括ATP合成酶亚基9(oliC)、乳清苷-5'-磷酸盐-脱羧酶 (pvrA)、细菌G418抗性基因(适用于酵母，但是不适用于丝状真菌)、氨 节西林抗性基因(五.co/Z)、新霉素抗性基因(^^7/氾)和编码葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的五.co/z'uidA基因。载体可体外使用(例如用于生产RNA)，或转 染或转化宿主细胞。
对大部分丝状真菌和酵母而言，表达构建体优选地被整合进宿主细胞 基因组中，从而获得稳定的转化体。然而，对某些酵母而言，也可获得合 适的附加型载体体系，可将表达构建体整合进所述附加型载体体系中，得 到稳定和高水平的表达。其例子包括分别衍生自^cc/^ramyc^和 《/w少vwom少cas的2 /mi 、 CEN和pKDl质粒，或含有AMA序列(例如来 自A^e^7/w的AMA1)的载体。表达构建体被整合进宿主细胞基因组中 时，构建体被整合进基因组中的随机基因座上，或使用同源重组整合在预 定的耙基因座上，在后一情况下耙基因座优选地包含高度表达的基因。高 度表达的基因是其mRNA例如在被诱导的条件下可占总细胞mRNA至少 0.01 % (w/w)的基因，或是其基因产物可占总细胞蛋白质至少0.2% (w/w) 的基因，或者在分泌性基因产物的情况下可以被分泌到至少0.05 g/1水平 的基因。
针对给定宿主细胞的表达构建体通常会从编码第一方面多肽的序列的 编码链5'-端到3'-端依次含有彼此有效连接的以下元件(l)能够指导编码 多肽的DNA序列在给定的宿主细胞中表达的启动子序列，(2)优选地，5'-非翻译区(前导区)，(3)任选地，能够指导多肽从给定的宿主细胞分泌进 入培养基中的信号序列，(4)编码多肽成熟形式和优选地编码多肽活性形式 的DNA序列，优选地还含有(5)能够在编码多肽的DNA序列下游终止转 录的转录终止区。
在编码多肽的DNA序列下游，表达构建体优选地含有3'非翻译区， 其含有一个或多个转录终止位点，也称作终止子。终止子的起源较不重 要。终止子例如可以对编码多肽的DNA而言是天然的。然而，优选地在 细菌宿主细胞中使用细菌终止子，在酵母宿主细胞中使用酵母终止子，在 丝状真菌宿主细胞中使用丝状真菌终止子。更优选地，终止子对表达编码 多肽的DNA序列的宿主细胞而言是内源的。
也可以通过选择异源调节区例如启动子、信号序列和终止子区来实现 编码本发明多肽的多核苷酸的增强的表达，所述异源调节区发挥下述作用提高表达，和需要时提高所选的表达宿主对感兴趣的蛋白质的分泌水 平，和/或提供本发明多肽表达的诱导型控制。
除了可使用对编码本发明多肽的基因而言天然的启动子以外，可以使 用其它启动子指导本发明多肽的表达。可针对启动子指导本发明多肽在期 望的表达宿主中表达的效率选择启动子。
启动子/增强子和其它表达调节信号可被选择为与宿主细胞相容，表达 载体针对所述宿主细胞设计。例如可使用原核启动子，尤其是适合在 菌株中使用的原核启动子。在哺乳动物中进行本发明多肽的表达 时，可使用哺乳动物启动子。也可以使用组织特异型启动子例如肝细胞特
异的启动子。也可以使用病毒启动子，例如Moloney鼠白血病病毒长末端 重复序列(MMLV LTR)、劳斯氏肉瘤病毒(RSV) LTR启动子、SV40启动 子、人巨细胞病毒(CMV) IE启动子、单纯疱疹病毒启动子或腺病毒启动 子。
合适的酵母启动子包括51. cewv&ae GAL4禾P ADH启动子和X ;wm^ nmtl和adh启动子。哺乳动物启动子包括可应答重金属(如镉)而被诱导 的金属硫蛋白启动子。也可使用病毒启动子例如SV40大T抗原启动子或 腺病毒启动子。所有这些启动子是本领域可容易获得的。
可以使用哺乳动物启动子，例如/3-肌动蛋白启动子。组织特异型启动 子，尤其是内皮或神经元细胞特异型启动子(例如DDAHI和DDAHII启 动子)是特别优选的。也可以使用病毒启动子，例如Moloney鼠白血病病 毒长末端重复序列(MMLV LTR)、劳斯氏肉瘤病毒(RSV) LTR启动子、 SV40启动子、人巨细胞病毒(CMV) IE启动子、腺病毒HSV启动子(例如 HSVIE启动子)或HPV启动子，尤其是HPV上游调节区(URR)。病毒启 动子是本领域可容易获得的。
可使用能够在本发明的宿主细胞中指导转录的多种启动子。优选地， 启动子序列衍生自如前文定义的高度表达的基因。优选的高度表达的基因 的例子包括但不限于编码糖酵解酶例如磷酸丙糖异构酶(TPI)、磷酸甘油醛 脱氢酶(GAPDH)、磷酸甘油酸酯激酶(PGK)、丙酮酸激酶(PYK)、醇脱氢 酶(ADH)的基因，以及编码淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、
23纤维二糖水解酶、卩-半乳糖苷酶、醇(甲醇)氧化酶、延伸因子和核糖体蛋白质，所述高度表达的基因是启动子优选的来源和/或包含在用于整合表达构建体的优选的预定靶基因座中。合适的高度表达基因的特异例子包括
例如来自《/i<yverawj;cas w.的LAC4基因，分别来自//a"^肌/a禾f]尸z'c/^a的甲醇氧化酶基因(AOX和MOX)，来自爿.m'ger和Aawamon'的葡萄糖淀粉酶(glaA)基因，爿.oo^ae TAKA-淀粉酶基因，爿.m'^/朋s gpdA基因禾口/或7Veewz'纤维二糖水解酶基因。
真菌表达宿主中优选使用的强组成型和/或诱导型启动子的例子是可得自真菌木聚糖酶(xlnA)、植酸酶、ATP-合成酶亚基9 (oliC)、磷酸丙糖异构酶(tpi)、醇脱氢酶(AdhA)、淀粉酶(amy)、淀粉葡萄糖苷酶(AG-来自glaA基因)、乙酰胺酶(amdS)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd)基因的启动子。
可使用的强酵母启动子的例子包括可得自醇脱氢酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、乳糖酶、3-磷酸甘油酸酯激酶、质膜ATPase (PMA1 )和磷酸丙糖异构酶基因的启动子。
可使用的强细菌启动子的例子包括淀粉酶和SPo2启动子，以及来自细胞外蛋白酶基因的启动子。
可使用的适用于植物细胞的启动子包括napaline合酶(nos)、章鱼碱合酶(ocs)、甘露碱合酶(mas)、核酮糖小亚基(rubisco ssu)、组蛋白、水稻肌动蛋白、菜豆蛋白、花椰菜花叶病毒(CMV)35S和19S和环病毒启动子。
载体还可包含多核苷酸侧翼序列，其给出包含与下述序列同源的序列的RNA，所述序列来自真核基因组序列、优选地来自真菌基因组序列或酵母基因组序列。这会允许通过同源重组将本发明的多核苷酸引入真菌或酵母的基因组中。具体地，包含侧翼是真菌序列的表达盒的质粒载体可被用于制备下述载体，所述载体适用于将本发明的多核苷酸递送至真菌细胞。使用这些真菌载体的转化技术是本领域技术人员已知的。
载体可含有以反义方向定向的本发明多核苷酸，从而提供反义RNA
的生产。期望时这可被用于降低多肽的表达水平。
24宿主细胞和表达
在又一方面中，本发明提供了制备本发明多肽的工艺，所述工艺包括在适合编码多肽的编码序列的载体表达的条件下，培养用如上所述的表达载体转化或转染的宿主细胞，并回收所表达的多肽。本发明的多核苷酸可以被整合进重组的可复制载体例如表达载体中。载体可被用于在相容的宿主细胞中复制核酸。因此在又一个实施方案中，本发明提供了制造本发明多核苷酸的方法，所述方法如下实现将本发明的多核苷酸引入可复制载体中、将载体引入相容的宿主细胞中，并在使得载体复制的条件下培养宿主细胞。合适的宿主细胞包括细菌如五.co/z'、酵母、哺乳动物细胞系和其它原核细胞系，例如昆虫细胞如Sf9细胞和(例如丝状)真菌细胞。
优选地，多肽作为分泌性多肽被生产，在这种情况下表达构建体中编
码成熟形式多肽的DNA序列可与编码信号序列的DNA序列有效连接。在野生型菌株中编码分泌性蛋白质的基因具有信号序列的情况下，优选地使用的信号序列对编码多肽的DNA序列而言是天然的(同源的)。或者，信号序列对编码多肽的DNA序列而言是外来的(异源的)，在这种情况下信号序列优选地对其中表达所述DNA序列的宿主细胞而言是内源的。适用于酵母宿主细胞的合适信号序列的例子是衍生自酵母MFce基因的信号序列。类似地，丝状真菌宿主细胞的合适信号序列是例如衍生自丝状真菌淀粉葡萄糖苷酶(AG)基因，例如Am'gwglaA基因的信号序列。该信号序列可与淀粉葡萄糖苷酶(也称作(葡萄糖)淀粉酶)启动子自身组合使用，以及与其它启动子组合物使用。在本发明的范畴中，也可以使用杂种信号序列。
优选的异源分泌前导序列是源于真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(glaA -18和24氨基酸两种版本，例如来自JwwgW/M) 、 MFa基因(酵母，例如Sacc/wram少cas、尸/cA&禾口 A^j/verawj/cw)或a-淀粉酉每基因(5ad〃w力的分泌前导序列。
可如上所述将载体转化或转染进合适的宿主细胞中，提供本发明多肽的表达。该工艺可包括在适合多肽表达的条件下培养用如上所述的表达载体转化的宿主细胞，并任选地回收所表达的多肽。因此本发明的又一方面提供了用本发明多核苷酸或载体转化或转染，或包含本发明多核苷酸或载体的宿主细胞。优选地，多核苷酸由载体携带，所述载体允许多核苷酸的复制和表达。细胞应当被选择为与所述载体相容，并且可例如是原核(例如细菌)细胞，或真核的真菌、酵母或植物细胞。
本发明包括借助于编码多肽的DNA序列的重组表达来生产本发明多肽的工艺。为此，本发明的DNA序列可被用于基因扩增和/或交换表达信号，例如启动子、分泌信号序列，从而允许在合适的同源或异源宿主细胞中经济地生产多肽。同源宿主细胞在本文中被定义为对衍生DNA序列的物种而言是相同物种或是相同物种变体的宿主细胞。
合适的宿主细胞优选地是原核微生物例如细菌，或更优选地是真核微生物例如真菌(例如酵母或丝状真菌)或植物细胞。通常，酵母细胞相对于丝状真菌细胞而言是被优选的，因为它们更容易操作。然而， 一些蛋白质或者较差地被酵母分泌，或者在一些情况下不被正确加工(例如酵母中的过糖基化)。在这些情况下，应当选择丝状真菌宿主生物。
来自^z"7/m属的细菌是非常适合作为异源宿主的，因为它们能够将蛋白质分泌进培养基中。其它适合作为宿主的细菌是来自5Vr印tom少c^和尸ww&mo"w属的细菌。用于表达编码多肽的DNA序列的一种优选的宿主细胞是SaccAaramyd vm ，ces、祝ra^w/a、尸z'流a、 yixrraw/a或Mz-薦flccA,m;;cas属之一。更优选地，酵母宿主细胞选自5"accA腳，asce厂evWae、尺/t(yveram^yces /acto (也己失卩为《/wyvwomjcas marxz'flwwi1 var./acto )、 他w5^wtz/a j5o/，c^/ a 、 尸z'c&a jt flwtoWs 、 7am w/a /—一ca禾口5"c/n'zosacc/ arow^cas / om6e的禾中。
然而，用于表达编码多肽的DNA序列最优选的是丝状真菌宿主细胞。优选的丝状真菌宿主细胞选自^s^ergz'〃w、 7Wc/ o&rma、」FMsahMm、
ora^7'c/mm 、 尸em'c/〃Zwm 、 Jcremom'Mm 、 TVewmspora 、 7^erwofiwctw 、AfycWop/ tora、 5^ora^7'cA謂、7T^'e/謂'a禾口 ra/aramycas的属。更优选地，丝状真菌宿主细胞是爿5pergi〃tw o少z"e、 Aperg〃/ws —ae或y^/ erg〃/ws
组(由Raper and Fennell定义，
26The Genus爿，rgi〃MS， The Williams & Wilkins Company, Baltimore, pp 293-344, 1965 )的种。这些包括但不限于^spergW/M m'ger、 ^s; wgW/j^
yberic^、 Aj! erg/〃MS w^w/aws、 A/ erg7'〃t^ y'apom'ciAS1、 A/ ergz7/tfS o，ae禾口Js/ ergzY/w51 ， 以及 7>7.c/ ofiferma reaseZ 、 ^Fusan'w附graAwz.wearMm 、
fi ZmorpAos/ on/m禾口 7Tn'e/aWfl termsWs的禾中。
本发明范围内优选的表达宿主的例子是真菌例如J^e^7/M的种(尤其是EP-A-184，438和EP-A-284,603中所述的那些)禾tl JWcAo&mw的种；细菌例如5fl"7to的种(尤其是EP-A-134,048和EP-A-253，455中所述的那些) ， 特另U是 5acz'〃ws swto'fo 、 5acz7/ws /z'cAemybrm^ 、 5a"'〃tw"m少/o/z々w咖cz'e"s 、 jRsewJo附o"as的禾中；禾口酵母例如《/wyveram少cay的禾中(尤其是EP-A-096,430中所述的那些，例如f/wyveramj/c" /acto，禾卩EP-A-301,670中所述的那些)禾Q 5^cc/wramj;c^的种，例如5^cc/wram;;cM
根据本发明的宿主细胞包括植物细胞，因此本发明扩展至含有一个或多个本发明细胞的转基因生物，例如植物以及植物的部分。细胞可异源地表达本发明的多肽，或可异源地含有一个或多个本发明的多核苷酸。因此，转基因(或经遗传修饰的)植物的基因组中可(典型地稳定地)插入编码本发明多肽的序列。植物细胞的转化可使用已知的技术进行，例如使用来自v4graZ^"en'wm /wme/ac^w的Ti或Ri质粒。因此质粒(或载体)可含有感染植物必需的序列，并可使用Ti和/或Ri质粒的衍生物。
宿主细胞可过表达多肽，用于工程改造以过表达的技术是公知的，并可用于本发明中。宿主可因而具有两个或更多个拷贝的多核苷酸。
或者，可进行植物一部分例如叶、根或茎的直接感染。在这种技术中，可以例如通过用刀片切割植物、用针穿刺植物或用磨料摩擦植物，使得要被感染的植物受伤。然后用^graZ^c^n'wm接种伤口。然后可将植物或植物部分在合适的培养基上培养，并允许其发育成为成熟的植物。可使用已知技术，例如通过使用抗生素选择经转化的嫩枝，或通过将嫩枝移种在含适当营养素、植物激素等的培养基上，实现经转化的细胞到经遗传修饰的植物的再生。
宿主细胞的培养和重组生产
本发明还包括己经被修饰为表达唾液酸酶及其变体的细胞。这类细胞包括被瞬时或优选稳定地修饰的高度真核细胞系例如哺乳动物细胞或昆虫细胞，或低等真核细胞例如酵母和丝状真菌细胞，或原核细胞例如细菌细胞。
还可在细胞系中，或膜上例如杆状病毒表达体系中，瞬时表达本发明的多肽。被改造以适于表达本发明蛋白质的这类体系也包括在本发明的范围内。
根据本发明，可如下实现本发明多肽的生产在常规营养发酵培养基中培养用一个或多个本发明多核苷酸转化的微生物表达宿主。
可使用本领域已知的步骤培养根据本发明的重组宿主细胞。对于启动子和宿主细胞的每个组合而言，可以获得有益于表达编码多肽的DNA序
列的培养条件。达到期望的细胞密度或多肽滴定度(titre)后，停止培养并使
用已知步骤回收多肽。
发酵培养基可包括已知的下述培养基，所述培养基含有碳源(例如葡萄糖、麦芽糖、糖蜜等)、氮源(例如硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等)、有机氮源(例如酵母提取物、麦芽提取物、蛋白胨等)和无机养分(例如磷酸盐、镁、钾、锌、铁等)。任选地，可包含或随后添加诱导剂(取决于使用的表达构建体)。
对适当培养基的选择可基于对表达宿主的选择和/或表达构建体的调节需求。合适的培养基是本领域技术人员公知的。如果需要的话，培养基可含有额外的组分，所述组分对经转化的表达宿主的偏好超过其它可能污染的微生物。
发酵可在0.5-30天的周期中进行。发酵可以是分批、连续或补料分批的过程，处于0'C和45'C之间范围内的合适温度下，处于例如2到10的pH下。优选的发酵条件包括2(TC和37'C之间范围内的温度，和/或3和9 之间的pH。适当的条件通常以表达宿主的选择和要被表达的蛋白质为基 础进行选择。
如果需要的话，发酵后，可借助于离心或过滤，将细胞从发酵液中取 出。发酵停止或去除细胞后，可随后回收本发明的多肽，需要时通过常规 手段纯化和分离。本发明的唾液酸酶可从真菌菌丝体或培养液中分离，经 培养的真菌细胞将唾液酸酶分泌进所述培养液中。
在一个优选的实施方案中，多肽由真菌生产，更优选地由A^wg说^ 生产，最优选地由A戸g/〃ws生产。
修饰
本发明的多肽可以被化学修饰，例如被翻译后修饰。例如，它们可以 被糖基化(一次或多次)或包含经修饰的氨基酸残基。也可以如下对其修 饰通过添加组氨酸残基帮助其纯化，或通过添加信号序列促进其从细胞
中分泌。多肽可具有氨基端或羧基端延伸，例如氨基端甲硫氨酸残基、至
多约20-25个残基的小连接子肽、或简化纯化的小延伸如多聚组氨酸道、 抗原表位或结合结构域。
可以用揭示性标签标记本发明的多肽。揭示性标签可以是允许检测多 肽的任何合适的标签。合适的标签包括放射性同位素例如125I、 35S，酶， 抗体，多核苷酸和连接子如生物素。
多肽可以被修饰为包含非天然存在的氨基酸，或被修饰以提高多肽的 稳定性。当通过合成手段生产蛋白质或肽时，可在生产期间引入这类氨基 酸。也可以在合成或重组生产后修饰蛋白质或肽。
也可以使用D-氨基酸生产本发明的多肽。在这样的情况下，氨基酸应 以反向序列在C到N的方向上连接。这在生产这类蛋白质或肽的领域中是 常规的。
大量侧链修饰是本领域己知的，并可对本发明蛋白质或肽的侧链进行 这类修饰。这类修饰包括例如下述氨基酸修饰通过与醛反应然后用 NaBH4还原的还原烷基化，用乙亚氨酸甲酯(methylacetimidate)进行的二次氨基化(amidination)，或用乙酸酐进行的酰化。
本发明提供的序列也可被用作构建"第二代"酶的起始材料。"第二 代"唾液酸酶是被诱变技术(例如定点诱变或基因改组技术)改变的唾液 酸酶，其具有与野生型唾液酸酶或重组唾液酸酶例如本发明产生的唾液酸 酶不同的特性。例如，它们的温度或最适pH、比活性、底物亲和力或热 稳定性可以被改变，从而更好地适合在具体工艺中使用。
可根据本领域已知的步骤例如定点诱变或丙氨酸-扫描诱变来鉴定下述 氨基酸，所述氨基酸是本发明唾液酸酶活性所必需的并因而优选地经历取 代。在后一技术中，在分子中的每个残基处引入突变，并针对生物活性 (例如唾液酸酶活性)测试得到的突变分子，以鉴定对分子活性而言必需 的氨基酸残基。也可以通过分析晶体结构测定酶-底物相互作用位点，所述 晶体结构通过例如核磁共振、晶体学或光亲和标记的技术测定。
基因改组技术提供了在多核苷酸序列中引入突变的一种随机方式。表 达后，将具有最佳特性的分离物(isolate)再分离、组合和再次改组，以提高 遗传多样性。通过将该步骤重复多次，可以分离编码被持久(fastly)改进的 蛋白质的基因。优选地，用编码具有相似功能的蛋白质的基因家族开始进 行基因改组步骤。本发明提供的多核苷酸序列家族应当非常适合进行基因 改组，以改进分泌性唾液酸酶的特性。
或者可使用经典的随机诱变技术和选择(例如用NTG处理诱变或UV 诱变)来改进蛋白质的特性。可对经分离的DNA直接进行诱变，或对用 感兴趣的DNA转化的细胞进行诱变。或者可通过本领域技术人员已知的 大量技术向分离的DNA中引入突变。这些方法的例子是易错PCR、在重 复-不足的宿主细胞中扩增质粒DNA等。
期望酵母和丝状真菌宿主细胞的使用提供翻译后修饰(例如蛋白酶解 加工、十四烷基化、糖基化、截短和酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化)， 所述翻译后修饰是对本发明的重组表达产物赋予最佳生物活性所需要的。
纖
本发明的多肽可以是任何经分离的形式。应当理解，多肽可与不干扰
30多肽预期目的的运载体或稀释剂混合，并且仍然被认为是经分离的。本发 明的多肽也可以是基本纯化的形式，在这种情况下多肽通常包含于下述制
剂中，所述制剂中大于70%，例如大于80%、 90%、 95%、 98%或99%的
蛋白质是本发明的多肽。
本发明的多肽可以存在于其天然细胞环境外的形式提供。因此，它们 可以如上所述是基本分离或纯化的，或处于它们天然不存在于其中的细胞 例如其它真菌物种、动物、植物或细菌的细胞中。
唾液酸酶活性的去除或恢复
本发明还涉及生产亲本细胞的突变细胞的方法，所述方法包括破坏或 删除编码多肽的内源核酸序列或其控制序列，这产生比亲本细胞生产更少 所述多肽的突变细胞。
可通过修饰或失活细胞中唾液酸酶表达所必需的核酸序列，便利地实 现具有降低的唾液酸酶活性的菌株的构建。要被修饰或失活的核酸序列可 以例如是，编码多肽或其显示唾液酸酶活性必需的部分的核酸序列，或核 酸序列可具有从核酸序列的编码序列表达多肽所需的调节功能。这样的调 节或控制序列的一个例子可以是启动子序列或其功能性部分，即足以影响 多肽表达的部分。可能的修饰的其它控制序列包括但不限于前导序列、多 聚腺苷酸化序列、原肽序列、信号序列和终止序列。
可如下进行核酸序列的修饰或失活对细胞进行诱变并选择其中唾液
酸酶生产能力被降低或消除的细胞。可如下进行特异或随机的诱变，例如 通过使用合适的物理或化学诱变剂，通过使用合适的寡核苷酸，或通过对
DNA序列进行PCR诱变。另外，可通过使用这些诱变剂的任何组合进行 诱变。
适用于该目的的物理或化学诱变剂的例子包括紫外(UV)辐照、羟胺、 N-甲基-NL硝基-N-亚硝基胍(NTG)、 O-甲基羟胺、亚硝酸、乙基甲垸磺酸 酯(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。
使用这类试剂时，典型地如下进行诱变在合适的条件下在存在选择 的诱变剂时孵育要诱变的细胞，并选择显示降低的唾液酸酶活性或无唾液31酸酶活性表达的细胞。
可通过在编码多肽的核酸序列或其转录或翻译所需的调节元件中引 入、替换或去除一个或多个核苷酸，实现本发明多肽生产的修饰或失活。 例如，可插入或去除核苷酸从而导致终止密码子的引入、起始密码子的去 除或开放读码框的改变。这类修饰或失活可根据本领域已知的技术，通过 定点诱变或PCR诱变实现。
尽管原则上在体内进行修饰，即直接对表达要被修饰的核酸序列的细 胞进行修饰，但是优选如下文所示例性地那样来在体外进行修饰。
失活或减少选择的宿主细胞对唾液酸酶的生产的便利方式的一个例子
是以基因替代或基因中断(interruption)为基础的。例如在基因中断方法中， 体外诱变对应于感兴趣的内源基因或基因片段的核酸序列，从而生产有缺 陷的核酸序列，所述核酸序列随后被转化进宿主细胞中，产生有缺陷的基 因。通过同源重组，有缺陷的核酸序列代替了内源基因或基因片段。优选 地，有缺陷的基因或基因片段也编码标记物，所述标记物可被用于选择其 中编码多肽的基因已被修饰或破坏的转化体。
或者可使用与多肽编码序列互补的核苷酸序列，通过已确立的反义技 术达成编码本发明多肽的核酸序列的修饰或失活。更特定地，可通过引入 与编码多肽的核酸序列互补的核苷酸序列，减少或消除细胞对多肽的生 产。反义多核苷酸随后典型地在细胞中被转录，并且能够与编码唾液酸酶 的mRNA杂交。在允许互补的反义核苷酸序列与mRNA杂交的条件下， 细胞中生产的唾液酸酶量会被减少或消除。
优选地，待根据本发明的方法被修饰的细胞是微生物来源的，例如是 适合生产期望的蛋白质产物的真菌菌株，所述蛋白质产物对细胞而言是同 源的或异源的。
本发明还涉及亲本细胞的突变细胞，其包含编码多肽的内源核酸序列 或其控制序列的破坏或删除，这产生比亲本细胞生产更少多肽的突变细 胞。
藉此创建的多肽不足突变细胞尤其适合用作表达同源和/或异源多肽的 宿主细胞。因此，本发明还涉及用于生产同源或异源多肽的方法，所述方法包括(a)在有助于生产多肽的条件下培养突变体细胞；和(b)回收多肽。在
本发明上下文中，术语"异源多肽"在本文中被定义为由于通过重组 DNA技术操作宿主细胞造成的，对宿主细胞而言并非天然的多肽、其中进 行修饰以改变天然序列的天然蛋白质、或其表达在数量上被改变的天然蛋 白质。
还在又一方面中，本发明提供了通过发酵下述细胞生产基本不具有唾 液酸酶活性的蛋白质产物的方法，所述细胞生产本发明的唾液酸酶多肽以 及感兴趣的蛋白质产物。所述方法包括在发酵期间或发酵完成后向发酵液 中添加有效量的能够抑制唾液酸酶活性的试剂，从发酵液中回收感兴趣的 产物，和任选地对所回收的产物进行进一步纯化。或者在培养后可对得到
的培养液进行pH或温度处理，从而大量降低唾液酸酶活性，并允许从培 养液中回收产物。可对从培养液中回收的蛋白质制剂进行组合的pH或温
度处理。
用于生产基本不具有唾液酸酶活性的产物的本发明方法在真核多肽的 生产中、尤其在真菌蛋白质如酶的生产中是尤其重要的。唾液酸酶缺陷的 细胞也可不用于表达具有食品工业价值或药物价值的异源蛋白质。
乳酪制造和乳凝固
凝固是从乳组合物如牛乳到乳酪的传统生产中的一个关键步骤。可通 过酸化和/或添加酶(凝固剂)如凝乳酶原起始凝固。凝固后乳被分为凝乳 和乳清。凝乳被进一步加工为乳酪。
从多种乳来源制造乳酪的工艺是长期已知的，并针对许多不同种类的
乳酪变体详细描述(见例如Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology, Vol 1 &2, 1999， Ed. Fox, Aspen Publications, Gaithersburg, Maryland; Encyclopedia of Dairy Sciences Vol 1 -4， 2003, Academic Press, London)。
乳酪制造中一个关键点是凝固的过程，其中酪蛋白微团和亚微团的溶解度 被降低。酶诱导的凝固是非常常用的。已描述了酶如小牛凝乳酶原(calf chymosine)、凝乳酶原的微生物等同物和来自其它来源的其它酶，并且其 中若干种能够以不同的商品名获得。它们均能够被用于起始凝固过程。凝
33固中的基本步骤是k-酪蛋白中Phe朋-Me^6键的切割。这导致k-酪蛋白C-端部分糖巨肽(glycomacropeptide， GMP)的去除。GMP的去除导致酪蛋白微 团的结合，即酪蛋白凝固。酪蛋白凝固导致凝胶形成，并且在具体乳组合 物中获得凝胶化所需的时间与凝固剂的活性直接相关。
添加凝固剂和出现最初的酪蛋白絮凝之间经过的时间被定义为凝固时 间。乳酪乳中凝胶形成的速度和凝胶的紧实度密切地取决于添加的酶量、 钙离子的浓度、磷、温度和pH。开始凝固后形成凝胶，并且凝胶的稠度 随着微团间键的增加而提高。微团聚集并且凝块接触，从而排出乳清。该 现象已知为脱水收縮(syneresis)，并通过切割凝乳、提高温度和提高发育的 乳酸菌产生的酸度而被加速。
添加凝固剂和开始切割凝胶以起始脱水收縮之间的时间在本文的剩余 部分被称作凝化时间(curdling time)。凝化时间对特定乳酪制造工厂中具体 的乳酪变种而言是恒定的，尽管可以因为例如乳或凝固剂的品质改变而发 生小的变化(至多5-10%)。在许多乳酪制造工厂中，凝化时间是工艺中 的限速步骤。凝化时间降低时，工厂可以将更多的乳加工为凝乳，所述凝 乳随后被进一步加工为乳酪。因此凝化时间的降低是具有经济利益的，并 且存在对这类降低的凝化时间的需要。
可以通过若干种方式降低凝固时间，例如增加添加的凝固剂、降低乳 的pH或提高添加的氯化钙。然而这些溶液未被广泛应用于乳酪制造工 业，因为它们对乳酪的品质有负面影响。提高的凝固剂水平常由于不平衡 的蛋白酶活性而导致苦味的形成。乳pH的降低产生品质差的凝乳，并常 常导致产量的损失。提高的氯化钙浓度对口味有负面影响，并常常受法规 的限制。目前不能获得降低凝化时间而不具有负面副作用的方法。
酪蛋白微团抗拒聚集的稳定性在聚集过程中是极为重要的。k-酪蛋白 在酪蛋白微团稳定化中起关键作用。位于微团表面的k-酪蛋白链的亲水并 带负电的C-端部分负责位阻和静电排斥，所述位阻和静电排斥防止微团酪 蛋白的凝固(Minkiewicz " a/， Pol J Food Nutr Sci (1993) 243, 39-48)。 k-酪蛋 白是在已知位置上含有唾液酸残基的糖蛋白(Cases w J Food Sci (2003) 68， 2406-2410; Fournet " a/, Biochim Biophys Acta (1979) 576, 339-346)。已
34知基于k-酪蛋白的种群中由于糖基化和唾液酸含量的不同而存在微-异质
性(Robitaille " a/， Food Res lnt (1995) 28， 17-21 ; Robitaille d a/, J Dairy Res (1991 ) 58, 107-1 14)。若干种研究描述了使用衍生自C/o &Mm ; w/n'"ge似的唾液酸酶去除唾液酸残基的作用。被检査的参数是酪蛋白微 团抵抗热和凝乳酶降解的稳定性。Gibbons " "/ (Biochim Biophys Acta (1962) 56, 354-356)使用经纯化的zc-酪蛋白的溶液并显示唾液酸残基的去除 不影响凝乳酶对k-酪蛋白的作用。Vreeman " "/ (Biochem J (1986) 240, 87-97)比较了凝乳酶对经纯化的k-酪蛋白级分(经过或未经过糖基化)的动 态行为，并且发现去糖基化的k-酪蛋白对凝乳酶而言是更好的底物。 Minkiewicz " a/ (Pol J Food Nutr Sci (1993), 243, 39-48)还使用人工重建的酪 蛋白微团体系显示唾液酸残基有助于酪蛋白微团的热稳定性，这之后由 Robitaille " a/ (Food Res lnt (1995) 28, 17-21)证实。在独立的研究中， Robitaille ^ a/ (Food Res lnt (1993) 26， 365-369)显示从k-酪蛋白上去除唾液 酸残基对凝固时间没有显著影响，但是凝乳硬度降低。尚未描述具有降低 的凝化时间但是不影响乳酪特性的乳酪制造工艺，并且这仍然是一种工业 需要。
近来的专利申请(EP1370146)描述了一种工艺，其中单一的糖苷酶(包 括N-乙酰神经氨酸酶)被用于使乳凝块。在所述构型中不使用酶凝固剂。 凝固剂的省略打开了备选的乳酪制造工艺的道路，但是对于传统的乳酪制 造工艺而言其为没有吸引力的工艺，因为(蛋白水解)凝固剂是乳酪中蛋 白水解体系的重要部分，其导致特征性风味化合物的形成(见例如Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology, Vol 1 &2, 1999, Ed. Fox, Aspen Publications, Gaithersburg， Maryland; Encyclopedia of Dairy Sciences Vol 1 -4, 2003， Academic Press, London for references on the role of chymosin in cheese flavour formation)。
在本文上下文中，术语"乳酪"是指任何种类的乳酪，例如天然乳 酪、乳酪类似物和经加工的乳酪。可通过本领域已知的任何合适方法获得 乳酪，例如通过用粗制凝乳酶对乳组合物进行酶凝固，或通过用食品级别 的酸或通过乳酸菌生长生产的酸对乳组合物进行酸凝固。在一个实施方案中，乳酪是粗制凝乳酶-凝乳乳酪。可对乳组合物进行常规的乳酪制作过 程。经加工的乳酪优选地是通过使用乳化盐(例如磷酸盐和柠檬酸盐)对 乳酪进行烹饪和乳化，从天然乳酪或乳酪类似物制造而来的。该工艺可进 一步包括添加香料/调味品。
术语"乳酪类似物"是指乳酪样制品，其含有脂肪(例如乳脂(例如 奶油))作为组合物的部分，并且还含有非乳成分例如植物油作为组合物 的部分。乳酪包括乳酪的所有变种，如软乳酪、半硬乳酪和硬乳酪。在乳 酪制造中，优选地单独通过粗制凝乳酶或通过酸化进行乳组合物的凝固， 所述粗制凝乳酶和酸化分别得到粗制凝乳酶-凝乳和酸-凝乳乳酪。法式酸-凝乳乳酪是指通过酸化或酸和热的组合使乳、奶油或乳清凝固而生产的乳 酪变种，并且所述乳酪变种在制造完成后即可消耗而不需熟化。法式酸-凝
乳乳酪与粗制凝乳酶-凝乳乳酪变种(例如Camembert、 Cheddar、 Emmenthal)的差异通常在于凝固通常在pH值6.4-6.6下由粗制凝乳酶 的作用诱导，因为凝固通常在接近酪蛋白等电点时发生，即例如在pH4.6 下发生或当使用提高的温度时在更高值下发生(即例如在Ricotta中典型地 在约6.0的pH和典型地约8(TC的温度下)。在一个优选的实施方案中， 乳酪属于粗制凝乳酶凝乳乳酪种类。
乳组合物可以是包含牛乳成分的任何组合物。乳成分可以是乳的任何 成分，如乳脂、乳蛋白、酪蛋白、乳清蛋白和乳糖。乳级分可以是乳的任 何级分，例如脱脂乳、酪乳、乳清、奶油、乳粉、全乳粉、脱脂乳粉。在 一个优选的实施方案中，乳组合物包括乳、脱脂乳、酪乳、全乳、乳清、 奶油或其任何组合。在一个更优选的实施方案中，乳组合物由乳组成，所 述乳例如脱脂乳、全乳、奶油或其任何组合。在其它实施方案中，乳组合 物完全或部分由干燥的乳级分制备，所述干燥的乳级分例如全乳粉、脱脂 乳粉、酪蛋白、酪蛋白酸盐、全乳蛋白或酪乳粉，或其任何组合。乳组合 物包含牛乳和一种或多种牛乳级分。牛乳级分可来自任何牛品种(Sos rat/ms (Bos toMn/s townw」、5as z'wdz'c船(Sos z'wdz'cwi1 towra力及其杂交禾中。在 一个实施方案中，乳组合物包含来源于两种或更多牛品种的牛乳和/或牛乳 级分。乳组合物还包含用于制备乳酪的来自其它哺乳动物的乳，例如来自山羊、水牛或骆驼的乳。可通过去除全部或部分任何生牛乳组分和/或通过 向其中添加额外量的这些组分，将用于生产乳酪的乳组合物标准化为期望 的组合物。这可例如通过在抵达奶场后将乳分离为奶油和乳来完成。因 此，可如常规所做的，通过对乳分级并重组级分来制备乳组合物，从而获 得期望的乳组合物的最终组成。分离可在产生下述脱脂乳级分和奶油的连 续离心中完成，所述脱脂乳级分具有非常低的脂肪含量(即<0.5%)，所
述奶油具有例如>35%的脂肪。可通过将奶油和脱脂乳混合，制备乳组合
物。在另一实施方案中，可通过使用超滤来标准化蛋白质和/或酪蛋白含 量。乳组合物可以具有被发现适用于要通过本发明方法制造的乳酪的任何 总脂肪含量。
可在乳酪制造之前和/或期间的任何适当的步骤向乳组合物中添加钙， 例如在添加起始培养物之前、同时或之后进行。在一个优选的实施方案 中，在热处理之前和之后均添加钙。钙可以以任何合适的形式被添加。在
一个优选的实施方案中，作为钙盐如CaCl2来添加钙。可向乳组合物添加 任何合适量的钙。被添加的钙浓度通常会在0.1-5.0 mM的范围内，例如在 1和3 mM之间。如果向乳组合物添加CaCl2,则用量通常会在每100升乳 组合物1-50 g的范围内，如每100升乳组合物5-30 g的范围内，优选地在 每100升乳组合物10-20 g的范围内。
可通过常规步骤降低脱脂乳的细菌计数。在本发明的一个实施方案 中，例如在Danish蓝乳酪的生产中，可在生产乳酪之前对乳组合物进行匀 化过程。
通过以下的实施例来阐述本发明。
实施例 实施例1
唾液酸酶基因ZJW的克隆和表达 将尸ew'c"/z't/w cAo^oge"ww菌株Wisconsin 54-1255 (ATCC28089)在30 。C下于PDB (马铃薯葡萄糖发酵液，Difco)中培养3天，并使用Q-Biogene试剂盒(产品目录号6540-600 ; Omnilabo International BV，Breda;荷兰)按照供应商说明书从菌丝体中分离染色体DNA。使用 PCR，使用该染色体DNA，来扩增唾液酸酶基因的编码序列。
为了明确地鉴定来自尸em'c/〃/ww c/ o^oge"wm菌株Wisconsin 54-1255 (ATCC28089)染色体DNA的唾液酸酶基因ZJW，设计两种PCR引物。引 物序列部分得自下述序列，所述序列存在于尸em'"'仏'ww c/z^ oge"ww Wisconsin 54-1255 (ATCC28089)的基因组DNA中并示于SEQ ID NO: 1 中。我们发现该序列与放线菌属和节杆菌属的唾液酸酶序列具有同源性。 然而，未曾描述同源的真菌唾液酸酶。因此我们能够发现编码来自真菌的 分泌性唾液酸酶的基因是令人惊讶的。我们在本文中首次描述了分泌性真 菌唾液酸酶的有效表达和表征。完整唾液酸酶蛋白质的蛋白质序列，包括 前序列和原序列，展示于SEQ ID NO: 3中。与细菌同源物相比，真菌酶的 优点是真菌酶可容易地以食品工业应用相关量被过表达和分泌。
Zjw-dir
Zjw-rev
5'-TTAGGCGCGCCGTACATACATGTACACATAGACC
第一条正向PCR引物(ZJW-dir)含有23个核苷酸ZJW编码序列，从 ATG起始密码子开始，后面是23个核苷酸序列，包含PmI限制性位点 (SEQ ID NO:4)。第二条反向引物(ZJW-rev)含有与ZJW编码序列下游区域 反向链互补的核苷酸，后面是Acl限制性位点(SEQ ID NO:5)。使用这些 弓l物,我们會S够用来自尸ew'c"/Zw附c/w^^ogem/m菌株Wisconsin 54-1255 (ATCC28089)的染色体DNA作为模板扩增1.4 kb大小的片段。分离由此 获得的1.4 kb大小的片段，用尸acl和Acl消化并纯化。将包含ZJW编码 序列的尸fld/AscI片段与来自pGBFIN-5的尸acI/AcI j^少A片段(WO 99/32617)交换。得到的质粒是称作pGBFINZJW的ZJW表达载体(见图 1)。通过用A^I消化将表达载体pGBFINZJW线性化，所述A/o/l消化从 表达载体上去除了所有衍生自五.co/z'的序列。经消化的DNA使用苯酚:氯 仿:异戊醇(24:23:1 )萃取纯化，并用乙醇沉淀。这些载体被用于转化 As/ erg"/t^CBS513.88。 ^rpergZ〃1^ m'ger转化步骤在WO 98/46772中
38广泛描述。还描述了如何在含有乙酰胺的琼脂平板上选择转化体和选择被靶向的多拷贝整合体。优选地，选择含有多拷贝表达盒的A m'gw转化体
用于进一步产生样品材料。对pGBFINZJW表达载体而言，纯化30个Am'gw转化体；首先将个体转化体涂布在选择性培养平板上，然后将单个菌落涂布在PDA (马铃薯葡萄糖琼脂PDB + 1.5%琼脂)平板上。在30°C生长1周后收集个体转化体的孢子。将孢子冷冻储存并用于接种液体培养基。
含有多拷贝表达盒的A 菌株被用于生产样品材料，所述生产通
过在摇瓶培养物中培养菌株进行。WO 98/46772中描述了用于培养A菌株和从培养液中分离菌丝体的一种有用的方法。培养基是CSM-MES(每升培养基150 g麦芽糖、60 g Soytone (Difco)、 15 g (NH4)2S04、 1 gNaH2P04'H20、 1 g MgS04.7H20、 1 g L画精氨酸、80 mg Tween-80、 20 gMESpH6.2)。在发酵的第4-8天取5 ml样品，在Hereaus labofuge RF中于5000rpm下离心IO分钟，并将上清液储存于-2(TC下直至进一步分析。
SDS-Page分子量(MW)测定在使用NuPAGE MES- SDS电泳缓冲液的NuPAGE Novex Bis-Tris 4-12 % (Invitrogen (Breda-荷兰))上，通过SDS-PAGE分析样品。根据供应商的方案，使用NuPAGE还原剂在上样前还原样品。为了估计产生的蛋白质的分子量，使用标记蛋白(SeeBluePlus2预染色的标准(Invitrogen))。将凝胶电泳并根据供应商的说明使用Simply Blue Protein Strain (Invitrogen)染色，并通过与标准蛋白比较估计产生的蛋白质的分子量。在本例子中分析了 13微升转化体发酵液的上清液。
清楚可见，含有pGBFINZJW载体的转化体分泌了通过SDS-PAGE分析时表观分子量约为50kDa的蛋白质。因为这比从蛋白质序列预测的分子量稍大，所以我们推测当尸em'cz犯wm c/ owge"wn唾液酸酶ZJW由^^e/^7/w Wgw分泌时，去除信号序列后发生一些糖基化。
发酵和下游加工被按比例放大后，选择的菌株可用于分离和纯化更大量的真菌唾液酸酶。随后该酶可被用于进一步分析以及用于不同的工业应用中。
39实施例2对唾液酸酶的纯化和表征
如实施例1中所述通过发酵生产唾液酸酶。使用Amplex Red神经氨酸酶测定试剂盒(得自Invitrogen)测量酶活性。用milliQ-水将培养物滤出液(IOO ml)稀释至4.8 mS/cm的电导率，并使用Biomax-lO膜(得自Millipore)通过超滤浓縮至70 ml。使用NaOH将pH调节至6.0，并将样品上样在5 ml HiTrapQ离子交换柱(得自Amersham， 5 ml/分钟)上，所述离子交换柱在20 mM柠檬酸钠(pH6.0)中平衡。收集收集通过柱的含有唾液酸酶的流出物，针对25mMTris,HCl(pH7.0)透析，并上样于在相同缓冲液中平衡的5 ml HiTrap Q FF (5 ml/中)上。唾液酸酶存在于流出级分中并且被收集。然后将酶溶液针对30 mM拧檬酸钠(pH4.0，缓冲液A)透析并上样于在缓冲液A中平衡的5 ml HiTrap SP柱(得自Amersham, 5ml/分钟)上。将酶上样后，用3倍体积的缓冲液A洗涤柱并用20倍体积从缓冲液A到缓冲液B (缓冲液B:含1M NaCl的30 mM柠檬酸钠，pH4.0)的线性梯度洗脱酶。鉴定并合并含唾液酸酶的级分。使用牛血清白蛋白作为参照蛋白质，用Bradford试剂(得自Sigma)测定蛋白质浓度。通过十二烷基钠聚丙烯酰胺凝胶电泳上不存在污染条带判断蛋白质纯度>95%。唾液酸酶以47kD的表观分子量迁移，这比基于预测的氨基酸序列计算的42.7 kD分子量稍大。酶制剂未显示对一系列底物ZAAXpNA(Z二苯甲酰基、A^丙氨酸、XH壬何氨基酸残基、pNA-对硝基苯胺)的蛋白水解活性，表明不存在内蛋白酶活性。
实施例3
制备小型乳酪(miniature cheese)的方法如Shakeel-Ur-Rehman " a/. (Protocol for the manufacture of miniaturecheeses in Lait, 78 (1998), 607-620)所述生产小型乳酪。使用经巴氏灭菌的全脂匀化牛乳，但是也可以使用粗制牛乳或重溶的牛乳。将乳转移至广口塑料离心瓶(每瓶200 mL)中并冷却至31°C。随后向离心管中每200 ml巴氏灭菌乳中添加1.8单位的初始培养物DS 5LT1 (DSM Gist B.V.,Delft，荷兰)，并将乳熟化20分钟。然后添加CaCl2 (每200 ml熟化乳132 Ad 1 mol丄"溶液)。最后添加凝固剂(每ml 0.04 IMCU);使用唾液酸酶时，其与凝固剂一起添加。将乳溶液在3(TC保持40-50分钟，直至形成凝块。用框架上间隔1 cm分布的张力线切割机手动切割凝块。允许成熟2分钟，随后柔和地搅拌10分钟。之后在30分钟期间将温度逐步提高至39'C，同时持续搅拌凝乳/乳清混合物。达到6.2的pH后，在室温下以1,700 g将凝乳/乳清混合物离心60分钟。对乳清排去水分并将凝乳置于36"C下的水浴中。每15分钟反转乳酪，直至pH降低至5.2-5.3，然后在室温下以1,700 g离心20分钟。制成后对乳酪加以称重。
实施例4测定乳酪凝化的方法如Kubarsep W a/ (Acta Agric Scand Section A (2005) 55, 145-148)所述使用Optigraph (Alliance Instruments,法国)进行乳酪凝固。根据标准步骤(IDF157 A [2])测定添加乳凝固酶溶液后标准乳底物溶液的凝固时间。通过向含4.5 mM CaCl2的100 ml milliQ-水中添加11 g低热量无脂肪乳粉(Nilac，得自NIZO，荷兰)，制备乳底物溶液。用磁力搅拌器对乳溶液搅拌30分钟。为了澄清乳，将溶液在室温下暗中保存30分钟。乳的pH约为6.5。用milli-Q水稀释凝乳酶，从而达到8和15分钟之间的粗制凝乳酶凝固时间(r)。将10 ml乳溶液转移至Optigraph样品杯中。将乳调节至32"C的反应温度。将200 Ml稀释的酶样品移液进入多勺设备中，并一次添加至乳中。该操作是凝固测试的起点。用Optigmph针对该目的提供的勺子混合酶和乳。对凝固进行45分钟的监测。
4权利要求
1.具有唾液酸酶活性并且具有下述氨基酸序列的经分离的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO3的1到407位氨基酸具有至少60％的氨基酸序列同一性。
2. 权利要求1的多肽，其具有少于55 kDa的MW (分子量)(SDS-Page)，更优选地所述多肽具有少于52 kDa的MW (分子量)(SDS-Page),或所述多肽具有少于50 kDa的MW (分子量)(以氨基酸序列为 基础计算的)，更优选地所述多肽具有少于45 kDa的MW (分子量)(以氨基酸序列为基础计算的)。
3. 真菌多肽，其具有少于55 kDa的MW (分子量)(SDS-Page)，更优 选地所述多肽具有少于52 kDa的MW (分子量)(SDS-Page)，或所述多肽 具有少于50 kDa的MW (分子量)(以氨基酸序列为基础计算的)，更 优选地所述多肽具有少于45 kDa的MW (分子量)(以氨基酸序列为基 础计算的)。
4. 权利要求1或3的多肽，其为胞外酶。
5. 具有下述氨基酸序列的权利要求1到4中任一项的多肽，所述氨基 酸序列与SEQ ID NO: 3的1到407位氨基酸具有至少65%、优选地至少 70%、更优选地至少80%、进一步更优选地至少90%、最优选地至少95% 和进一步最优选地至少约97%的同一性。
6. 权利要求1的多肽，其包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列。
7. 权利要求1到6中任一项的多肽，其得自真菌，优选地得自 尸em'cz'〃Zww ， 更优选地来自尸em'cz7z't/^n cA，oge做m 。
8. 包含下述核酸序列的经分离的多核苷酸，所述核酸序列编码权利要 求l到7中任一项的多肽。
9. 核酸构建体，其包含与一个或多个控制序列可操作地连接的权利要 求8的多核苷酸，所述控制序列指导所述多肽在合适表达宿主中的生产。
10. 包含权利要求9的核酸构建体的重组表达载体。
11. 重组宿主细胞，其包含权利要求10的核酸构建体或权利要求9的核酸构建体。
12. 用于生产权利要求1到8中任一项的多肽的方法，所述方法包 括培养根据权利要求9的菌株/重组宿主细胞，以生产包含所述多肽的细 胞和/或上清液；和回收所述多肽。
13. 多肽，其能够通过权利要求12的方法获得，或者，所述多肽是分 泌的唾液酸酶，其具有少于55 kDa的MW (分子量)(SDS-page)，更优选 地所述多肽具有少于52kDa的MW (分子量)(SDS-page)。
14. 多肽，其能够通过权利要求12的方法获得，或者，所述多肽是分 泌的唾液酸酶，其具有少于55 kDa的MW (分子量)(以氨基酸序列为 基础计算的)，更优选地所述多肽具有少于45 kDa的MW (分子量)(以氨基酸序列为基础计算的)。
15. 生产权利要求1到8中任一项的多肽的方法，所述方法包括在 适合生产所述多肽的条件下培养包含下述核酸构建体的宿主细胞，所述核 酸构建体包含编码所述多肽的多核苷酸；和回收所述多肽。
16. 通过权利要求15的方法生产的多肽。
17. 多肽，其具有唾液酸酶活性并且无毒，或者，所述多肽具有下述 唾液酸酶的活性，所述唾液酸酶是真菌唾液酸酶并且具有少于55 kDa的 MW (分子量)(SDS-page)，更优选地所述唾液酸酶具有少于52 kDa的 MW (分子量)(SDS-page)，或所述唾液酸酶具有少于50 kDa的MW (分 子量)(以氨基酸序列为基础计算的)，更优选地所述唾液酸酶具有少于 45kDa的MW (分子量)(以氨基酸序列为基础计算的)。
18. 根据权利要求1到8、 13或14中任一项的多肽或具有少于55 kDa 的MW (分子量)(SDS-page)的细胞外唾液酸酶在食物或饲料制备中的用 途，或作为药物或药物成分或在药物制备中的用途，优选地所述多肽具有 少于52kDa的MW (分子量)(SDS-page)，或所述细胞外唾液酸酶具有少 于50 kDa的MW (分子量)(以氨基酸序列为基础计算的)，优选地所 述多肽具有少于45 kDa的MW (分子量)(以氨基酸序列为基础计算 的)。
全文摘要
本发明涉及具有唾液酸酶活性的经分离的多肽，其选自由以下组成的组(a)具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO3的1到407位氨基酸具有至少60％的氨基酸同一性；(b)由下述多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在低严格度条件下与(i)或(ii)杂交，所述(i)为SEQ IDNO1或2的核酸序列，其在60个、优选地100个核苷酸上至少80％或90％相同，更优选地在200个核苷酸上至少90％相同，所述(ii)为与SEQID NO1或2的核酸序列互补的核酸序列。
文档编号C12N9/24GK101636489SQ200880005675
公开日2010年1月27日 申请日期2008年2月18日 优先权日2007年2月20日
发明者尤莉亚·M·艾菲莫瓦, 彼得吕斯·雅各布斯·西奥多瑞斯·蒂克尔, 阿伯图斯·阿拉德·蒂克·范 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司