专利名称：紫花苜蓿γ-生育酚甲基转移酶基因及编码的蛋白和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种紫花苜蓿Y-生育酚甲基转移酶相关基因，还涉及由该基因编码的蛋白，以及含有所述紫花苜蓿Y-生育酚甲基转移酶基因的表达载体和细胞，同时还涉及一种培育紫花苜蓿的方法，以及紫花苜蓿Y -生育酚甲基转移酶基因及其编码的蛋白和含有该基因的表达载体及细胞在培育高α-生育酚含量的植物中的应用。
背景技术：
维生素E是一类人体所必需的脂溶性维生素，具有重要的生理功能。它能够清除脂质过氧化所产生的自由基而稳定保护生物膜的脂双层，使细胞免受过氧化物的伤害。因而被作为一种有效的抗氧化剂广泛地应用在医药、食品、饲料等行业中。大量动物实验表明，在饲料中添加维生素E具有提高动物免疫力、改善肉质、提高动物的繁殖性能、缓解动物应激反应等显著效果。维生素E的生产主要通过化学合成和天然提取获得。化学方法合成的产品主要以醋酸酯的形式存在，副产物多且生物活性低。天然维生素E主要存在于植物中，在生理活性和安全性上明显优于合成维生素Ε。天然维生素E由8种生育酚异构体组成。根据侧链饱和度可分为生育酚和三烯生育酚两大类。根据芳香环上甲基数目和位置的不同又分为α、β、Υ、δ-生育酚和α、β、Y、δ-三烯生育酚。这8种生育酚异构体在植物中的含量及相对活性均不尽相同，α -生育酚的生物活性最高，并可被人体和动物体优先吸收和利用，这是由于在肝脏中的运送α-生育酚的转移蛋白优先结合α-生育酚的特性所决定的。但是α-生育酚在植物中的含量相对较低，因此，大幅度提高植物(特别是牧草植物)中高活性α-生育酚含量，将具有良好的社会效益和经济效益。研究植物维生素 E合成途径发现，通过甲基转移作用将Y-生育酚转化为α-生育酚的Y-生育酚甲基转移酶，可提高植物中α-生育酚的含量和比例。目前Υ-生育酚甲基转移酶基因已经从拟南芥、蓝藻等中克隆得到，但至今未见从牧草植物(特别是苜蓿)中克隆分离到Y-生育酚甲基转移酶基因，并将其转化到牧草植物中来提高α-生育酚含量的报道。紫花苜蓿是我国乃至世界上最重要的豆科牧草，被誉为“牧草之王”。如果能够克隆得到源自紫花苜蓿的Y-生育酚甲基转移酶基因，并将其转到包括紫花苜蓿在内的牧草植物中，将能够在提高动物免疫力、改善肉质、提高动物的繁殖性能等方面具有重要的意义。
发明内容
本发明基于对紫花苜蓿中维生素E合成途径相关的分子生物学机制的研究，一方面提供了紫花苜蓿Y-生育酚甲基转移酶基因及该基因编码的蛋白，另一方面还提供了含有所述紫花苜蓿Y-生育酚甲基转移酶基因的表达载体和细胞，以及培育高α-生育酚含量的紫花苜蓿的方法，还提供了它们的应用。本发明提供了一种紫花苜蓿Y-生育酚甲基转移酶基因编码的蛋白，其中，该蛋白具有SEQ ID No:2所不的氣基酸序列，或者该蛋白具有将SEQ ID No:2所不的氣基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加后仍具有Y -生育酚甲基转移酶活性的氨基酸序列。本发明还提供了一种紫花苜蓿Y-生育酚甲基转移酶基因，其中，该基因具有SEQID No:1所不的核昔酸序列，或者该基因具有编码SEQ ID No:2所不的氣基酸序列的核昔酸序列。本发明还提供了一种表达载体，其中，该表达载体含有本发明提供的紫花苜蓿Y-生育酚甲基转移酶基因。本发明还提供了一种转基因细胞，其中，该转基因细胞含有本发明提供的紫花苜蓿Y-生育酚甲基转移酶基因。本发明还提供了一种培育紫花苜蓿的方法，其中，该方法包括将本发明提供的紫花苜蓿Y-生育酚甲基转移酶基因导入到紫花苜蓿细胞中，得到α-生育酚含量高的紫花苜蓿细胞及转基因植株。本发明还提供了本发明提供的紫花苜蓿Y-生育酚甲基转移酶基因、及其编码的蛋白、含有所述基因的表达载体、含有所述基因的转基因细胞在培育α -生育酚含量高的植物中的应用。本发明从紫花苜蓿中克隆的Y-生育酚甲基转移酶基因为提高主要牧草植物(特别是豆科植物，如紫花苜蓿)中α-生育酚的含量提供了基因资源，在基因工程改良牧草植物的研究中将发挥重要作用。
图1显示了实施例1中对紫花苜蓿植株进行农杆菌介导的Y-生育酚甲基转移酶基因转化所用的插入有Y -生育酚甲基转移酶基因的PCAMBIA1302载体的结构。
具体实施例方式本发明提供了一种由紫花苜蓿Y-生育酚甲基转移酶基因编码的蛋白，其中，该蛋白具有SEQ ID No:2所不的氣基酸序列，或者该蛋白具有将SEQ ID No:2所不的氣基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加后仍具有Y -生育酚甲基转移酶活性的氨基酸序列。优选情况下，该蛋白具有SEQ ID No:2所示的氨基酸序列。相应地，本发明还提供了一种紫花苜蓿Y-生育酚甲基转移酶基因，其中，该基因具有SEQ ID No:1所不的核昔酸序列，或者该基因具有编码SEQ ID No:2所不的氣基酸序列的核苷酸序列。优选地，该基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。本发明提供的紫花苜蓿Y-生育酚甲基转移酶基因是发明人通过以下方法筛选得到的:根据截型苜蓿中已经克隆的Y-生育酚甲基转移酶基因(Genbank登记号为:ΒΤ051703)保守域设计引物(RT-PCR 引物为:F:5 ' -TCTCAGCCCTGTTCAAGC-3 ' ；R:5 ' -CAAAGGGAGACCAATCTG-3 ')，从紫花苜猜(Medicago sativa L.cv.Zhongmu N0.1,中苜一号，北京中畜东方草业科技有限责任公司)中进行扩增，回收预期大小为400bp的片段(跑电泳后回收此长度的片段)，将回收的片段连入PMD18-T Vector(Takara),测序:测序结果在NCBI的非冗余蛋白数据库中进行BLASTx分析；将分析结果中与Y-生育酚甲基转移酶类有关的2条序列用DNAstar进行连续开放阅读框(ORF)分析，发现I条具有连续的ORF (长度为404bp);用该序列设计特异引物(MsTMT-RT-F:5' -ACGGCCAGTTTGATCTAGTGT-3' ；MsTMT-RT-R:5/ -CTTCATTCGGGGCAAG-3')，且利用该序列设计5’ RACE弓丨物与3’ RACE引物，以紫花苜蓿叶片组织为材料，获得其全长序列，具体步骤为:利用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit (Clontech, USA)分别对该 EST 序列进行5’ RACE和3’ RACE克隆，最后获得了该基因全长序列(SEQ ID N0:1)。其中，基因克隆的方法为分子生物学领域的常规实验操作，具体方法如下:RACE-ready cDNA 的合成A.准备基本液体:2.Ομ I 5Χ 第一链缓冲液，1.0μ I DTT (20mM), 1.0 μ IdNTPMix(IOmM)；B.制备用于 5，RACE 的 cDNA:2.75 μ I RNA, 1.Ομ I 5' -CDS Primer A ；制备用于3，RACE 的 cDNA:3.75 μ I RNA, 1.0μ I 3' -CDS Primer A ；C.将准备好的液体放于72°C 3分钟，再放于42°C冷却2分钟，短暂离心收集液体；D.向 B 中 5， RACE 的 cDNA 中加入 I μ I 的 SMARTer IIA oligo ；E.制备5’ RACE和3，RACE-Ready cDNA反应液:4.0 μ I的步骤A得到的缓冲液，
0.25 μ I RNA 酶抑制剂(40U/ μ I)，1.0 μ I SMARTScribe 逆转录酶(100U)；F.将步骤E中的液体加入到步骤C中，完成3’RACE-Ready cDNA合成反应液的制备；将步骤E中的液体加入到步骤D中，完成5’ RACE-Ready cDNA合成反应液的制备；G.将制备好的反应液放于42°C中90分钟，最后70°C中10分钟，完成Ready-cDNA的合成。cDNA末端的快速合成H.准备基本液体:34.5μ I PCR 用水，5.0μ I IOXAdvantage 2PCR 缓冲液，
1.0μ I dNTP Mix(IOmM), 1.0μ I 50 X Advantage 2 聚合酶 Mix;1.制备用于 5’RACE 的 PCR反应:2.5μ I 5’RACE-ready cDNA，5.0 μ IUPM(IOX)，1.0μ I GSPl 5' -GTTGTAGGGATTCTTCATTCGGGGC-3' ；41.5 μ I 的步骤 H 中制备的缓冲液。制备用于3’RACE 的 PCR 反应:2.5μ I RACE-ready cDNA，5.0 μ IUPM(IOX)，1.0μ I GSP2 5' -TTGTTGGTGAGTTAGCACGGGTAGC-3' ；41.5 μ I 的步骤 H 中制备的缓冲液。RACE反应体系为:94°C 30秒，72V 3分钟，共5个循环:94°C 30秒，70°C 3分钟，72 0C 3分钟，共5个循环；94°C 30秒，68°C 30秒，72°C 3分钟，共20个循环。取PCR产物于1.0重量％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，回收目的条带，连接回收产物与pEGM T-Easy载体上，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，提取质粒并测序，进行序列拼接，结果显示该基因具有SEQ ID =No:1所示的核苷酸序列(1306bp)。本发明还提供了一种表达载体,其中，该表达载体含有具有以下核苷酸序列的基因:SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，或者编码SEQ ID No:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。本发明提供的基因可以通过现有的方法构建到表达载体中，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。本发明还提供了一种转基因细胞，其中，该转基因细胞含有具有以下核苷酸序列的基因:SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，或者编码SEQ ID No:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。所述细胞可以为单子叶植物的细胞，也可以为双子叶植物的细胞，如水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄或苜蓿等的细胞。优选为苜蓿细胞，更优选为紫花苜蓿细胞。本发明还提供了一种培育α-生育酚含量高的紫花苜蓿的方法，其中，该方法包括将具有SEQ ID No:1所示的核苷酸的基因导入到紫花苜蓿细胞中，得到α-生育酚含量提高的紫花苜蓿细胞及转基因植株。根据本发明所述将有本发明提供的基因导入到紫花苜蓿细胞中的方法为基因工程领域常规的方法，例如可以通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，之后将转化的植物细胞培育成植株。本发明还提供了本发明提供的紫花苜蓿Y-生育酚甲基转移酶基因、及其编码的蛋白、含有所述基因的表达载体、含有所述基因的转基因细胞在培育α -生育酚含量高的植物中的应用。优选地，所述植物为紫花苜蓿。实施例1农杆菌介导的Y -生育酚甲基转移酶(MsTMT)基因转化紫花苜蓿植株一、材料与试剂1、植物材料供试苜猜品种为紫花苜猜(Medicago sativa L.cv.Zhongmu N0.1,中苜一号，北京中畜东方草业科技有限责任公司)。发芽7天的无菌苗子叶为遗传转化的受体材料。2、农杆菌菌株和质粒载体所用的农杆菌菌株为根癌农杆菌:LBA4404(北京天恩泽基因科技有限公司)农杆菌培养基:
权利要求
1.一种由紫花苜蓿Y-生育酚甲基转移酶基因编码的蛋白，其特征在于，该蛋白具有SEQ ID No:2所不的氣基酸序列，或者该蛋白具有将SEQ ID No:2所不的氣基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加后仍具有Y -生育酚甲基转移酶活性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的蛋白，其中，该蛋白具有SEQID No:2所示的氨基酸序列。
3.一种紫花苜蓿Y-生育酚甲基转移酶基因，其特征在于，该基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，或者该基因具有编码SEQ ID No:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其中，该基因具有SEQID No:1所示的核苷酸序列。
5.一种表达载体,其特征在于,该表达载体含有权利要求3所述的基因。
6.一种转基因细胞，其特征在于，该转基因细胞含有权利要求3所述的基因。
7.根据权利要求6所述的转基因细胞，其中，所述转基因细胞为紫花苜蓿转基因细胞。
8.一种培育紫花苜蓿的方法，其特征在于，该方法包括将权利要求3所述的基因导入到紫花苜蓿细胞中，得到α-生育酚含量高的紫花苜蓿细胞及转基因植株。
9.权利要求1所述的蛋白、权利要求3所述的基因、权利要求5所述的表达载体、权利要求6所述的转基因细胞在培育α-生育酚含量高的植物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其 中，所述植物为紫花苜蓿。
全文摘要
本发明公开了一种由紫花苜蓿γ-生育酚甲基转移酶基因编码的蛋白，其中，该蛋白具有SEQ ID No2所示的氨基酸序列，或者该蛋白具有将SEQ ID No2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加后仍具有γ-生育酚甲基转移酶活性的氨基酸序列。本发明还涉及该蛋白的编码基因，以及含有该基因的表达载体和细胞，同时还涉及一种培育α-生育酚含量高的紫花苜蓿的方法和它们的应用。本发明提供的紫花苜蓿γ-生育酚甲基转移酶基因(MSTMT)在紫花苜蓿中的表达可以显著提高紫花苜蓿中α-生育酚的含量。该基因的发现为提高主要牧草植物(特别是豆科植物，如紫花苜蓿)中α-生育酚的含量提供了基因资源，在基因工程改良牧草的研究中将发挥重要作用。
文档编号C12N15/84GK103087999SQ201110343669
公开日2013年5月8日 申请日期2011年11月3日 优先权日2011年11月3日
发明者王学敏, 王赞, 高洪文, 贾慧丽 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所