专利名称：酶法唾液酸检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种酶法唾液酸检测试剂盒。
背景技术：
N-乙酰神经氨酸(N-Acetylneuraminic Acid，NANA)，俗称唾液酸(Sialic acid, SA)，是多种天然神经氨酸衍生物之一，其母体结构是九个碳原子组成的内环氨基酸，是一族化合物的总称，它由于最初从颂下腺粘蛋白中分离出而得名。唾液酸分布于哺乳动物体内，血管内皮细胞内含量尤其丰富。人体血清中总唾液酸(total sialic acid，TSA)含量约为1. 5 2. 5mmol/L，包括游离唾液酸和结合唾液酸。 其中游离唾液酸的含量较低，约为1 3ymol/L;与脂蛋白和糖蛋白结合的唾液酸即结合唾液酸，是血清中唾液酸的主要存在形式。唾液酸位于糖蛋白、糖脂的寡糖连的末端，与细胞识别、分化以及粘附有关，参与受体组成，并诱导细胞增殖、死亡。正常代谢时，人体血清中唾液酸含量稳定。当组织细胞恶变时，细胞表面糖蛋白在结构和功能上均发生明显改变，结合在糖蛋白上的唾液酸随异常表达的糖蛋白脱落入血， 是血液中唾液酸含量升高的原因之一。许多研究发现带瘤动物及肿瘤患者的瘤体及血液中唾液酸含量增加并随病情的加重而升高、随病情的缓解而降低，因此在临床检验中唾液酸常被作为恶性肿瘤存在和发展监控的一个指标，被广泛地应用于很多肿瘤的诊断和监控中。目前，检测总唾液酸含量的方法有很多，例如HPLC法、酶法、化学比色法(常见的有硫代巴比妥酸法、间苯二酚法)。HPLC方法具有灵敏度高、特异性好的优点，但是仪器昂贵且不适合临床批量检测。化学比色法虽然价格比较低，但是特异性低，操作复杂繁琐，需要高温萃取，不适合自动化分析，其试剂成分具有一定的腐蚀性和人体危害性。酶法通常通过神经氨酸苷酶(Neuraminidase，ΝΑ)来进行检测血清样本中的唾液酸含量。其反应原理为神经氨酸苷酶催化水解与糖蛋白、寡糖连接的N-乙酰神经氨酸残基，使唾液酸糖苷键断裂生成游离的N-乙酰神经氨酸，N-乙酰神经氨酸在神经氨酸醛缩酶的作用下生产成丙酮酸和甘露糖胺，丙酮酸与还原性辅酶(NADH)在乳酸脱氢酶(LDH)的作用下生成乳酸和 NAD+，而NADH在340nm有特异性吸收，通过检测NADH的减少量就可以检测出血清样本中的唾液酸含量。其反应过程如下
神经氨酸苷酶
唾液酸(结合型)- N-乙酰神经氨酸
N-乙酰神经氨酸神经氨酸醒缩f N-乙酰甘露糖胺+丙酮酸
丙酮酸 +NADH+ H+ _LDH_^ 乳酸 +NAD+ 酶分析法具有特异性高，操作简单快捷、准确安全、可自动化分析的优点，但由于试剂中使用的还原性辅酶NADH在该反应条件下不稳定，必须制成干粉试剂才能长期保存稳定，复溶后必须尽快使用，否则在保存过程中由于NADH降解速度较快对试剂性能会造成 很大影响，无法满足临床检测需要。同时神经氨酸苷酶、尤其是神经氨酸醛缩酶在该反应条 件下不稳定，效价降低很快，因此临床上依然存在对测定准确、方便适用、稳定可靠、成本低 廉的酶法唾液酸检测试剂盒的需要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供ー种测定准确、方便适用、稳定可靠、成本低廉 的酶法唾液酸检测试剂盒。本发明所采用的技术方案为一种酶法唾液酸检测试剂盒，由以下两种试剂构成，其中试剂1
缓冲液50-500mmol/L
神经氨酸苷酶1- 5 KU/L
乳酸脱氢酶1-5KU/L
表面活性剂0.1-100 g/L
稳定剂1-100 mmol/L
防腐剂0.1-100 g/L试剂2:
缓冲液50-500mmol/L
还原性辅酶1-20 mmol/L 神经氨酸醛缩酶 0.1-10 KU/L
稳定剂1-100 mmol/L
防腐剂0.1-100 g/L。所述试剂1和试剂2中的缓冲液为三羟甲基氨基缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、柠 檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢ニ钠-柠檬酸缓冲液、MES缓冲液、Good’ S缓冲液、硼酸缓冲 液中的ー种或几种，试剂1中缓冲液的PH为6. 0-8. 0，试剂2中缓冲液的pH为8. 5-10. 0。所述试剂1中的表面活性剂为非离子表面活性剂，进一歩优选为TWEEN系列表面 活性剂或SPAN系列表面活性剂或TRITON系列表面活性剂。所述试剂1和试剂2中的稳定剂为聚乙ニ醇、丙三醇、丙ニ醇、蔗糖、海藻糖、山梨 醇、BSA中的一种或者几种。所述试剂1和试剂2中的防腐剂为山梨酸钾、苯甲酸钠、叠氮钠、亚硝酸钠、 Proclin300中的ー种或几种。本发明试剂1和试剂2的配制方法为常规方法，即试剂1和试剂2所述组分分別 加入蒸馏水后各自混合搅匀即可。本发明酶法唾液酸检测试剂盒测定样本中的唾液酸的测试条件如下温度30-37 V ；比色杯光径为1.0cm。检测主波长;MOnm，副波长405nm。应用本发明測定试剂盒测定样本中唾液酸的方法如下样品(校准管以校准品做 样品)加试剂1混勻，30-37°C孵育3-5min后加入试剂2混勻，30_37°C反应90s后，监测 90s吸光度变化。其中样本用量5-15 iU，试剂1用量240 iU，试剂2用量SOiU。本发明试剂盒测定样本中唾液酸含量按以下公式进行计算
总唾液酸浓度mg/dl = - X 标准浓度
A标A 标堆空白本发明采用双试剂的方法解决了酶法唾液酸检测方法中NADH及关键工具酶不稳 定带来的试剂检测步骤复杂且不稳定的问题，得到的液体双试剂2-8°C至少可稳定12个 月，能够直接使用，无需复溶，方法简便，易操作，可快速得到检测結果，不需要特殊或额外 的仪器，便于行业内推广应用。
图1所示的是本发明酶法唾液酸检测试剂盒的线性范围实验的数据分布图。图2所示的是本发明酶法唾液酸检测试剂盒的方法学对比实验的数据分布图。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进ー步具体描述，但不局限于此。实施例1 酶法唾液酸检测试剂盒，由以下两种试剂构成，其中试剂1
三羟甲基氨基缓冲液(PH6.0) 50 mmol/L
神经氨酸苷酶1 KU/L
乳酸脱氢酶1 KU/L
TWEEN 800.1 g/L
BSA1 mmol/L
山梨酸钾0.1 g/L试剂2
MES 缓冲液(pH 8.5) 50 mmol/L
NADH1 mmol/L
神经氨酸醛缩酶0.1 KU/L
乙ニ醇1 mmol/L
叠氮钠0.1 g/L
试剂1和试剂2的配制方法为常规方法，即试剂1和试剂2所述组分分別加入蒸 馏水后各自混合搅勻即可。实施例2 酶法唾液酸检测试剂盒，由以下两种试剂构成，其中试剂1
甘氨酸-NaOH CpH 7.5)200 mmol/L
神经氨酸苷酶5 KU/L
乳酸脱氢酶5 KU/L
Tritonx X-IOO10g/L
山梨醇100 mmol/L
苯甲酸钠10g/L试剂2
三羟甲基氨基缓冲液(pH 10.0) 200mmol/L
NADH20 mmol/L
神经氨酸醛缩酶10KU/L
蔗糖100 mmol/L
Proclin 30020 g/L实施例2试剂盒的制备方法同实施例1。实施例3酶法唾液酸检测试剂盒，由以下两种试剂构成，其中试剂1
Good's 缓冲液(pH7.0)100 mmol/L
神经氨酸苷酶2.5 KU/L
乳酸脱氢酶3 KU/L
TWEEN 2010 g/L
丙三醉10 mmol/L
Proclin 3001 g/L试剂2 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH9.0) 100 mmol/L NADH5 mmol/L
神经氨酸醛缩酶5 KU/L
海藻糖10 mmol/L
叠氮钠0.1 g/L实施例3试剂盒的制备方法同实施例1。本发明酶法唾液酸检测试剂盒测定样本中的唾液酸的测试条件如下温度 30-37 V ；比色杯光径为1.0cm。检测主波长;MOnm，副波长405nm。应用本发明测定试剂盒测定样本中唾液酸的方法如下样品(校准管以校准品做 样品)加试剂1混勻，30-37°C孵育3-5min后加入试剂2混勻，30_37°C反应90s后，监测 90s吸光度变化。其中样本用量8 ill，试剂1用量240 ill，试剂2用量80 ill。本发明试剂盒测定样本中唾液酸含量按以下公式进行计算
权利要求
1.一种酶法唾液酸检测试剂盒，其特征在于由以下两种试剂构成，其中试剂1缓冲液50-:50-500 mmol/L神经氨酸苷酶 1- 5 KU/L 乳酸脱氢酶 1- 5 KU/L 表面活性剂 0.1-100 g/L稳定剂1-100 mmol/L防腐齐00.1-100 g/L试剂2缓冲液50-500 mmol/L还原性辅酶1-20 mmol/L神经氨酸醛缩酶 0.1-10 KU/L稳定剂防腐剂1-100 mmol/L 0.1-100 g/L0
2.根据权利要求1所述的酶法唾液酸检测试剂盒，其特征在于所述试剂1和试剂2中的缓冲液为三羟甲基氨基缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、MES缓冲液、Good’ s缓冲液、硼酸缓冲液中的一种或几种，试剂1中缓冲液的PH为6. 0-8. 0，试剂2中缓冲液的pH为8. 5-10. 0。
3.根据权利要求1所述的酶法唾液酸检测试剂盒，其特征在于所述试剂1中的表面活性剂为非离子表面活性剂。
4.根据权利要求3所述的酶法唾液酸检测试剂盒，其特征在于所述试剂1中的表面活性剂为TWEEN系列表面活性剂或SPAN系列表面活性剂或TRITON系列表面活性剂。
5.根据权利要求1所述的酶法唾液酸检测试剂盒，其特征在于所述试剂1和试剂2中的稳定剂为聚乙二醇、丙三醇、丙二醇、蔗糖、海藻糖、山梨醇、BSA中的一种或者几种。
6.根据权利要求1所述的酶法唾液酸检测试剂盒，其特征在于所述试剂1和试剂2中的防腐剂为山梨酸钾、苯甲酸钠、叠氮钠、亚硝酸钠、Proclin 300中的一种或几种。
全文摘要
本发明提供了一种酶法唾液酸检测试剂盒，该试剂盒由试剂1和试剂2两种试剂构成，其中试剂1的各组分为缓冲液、神经氨酸苷酶、乳酸脱氢酶、表面活性剂、稳定剂、防腐剂，试剂2的各组分为缓冲液、还原性辅酶、神经氨酸醛缩酶、稳定剂、防腐剂。该试剂盒测定准确、方便适用、稳定可靠、成本低廉。
文档编号C12Q1/32GK102399851SQ20111034390
公开日2012年4月4日 申请日期2011年10月25日 优先权日2011年10月25日
发明者沃燕波, 邹炳德 申请人:宁波美康生物科技有限公司