专利名称：一种植物内生菌生物转化葡萄干提取物及其制备和在烟草加香中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物制备烟用香料技术领域，具体地说是一种植物内生菌生物转化葡萄干提取物及其制备和在烟草加香中的应用方法。
背景技术：
目前烟用香料的制造方法有两个，从烟草或其他植物中提取天然香料，或者采用传统的化工方法合成香料。然而，这两种方法均存在其各自的局限性，对于某种植物香料， 其香气组分及特征是恒定的，我们很难按照对香味的需要使植物产生具有另一种风味的香料，而且植物提取香料的开发由于可用植物资源的有限而存在局限性。对于化工合成香料， 除香气单一外，由于受合成方法及条件的限制，很多优良香气成分尚不能人工合成，或成本太高。人们在继续原有生产技术的同时将更多的目光投入到开发天然香料产品可替代资源方面，生物技术就是生产天然香料产品最有前途的方法之一。植物内生菌是一个多样性十分丰富的微生物类群。分布在没有外部感染的植物组织内，并与宿主植物协同进化，能产生丰富多样的具有生物活性的代谢产物。利用植物内生真菌，来研究开发天然香料，将有十分广阔的前景。葡萄干营养丰富，它的含水量只有15-25%，富含糖、氨基酸、维生素等营养成分， 被誉为“世界水果的明珠”。葡萄干是新鲜葡萄在一定温度和湿度下经过一段时间晾晒下制成的，是一个自然发酵的过程，和新鲜葡萄相比，香气浓郁，口感甜润，受葡萄干自然发酵的启发，本发明人利用植物内生菌对葡萄干进行生物转化，以期对葡萄干进行进一步发酵，丰富葡萄干的香味。由于微生物在增殖过程中可产生庞大的高活性酶系，如多糖水解酶类、蛋白酶类、 纤维素酶类、酯化酶类、氧化还原酶类及裂合酶类等，在酶促作用、化学作用及微生物体内复杂代谢的协同作用下，便可使底物发生分解、降解、氧化、还原、聚合、偶联、转化等作用， 形成复杂的低分子化合物，其中包括各种香味化合物，如醇类、醛类、酮类、酸类、酯类、酚类、呋喃类、吡嗪类、吡啶类和萜烯类等。这些香气物质也是烟草的香气组分。现有技术中， 利用植物内生菌对葡萄干提取物进行生物转化生产特色烟用香料的方法未见报道。
发明内容
本发明提供一种植物内生菌生物转化葡萄干提取物及其制备和在烟草加香中的应用方法。本发明制成的植物内生菌生物转化葡萄干提取物，具有独特的清甜香韵特征，将其应用于烟草加香中，烟气中有果甜香，烟气细腻感增加，刺激和残留减少，余味舒适。—种植物内生菌生物转化葡萄干提取物的制备方法，包括以下步骤(1)植物内生菌的培养将IOOmLPDB培养基装于250mL三角瓶中，用接种环挑适量植物内生菌菌丝接种于三角瓶中，放置于30-37°C的恒温培养箱中培养Μ-2 !使菌种活化，在转速为150r/min下摇瓶培养，得到活化的种子液，所述的植物内生菌为青霉属(Penicillium sp.)EFCI-24 ；保藏编号为 CCTCC NO :M2011342 ；(2)葡萄干提取物的制备将挑好、洗净的葡萄干放入圆底烧瓶中，按葡萄干体积百分比浓度为65-75%的酒精=1 5. 5-6. 5的重量比混合，在75-85°C加热回流萃取2. 5-3. 5h，提取1_2次，降温至室温，过滤，收集滤液。将滤液在温度45-55°C，真空度不低于0. 95Mpa的条件下浓缩至溶剂蒸发一半，得葡萄干提取物，115°C下灭菌15-20min ；(3)生物转化葡萄干提取物将培养好的植物内生菌接种到灭菌后的葡萄干提取物中，接种体积比为种子液 葡萄干提取物=1 50-100，置于30-37°C的恒温振荡器，转速为150r/min下培养M-28h ；(4)将培养后的葡萄干提取物使用板框过滤，过滤其中的菌种，得到生物转化的葡萄干提取物。一种植物内生菌生物转化葡萄干提取物是由上述的方法制备而成的。上述的植物内生菌生物转化葡萄干提取物可以作为烟用香料，添加到香烟中。发明人在研究过程中发现利用产物中挥发性成分的变化来比较内生菌生物转化葡萄干提取物的效果，葡萄干提取物用二氯甲烷萃取，将有机相减压浓缩，进GC-MS，分析其中的香气成分，发现生物转化后葡萄干中的DDMP (2，3- 二氢-3，5- 二羟基-6-甲基-4H-吡喃酮)和5-羟甲基糠醛含量都有增加，生物转化后的葡萄干提取物清甜香增加。本发明的方法工艺过程简单，成本低廉，所得生物转化的葡萄干提取物烟用香料能直接用于卷烟的加香加料。生物转化的葡萄干烟用香料具有独特的清甜香韵特征，添加在卷烟中有降低刺激，丰富和饱满烟气，增加有果甜香，烟气细腻感增加，余味舒适。本发明的植物内生菌已于2011年10月10日在中国湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心进行了保藏。保藏编号为CCTCC N0:M2011342;命名为青霉属 (Penicillium sp.)EFCI_24。
图1为本发明中分离得到的喜树碱内生菌在光学显微镜下的形态学图片。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。实施例1(1)喜树碱内生菌的分离和纯化用无菌刀刮去喜树碱树皮外表皮后，用无菌水冲洗干净，切成IcmXlcm的小块， 置于75%乙醇消毒lmin，而后用2. 5%次氯酸钠溶液消毒lOmin，再用75%乙醇消毒lmin， 无菌水冲洗2-3次，剪去边缘，接入PDA平板培养基上。待树皮表面长出菌丝后挑取其尖端部分移至新鲜PDA培养基上，按照平板划线分离法反复进行分离纯化培养，用接种环以无菌操作沾取少许树皮表明长出的菌丝，在无菌平板表面进行连续划线，菌丝细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。(2)喜树碱内生菌形态学研究对纯化后的喜树碱内生菌用光学显微镜进行了形态学观察，显微镜下观察菌丝多分枝，有隔膜，菌丝直径为2. 6-3. 5 μ m在隔膜处会有一个类似收缩的效应，因此整个菌丝呈现出藕节状。分生孢子从菌丝细胞长出，有分枝，分生孢子梗直径约为2. 4-2. 7 μ m，具横隔，顶端不膨大，有扫帚状分枝(图1)。孢子形态为圆形或椭圆形、成串、不光滑，大小为 1. 2-1. 4μ m。(3)喜树碱内生菌生理特征和鉴定IOOmLPDB培养基装于250mL三角瓶中，用接种环挑适量植物内生菌菌丝接种于三角瓶中，放置于30-37°C的恒温培养箱中培养Μ-2 !后，能产生白色菌丝，之后白色菌丝匍匐生长，第2天在菌落的中心产生墨绿色粉末状孢子，到第3天菌落的最中心产生瘤状突起，边缘有白色气生菌丝；培养基的背面青黄色。液体培养时候生长快速，3d就达到了生长的对数期，然后停止摇床，6d后有墨绿色菌苔布满表面。菌球白色，菌液青绿色。经过查阅文献，初步可以鉴定为青霉属。(4)葡萄干提取在装有回流管、搅拌子的500mL圆底烧瓶中加入50g葡萄干和300mL 70%乙醇， 80°C下加热回流池，提取2次，过滤，合并滤液，50°C下真空度不低于0. 95Mpa减压浓缩至溶剂蒸发一半，得200g左右的葡萄干提取物。(5)葡萄干提取物的灭菌将上述得到的葡萄干提取物在高压蒸汽式灭菌锅中115°C下灭菌15-20min。(6)生物转化葡萄干提取物IOOmLPDB培养基装于250mL三角瓶中，用接种环挑适量植物内生菌菌丝接种于三角瓶中，放置于35°C的恒温培养箱中，150r/min摇床培养2 后得种子液，将培养好的内生菌种子液接种到灭菌后的葡萄干提取物中，置于转速为150r/min下35°C的恒温培养箱中转化25h，接种体积比为种子液葡萄干提取物=1 80，将生物转化好的葡萄干提取物中的菌种使用板框过滤，得到生物转化的葡萄干提取物烟用香料。发明人对本发明的方法生产的产品进行了检测，通过气相色谱-质谱对葡萄干提取物和生物转化后的葡萄干提取物进行了检测，其结果见表1。表1葡萄干提取物生物转化前后挥发性成分GC-MS数据比较
权利要求
1.一种植物内生菌生物转化葡萄干提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)植物内生菌的培养将IOOmLPDB培养基装于250mL三角瓶中，用接种环挑植物内生菌菌丝接种于三角瓶中，放置于30-37°C的恒温培养箱中培养Μ-2 !使菌种活化，在转速为150r/min下摇瓶培养，得到活化的种子液，所述的植物内生菌为青霉属(Penicillium sp.)EFCI-24 ；保藏编号为 CCTCC NO :M2011342 ；(2)葡萄干提取物的制备将挑好、洗净的葡萄干放入圆底烧瓶中，按葡萄干体积百分比浓度为65-75%的酒精 =1:5. 5-6. 5的重量比混合，在75-85°C加热回流萃取2. 5-3. 5h，提取1_2次，降温至室温；过滤，收集滤液；将滤液在温度45-55°C，真空度不低于0. 95Mpa的条件下浓缩，浓缩至溶剂蒸发一半，得葡萄干提取物，在高压蒸汽灭菌锅中115°C下灭菌15-20min ；(3)生物转化葡萄干提取物将培养好的植物内生菌接种到灭菌后的葡萄干提取物中，接种体积比为种子液葡萄干提取物=1 50-100，置于30-37°C的恒温振荡器，转速为150r/min下培养M-28h ；(4)将培养后的葡萄干提取物使用板框过滤，过滤其中的菌种，得到生物转化的葡萄干提取物。
2.一种植物内生菌生物转化葡萄干提取物，其特征在于，是由权利要求1所述的方法制备而成的。
3.权利要求2所述的植物内生菌生物转化葡萄干提取物的应用方法，其特征在于，作为烟用香料，添加到香烟中。
4.一种植物内生菌，其特征在于，为青霉菌(Penicillium sp. )EFCI_24。
全文摘要
本发明属于烟用香料技术领域，特别涉及一种植物内生菌生物转化葡萄干提取物及其制备和在烟草加香中的应用。方法依以下的步骤进行，(1)植物内生菌的分离和纯化；(2)内生菌的培养；(3)葡萄干的提取和精制；(4)用植物内生菌对葡萄干提取物进行生物转化，得到生物转化的葡萄干提取物。本发明的方法工艺过程简单，成本低廉，所得生物转化的葡萄干提取物能直接用于卷烟的加香加料。生物转化的葡萄干提取物香料具有独特的清甜香，添加在卷烟中有降低刺激，甜香感、烘烤香突出。
文档编号C12R1/80GK102392050SQ20111034292
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月3日 优先权日2011年11月3日
发明者刘佳佳, 卢红兵, 杨华武, 赵国玲 申请人:湖南中烟工业有限责任公司