专利名称：特异性抗凝血物质的制备及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一类抗凝血物质的蛋白质结构及其制备方法和在防治血栓相关性疾病中的应用。具体而言，本发明涉及抗凝血物质与能被凝血酶或凝血因子)(a识别并裂解的氨基酸序列连接而成的新物质，或抗凝血物质与其它物质通过能被凝血酶或凝血因子fe识别并裂解的氨基酸序列连接而成的新物质，以及这些新物质的医药用途。
背景技术：
心血管疾病是近年来威胁人类健康和生命的头号杀手，血栓形成是许多心血管疾病的重要诱因，抗凝剂是防治血栓形成的重要药物。目前临床上广泛应用的抗凝剂主要是肝素，其作用是通过与抗凝血酶IIKantithrombin III)结合来抑制凝血酶(thrombin) 的活性，因而可能引起抗凝血酶III的减少，肝素的一个重要缺点是引发血小板减少症 (thrombocytopenia)。现在又发展的低分子量肝素可以减轻肝素应用中的风险程度，但不能根本克服它的缺点。水蛭素是近年来欧洲已经上市的一个新型抗凝药物，它是凝血酶的直接抑制剂，但它对凝血酶的强抑制作用，可导致凝血相关参数，如APTT、TT等急剧升高， 从而伴有全身或系统性出血风险。现有抗凝药物存在的上述问题已经越来越多的受到人们的关注，作为一个理想的抗凝药物，在全身用药条件下，应当具有明确的抗凝抗栓效果，但又不引起出血副作用，使临床用药安全性提高。为此，本发明思想的指导原则的关键是使抗凝剂活性进行特异性释放，即在正常条件下，该类物质无抗凝活性，而当凝血系统被激活，有血栓形成可能时，该类物质的抗凝活性才在血栓局部释放，营造不易形成血栓的微环境(即在可能发生血栓的局部出现抗凝活性)，甚至溶解已形成的微小栓子以达到防治血栓形成的功能。这就克服了肝素、水蛭素等抗凝剂用药引起系统性出血的风险。例如水蛭素是由65 66个氨基酸组成的单链多肽。其氨基端可以与凝血酶催化活性位点结合，具有抗凝活性，羧基端与凝血酶的底物识别位点结合，对凝血酶有很强的特异性亲和作用。本文设计了一个封闭水蛭素氨基末端的措施，以达到降低水蛭素的抗凝活性的目的。当体内凝血系统被激活将发生血栓时，利用血栓发生过程中引发的生物化学变化的特点，使氨基末端被封闭的水蛭素重新回复为水蛭素原形，在可能发生或已发生的血栓的局部发挥特异性抗凝作用，从而成为一类新型的、安全的、有效的抗凝剂。在上述发明思想的指导下，本文对水蛭素进行了如下修饰在水蛭素的氨基末端连接上可被凝血酶或凝血因子叙识别并裂解的寡肽。该水蛭素衍生物在体内正常情况下不具有抗凝活性，一旦体内凝血系统被激活，则在凝血酶或凝血因子)(a的作用下，释放水蛭素的抗凝活性，起到抗栓作用。如果在上述水蛭素衍生物的氨基末端再连接上一惰性多肽(如白蛋白)，则可使上述抗凝剂的药效时间延长，成为一个长效抗凝剂。当然，上述物质对于体内不存在血栓的部位，则无抗凝活性。因此，它不同于水蛭素、肝素等抗凝剂，是一类安全、有效的防栓剂。从而，此类特异抗凝剂对于防治血栓形成的应用具有重要意义。发明目的本发明的目的在于提供无抗凝活性而可以防治血栓形成的物质。
发明内容
本发明现已发现，利用凝血酶或凝血因子识别序列连接抗凝血蛋白可实现对抗凝血蛋白抗凝活性的封闭。衍生的抗凝血蛋白具有如下的特征抗凝血蛋白如水蛭素的氨基末端被凝血酶或凝血因子)(a识别序列封闭后，在体外和血液系统非血栓部位没有抗凝活性，从而避免或减小了因抗凝血蛋白如水蛭素引起的系统出血的副作用；衍生的抗凝血蛋白只有在血栓发生时，在特有的凝血酶或凝血因子叙的作用下才释放出游离的抗凝血蛋白，发挥特异性抗凝活性。本发明基于上述特征的发现现已完成。因此，本发明第一方面涉及含有被凝血酶或凝血因子叙识别并裂解的寡肽的抗凝血蛋白。本发明再一方面涉及制备含有被凝血酶或凝血因子识别并裂解的寡肽的抗凝血蛋白的方法，其包括将凝血酶或凝血因子fe识别序列对应的碱基序列与抗凝血蛋白基因进行连接，另外，将含有被凝血酶或凝血因子)(a识别并裂解的寡肽的抗凝血蛋白基因上接入惰性多肽的基因，然后这些基因构建至适合表达的载体，如PBV220，pPIC9，pPIC9K等， 这些含有目的基因的重组载体在适宜的宿主中表达，例如在大肠杆菌，酵母或动物细胞体系中表达而得到新的抗凝血蛋白。本发明再一方面涉及含有上述抗凝血蛋白及药用载体或赋形剂的药物组合物。根据本发明，术语“抗凝蛋白”或“抗凝血蛋白”是指能够抗凝血的蛋白，如水蛭素、 抗凝血酶III、蛇毒等，或它们的突变体。优选水蛭素或其突变体。根据本发明，术语“凝血酶或凝血因子叙识别的连接肽”或“凝血酶或凝血因子)(a识别的寡肽”是指四肽序列IEGRdleGluGlyArg)或含有IEGR的肽段，或四肽序列 LGPR(LeuGlyProArg)或含有 LGPR 的肽段。根据本发明，本发明的含有被凝血酶或凝血因子叙识别并裂解的寡肽的抗凝血蛋白优选在水蛭素氨基末端连接上IEGR或LGPR ；人白蛋白与水蛭素通过连接肽EFIEGR连接而成的融合蛋白AFH(HSA-EFIEGR-HV2)或人白蛋白与水蛭素通过连接肽EFLGPR连接而成的融合蛋白ATH(HSA-EFLGPR-HV2)；多肽DAEAYV与水蛭素通过连接肽EFIEGR连接而成的融合蛋白Pra(P-EFIEGR-HV2)，或多肽DAEAYV与水蛭素通过连接肽EFLGI3R连接而成的融合蛋白 PTH(P-EFLGPR-HV2)。根据本发明，本发明的含有被凝血酶或凝血因子叙识别并裂解的寡肽的抗凝血蛋白可在适宜的宿主系统中表达，优选在大肠杆菌或酵母中表达。附图概述
图1显示ra和TH的核苷酸序列。下面的实施例用来进一步说明本发明，但并不意味着对发明的任何限制。
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实施例1 IEGR-HV2(FH)和LGPR-HV2 (TH)的制备及其防治血栓形成功能1.! 和TH蛋白的获取通过PCR将限制性酶切位点Β ο I和凝血因子)(a识别序列IEGR或凝血酶识别序列LGPR对应的碱基序列引入HV2基因的上游，在HV2基因下游引入EcoR I酶切位点，将该基因连接到相同酶切的PPIC9质粒上，得到重组质粒pPIC9-Hi和pPIC9_TH。将pPIC9_Ri和 PPIC9-TH和pPIC9K用BamH I和I双酶切后进行连接，得到pPIC9K_FH和pPIC9K_TH。 将两个重组质粒电转化重组到酵母基因组，甲醇诱导表达。经分离纯化得到蛋白ra和TH。2. FH和TH的抗栓作用和出血副作用分析①Ri和TH在Carrageenin诱发的小鼠尾部血栓模型中的抗栓作用，每组动物10 只，给药剂量为2.5mg/kg。结果以χ 土 S表示，见表1。表1 ra和TH对小鼠尾部血栓长度的影响
权利要求
1.含有被凝血酶或凝血因子)(a识别并裂解的寡肽的抗凝血蛋白，其为在水蛭素氨基末端连接寡肽IEGR或LGI3R而成的融合蛋白ra(IEGR_HV2)或TH(LGPR_HV2)。
2.制备权利要求1的抗凝血蛋白的方法，其包括将IEGR或LGPR序列对应碱基与水蛭素基因连接而成融合蛋白基因，然后将该融合蛋白基因连接入适当的表达载体，在大肠杆菌，酵母或动物细胞体系中表达，表达后通过分离纯化获得融合蛋白ra或TH。
3.药物组合物，其含有权利要求1的抗凝血蛋白、及药用载体或赋形剂。
全文摘要
本发明涉及含有被凝血酶或凝血因子Xa识别并裂解的寡肽的抗凝血蛋白，更具体地说，本发明涉及抗凝血物质与能被凝血酶或凝血因子Xa识别并裂解的氨基酸序列连接而成的新的抗凝血物质或抗凝血物质与其他物质通过能被凝血酶或凝血因子Xa识别并裂解的氨基酸序列作为寡肽连接而成的新物质，以及这些新的抗凝血物质的医药学用途。
文档编号C12N15/62GK102443065SQ20111034307
公开日2012年5月9日 申请日期2006年6月1日 优先权日2005年6月1日
发明者于爱平, 吴祖泽, 唐仲雄, 牛晋阳, 石炳兴, 苑宾, 董春娜, 靳继德 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所