专利名称：冬虫夏草菌和三七提取物的组合物及其在防治肺纤维化上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药技术领域。具体涉及冬虫夏草和三七提取物的组合物及其在制备防治肺纤维化药物中的应用。
背景技术：
冬虫夏草是特指寄生在蝠蛾属(Hepialus)幼虫上的一种子囊菌。所谓‘草’，就是它的子座；‘虫’就是它的菌核，只是其菌核外面包裹着一层虫尸皮壳。
冬虫夏草主要生长在中国青藏高原海拔3500-5000米的高山草甸。属国家二级保护物种。近代由于过度采挖，资源已近枯竭，价格已贵过黄金。分离和人工培养冬虫夏草菌，已成为当今科技工作者的重要任务。人们已从冬虫夏草中分离得多种真菌。如中国拟青霉(Paecilomyces sinensis Chen，Xiao&Shi)，虫草头孢(Cephalosporiumsinensis C.T.Chen.)，被孢霉(Mortierella sp)和中国被毛孢(Hirsutella sinensisX.J.Liu，Y.L.Guo，Y.X.Yu & W.Zeng)等，并已用工业发酵技术生产出它的菌丝体，开发成‘金水宝’、‘宁心宝’、‘至灵胶囊’等多种虫草产品。但近期人们用DNA指纹图谱鉴定，发现上述拟青霉、头孢菌等的DNA图谱和天然冬虫夏草差异甚大，不宜称作是冬虫夏草菌。只有中国被毛孢的DNA指纹图谱与天然的冬虫夏草相吻合，相似率高达96％。因而，中国被毛孢被认为是真正的冬虫夏草菌(菌物系统19(1)60-64，2000；菌物系统22(1)161-176，2003)。
冬虫夏草是中国珍贵药材，其有效成分为虫草腺苷(adenosine)、虫草酸(cordycepicacid)和虫草多糖(polysaccharides)。主要功能是补肺益肾，止血化痰。(中华人民共和国药典2005年版一部，p.75)。
三七是五加科植物三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根及根茎，是中国特有的名贵中药。三七的活性成分为皂苷(saponins)，它除含有同属植物人参所有的Rg1、Rb1、和Rd等人参皂苷外，另含三七特有的R1、R2、R3、R4、R6、R7等三七皂苷(notoginsenosides)，被誉为‘参中之王’。三七的药用功能为散瘀止血，消肿定痛。(中华人民共和国药典2005年版一部，p.10-11)。
肺纤维化(Pulmonaryfibrosis，PF)是大量成纤维细胞在肺细胞外沉积，并伴有肺部炎症和肺组织结构破坏的肺部疾病，迄今尚无特效药(Ward PA，HunninghakeGWLung inflammation and fibrosis.American Journal of Respiratory and Critical CareMedicine，1998，157123-129)。肺纤维化在中医界称为肺瘘，是以气短喘促，咳吐浊沫为主证的肺部虚损性患疾。前期主要表现为肺泡炎症，后期为肺间质纤维化，最后导致肺功能衰竭(北京中医，1996年第5期.9-10页)。
2005年，田琼发现，紫花龙胆和三七总皂苷组方可抑制慢性阻塞性肺疾的纤维化(CN1698725)，但该组方未应用冬虫夏草或其真菌。
2006年，上海中医药大学公开了“一种能改善肺纤维化的中药制剂”(CN1788764)，该制剂由桃仁、丹参、绞股兰、发酵虫草菌粉、松花粉和五味子组成。首次应用虫草菌丝体防冶肺纤维化。但该发明所用的“发酵虫草菌粉”，未指明由何种真菌发酵而成，所用的中药亦无三七组分；2007年1月，杭州赐富生物技术有限公司等发现冬虫夏草和隐孔菌(含其发酵物)有抑制肺纤维化作用，且复方比单方更好(CN1899318)。该专利首次用中国被毛孢的发酵物作为冬虫夏草菌的发酵物，但该发酵物仅为它的菌丝体和培养液，非提取物。此外，该复方中亦无三七提取物。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于应用冬虫夏草菌(中国被毛孢菌)和三七的提取物，设计它们的组合物及其在防治肺纤维化中的应用。
本发明提供了冬虫夏草菌和三七提取物的组合物。所述组合物含有重量％配比为90％-10％的冬虫夏草菌提取物和10％-90％的三七提取物。
所述冬虫夏草菌的原料为中国被毛孢菌的菌丝体或菌粉(菌絲体和醪液)，它们可以自行通过深层培養获得，也可从市埸上购得。要求所用的菌种必需是中国被毛孢，其腺苷含量不低于0.14％，虫草酸不少7.0％，虫草多糖不少于1.0％中药提取物(Extraction)是中药生药进一步分离纯化的产物，活性成分得到高度浓缩，是中药生药的精华。本发明应用的冬虫夏草菌提取物，其有效成分--虫草腺苷、虫草酸和虫草多糖比冬虫夏草菌絲体或菌粉高3-8倍；三七提取物中的三七总皂苷含量，比三七生药提高7-10倍。
本发明的另一目的是提供了冬虫夏草菌和三七提取物的制备方法，该方法包括下列步骤(一)冬虫夏草菌提取物的制备(1)取中国被毛孢发酵菌丝体或菌粉加菌丝体或菌粉汁8-10倍量(w/v)的水，在90-98℃下搅拌提取1-3小时；(2)过滤后得水提取液①；残渣另用5-8倍量(w/v)的水，在90-98℃下搅拌提取1-2小时，过滤得水提取液②，再用5-8倍量(w/v)的水，在90-98℃下搅拌提取1-2小时，过滤得水提取液③；(3)合并水提取液①、②、③，减压浓缩至比密度达1.04-1.09的浓缩液；(4)取水提后的残渣，加3-5倍量(w/v)的95％乙醇，回流萃取1-3小时，过滤后得醇提液④，残渣再加3-5倍量(w/v)的95％乙醇，回流萃取2次，过滤得醇提液⑤、⑥；(5)合并醇提液④、⑤、⑥，经减压浓缩得流浸膏；(6)将上述水提浓缩液和醇提流浸膏混和均匀，混匀液经喷雾干燥、冰冻干燥或真空干燥得冬虫夏草菌提取物；冬虫夏草菌提取物也可用中国被毛孢菌菌丝体为原料，经30-70％乙醇回流提取3次而得。溶剂用量第一次为以菌丝体或菌粉汁8-10倍，第2、3次为5-8倍量w/v，提取时间各为1-3小時，浓缩和干燥方法同上；要求本品中的虫草腺苷含量(以腺苷计)不低于0.5％、虫草酸(以甘露醇计)不低于20％，虫草多糖(以葡葡糖计)不低于5％，即提取物中的虫草腺苷、虫草素和虫草多糖含量，比原菌粉中的相应成分高3-8倍。(图1、表1)(二)三七提取物的制备(1)醇提取三七生药(根)的粗粉，用以三七粗粉汁8-12倍量(w/v)50-75％乙醇回流提取2-3小时，过滤得醇提液；残渣再用8-10倍量(w/v)50-75％乙醇重复提取2次，将3次醇提液减压浓缩至干，得三七醇提物；(2)吸附用非极性的大孔吸附树脂作吸附剂；先将上述三七醇提物加水溶解，配成每毫升相当于含生药0.3-0.5g的溶液，然后流经层析柱，使三七皂苷吸附于HPD-100大孔吸附树脂上；(3)脱附先用水洗脱层析柱，以去除糖等杂质。然后再用50-70％乙醇洗脱；使三七皂苷从吸附柱上脱附下来。合并含皂苷的醇洗脱液，(4)脱色按步骤(3)获得的醇洗脱液，加1％活性炭(w/v)，攪拌脱色30分钟，(5)干燥按步骤(4)得到的脱色液，经过滤后取滤液。滤液经减压浓缩、真空干燥，得本品。
三七提取物也可从三七的根茎提取，方法同上。要求三七提取物中的总皂苷含量不低于70％，比原三七生药中的皂苷含量高7-10倍。(表1)表1.冬虫夏草菌和三七原药材及其提取物中活性成分含量比较*
*虫草腺苷含量按中华人民共和国卫生部《保健食品检验与评价技术规范(2003年版)》P.300-301，“保健食品中腺苷的测定”方法测定；虫草酸的含量，按董春明的《HPLC法测定冬虫夏草中的甘露醇》方法测定(甘肃化工，2005年第3期，p.45-48)虫草多糖的含量参照中华人民共和国药典2005年版一部，p.130，灵芝多糖的方法测定；三七总皂苷按中华人民共和国卫生部《保健食品检验与评价技术规范(2003年版)》P.306-307，“保健食品中总皂苷的测定”方法测定；本发明的冬虫夏草菌和三七提取物的组合物可按常规方法与药用辅料制成口服颗粒剂、片剂、胶囊剂或口服液等药物组合物。
本发明的另一目的是提供了冬虫夏草菌和三七提取物在制备防治肺纤维化药物中的应用。
本发明通过下列试验观察治疗肺纤维化的效果。
本发明人采用经典的由博莱霉素(bleomycin，BLM)致敏的鼠肺纤维化动物模型，测试冬虫夏草菌和三七提取物对肺纤维化的治疗效果，并与激素(醋酸泼尼松)治疗组作比较。
博莱霉素由气管注入，用量5mg/Kg，注入后立即将小鼠旋转，使BLM在鼠肺内均匀分布。在小鼠注入博莱霉素后次日，给本发明提取物或激素治疗，剂量分别是0.15-0.6g/Kg或6.67mg/Kg。
各组小鼠在饲养第7、14和28天时，剖胸取肺。右肺经匀浆后，测羟脯氨酸的含量(肺胶原化程度指标)；左肺作病理切片，用Saepiel SV et al法(Am Rev RespirDis，1979，120893-899)，对各组小鼠的肺泡炎和肺纤维化程度作出评分，并用SPSS11.5软件将等级评分转化为计量数据。
结果本发明冶疗组和模型组相比，差异非常显著，其肺泡炎程度只有模型组的一半，肺纤维化程度还不到模型组的三分之一。第28天时，本发明冶疗组的羟脯氨酸含量，还明显低于激素冶疗组，与正常组的相当(表2、3、4)。
表2 冬虫夏草菌和三七提取物对博莱霉素致敏小鼠肺泡炎的治疗效果☆(x±s，n＝8)
☆博莱霉素致敏后第7天表3 冬虫夏草菌和三七提取物对博莱霉素致敏小鼠肺纤维化程度的影响☆(x±s，n＝8)
☆博莱霉素致敏后第14天表4 冬虫夏草菌和三七提取物对博莱霉素致敏小鼠肺组织中羟脯氨酸含量的影响☆(ug/mg，x±s，n＝8)
☆博莱霉素致敏后第28天本发明将冬虫夏草和三七提取物配伍成中药复方，每方又取用其活性成分得到高度浓缩的提取物，因此，其抑制肺纤维化的效果十分明显。
冬虫夏草菌和三七提取物可制成防治肺纤维化的药物。
图1冬虫夏草菌及其提取物的HPLC色谱图。
*HPLC仪Beckman System Gold型，125 HPLC泵，168光电二极管阵列紫外检测器，柱Hypersil BDS-C18(4.6mm*250mm，5um)，流动相甲醇0.01mol/LKH2PO4＝9∶91，柱温箱温度25℃，流量1ml/min。检测波长254nm，操作软件Beckman 32Karat。
图解上图红色线条为冬虫夏草菌菌粉提取物的吸收曲线；黑色线条为冬虫夏草菌菌粉的吸收曲线；虫草腺苷的RT值为15’，前者虫草腺苷的吸收峰面积为7714155，后者为1612200，前者比后者大4.8倍。
图2-5冬虫夏草和三七提取物治疗肺纤维化小鼠肺组织病理切片图(治疗28天；HE×40)。
图2正常对照组肺组织结构清晰，肺泡壁未见增厚，肺泡上皮细胞结构完整，肺泡腔透亮。未见炎症细胞侵润及间质胶原沉积；图3博莱霉素模型组見大小不等的纤维组织增生灶，肺泡间隔明显增宽，肺泡结构破坏严重，部分肺泡腔消失；图4激素治疗组与模型组比，肺泡结构基本完整，部分肺泡间隔增宽，周边見少量胶原沉积；图5冬虫夏草和三七提取物治疗组肺泡结构完整，肺泡腔透亮，成纤维细胞有增生和胶原沉积量少，与与模型组比，肺纤维化已明显改善。
具体实施例方式本发明提供的冬虫夏草和三七提取物组合物具有明显的抑制小鼠肺纤维化效果，能用于制备防治抑制肺纤维化的药物组合物，在临床上有较大的应用价值。
实施例1.冬虫夏草菌提取物的制备一，从中国被毛孢发酵菌絲体中提取(1).取中国被毛孢发酵菌絲体10Kg，加无离子水100Kg，在95℃(±3)下提取2小时。趁热用50μ滤膜过滤，得水提取液1；残渣另用60Kg无离子水在95℃(±3)下提取2次，每次1小时，过滤后得水提取液2、3；(2).合并水提取液1、2和3，减压浓缩至比密度达1.04，得冬虫夏草菌的水提取浓缩液；(3).将上述水提后残渣加95％乙醇50Kg，在80℃(±1℃)下，回流萃取3小时，趁热用50μ滤膜过滤，得醇提液1，残渣再加95％乙醇25Kg，在80℃(±1℃)下回流萃取2次，每次1小时，过滤后得醇提液2、3；(4).合并醇提液1、2、3，减压浓缩，得流浸膏；(5).将上述水提取浓缩液和流浸膏混和，在60℃下真空干燥至含水量低于5％；(6)粉碎后即为冬虫夏草菌提取物。
本品经用HPLC和分光光度法分析，含虫草腺苷0.95％，虫草酸34.18％，虫草多糖8.98％，而原菌粉的虫草腺苷为0.19％，虫草酸7.36％，虫草多糖1.60％，提取物比原菌粉分别提高4.8、4.6和5.6倍。(表1)二、从中国被毛孢菌粉(醪液干粉)中提取取中国被毛孢菌粉10Kg，加100Kg50％乙醇回流提取3小時，过滤得提取物1，残渣再加50Kg浓度为40％的乙醇回流提取两次，每次1.5小時，过滤得提取物2和3，合并提取物1、2和3，减压浓缩至比密度为1.04后喷露干燥，即得。经用HPLC和分光光度法测定，其虫草腺苷含量为0.64％，虫草酸含量为25.17％、虫草多糖含量为5.82％。
实例2.三七提取物的制备一、从三七根中提取(1).取三七生药(根)10Kg，切片、粉碎，过8目筛；(2)加10倍量的70％乙醇，回流提取2小时，过滤后得醇提液1；(3)残渣再用8倍量的70％乙醇回流提取2次，每次1小时，过滤后得醇提液2、3；(4).合并醇提液1、2和3，减压浓缩，得流浸膏；(5).在流浸膏中加无离子水溶解，使溶液浓度达每毫升相当于含生药0.4克；(6).将上述溶液上样于大孔吸附树脂(HPD-100型)层析柱上，使皂苷吸附在树脂上，树脂用量4Kg，上样量约为柱体积的1.5倍；(7).洗脱先用水，约需用2个柱体积的水，以洗除杂质；然后用50％的乙醇将吸附在树脂上皂苷洗下，洗脱速度每分钟0.6-0.9ml。同时用薄层层析法监测，收集含三七皂苷的洗脱液；(8).合并含三七皂苷的洗脱液，加100g活性炭回流脱色30分钟；(9).减压抽滤，得滤液。滤液经浓缩，流浸膏，真空干燥后即得本品。
本品HPLC法测定，含三七总皂苷75.1％，比三七生药高9.6倍(表1)二、从三七根 中提取(1).取三七根茎10Kg，切片、粉碎，过12目筛；(2)加10倍量的70％乙醇，回流提取2小时，过滤后得醇提液1；(3)残渣再用8倍量的70％乙醇回流提取2次，每次1小时，过滤后得醇提液2、3；(4).合并醇提液1、2和3，减压浓缩至呈流浸膏；(5).在流浸膏中加无离子水溶解，使溶液浓度达每毫升相当于含生药0.35克；(6).将上述溶液加样于D-101大孔吸附树脂层析柱上，
(7).先用水洗脱3个柱体积的量，然后用50％的乙醇将吸附在树脂上的皂苷洗下，(8).合并含三七皂苷的洗脱液，加1％(w/v)活性炭，回流脱色30分钟；(9).过滤，滤液经浓缩呈呈粘稠状流浸膏，真空干燥，即得。
本品经HPLC法分析，含三七总皂苷74.3％。
实例3.抗肺纤维化测定将上述制得的冬虫夏草菌提取物和三七提取物，按7∶3的比例相混和，然后用0.6g/Kg的剂量作治疗量，灌胃于用博莱霉素致敏的肺纤维化小鼠。在给药后第7、14和28天，比较观察各组病理切片的肺泡炎和肺纤维化程度及肺组织中的羟脯氨酸含量，并与正常小鼠、博莱霉素模型组和激素治疗组相比较。
结果模型组第7天的肺病理切片中，肺泡腔已见有大量巨噬细胞、中性粒细胞和浆细胞渗出，肺泡炎明显；在第14天的肺病理切片中，肺泡间隔已增宽，成纤维细胞和胶原基质大量增生；在第28天的肺病理切片中，部分肺泡结构已破坏，肺泡腔萎缩，肺泡间隔显著增厚并形成纤维化瘢痕。而本发明治疗组的病理切片中，无论早期的肺泡炎(第7天)，或中、后期的肺纤维化和胶原化程度(第14和28天)，均明显低于模型组。如模型组第七天的肺泡炎Saepiel评分值为2.38，本发明冶疗组仅为0.88(P＜0.01)，比模型组减轻一半多；又如第14天的肺组织纤维化程度，模型组的Saepiel评分值为1.75，本发明治疗组仅为0.38(P＜0.01)，比模型组减轻3/4；再如第28天的肺组织羟脯氨酸含量，模型组为0.88μg/mg，本发明冶疗组仅为0.68μg/mg(P＜0.01)，与正常对照组(0.63μg/mg)相当。见表2、3、4，和图I。
实例4按实施例一所述，分别制得冬虫夏草菌提取物和三七提取物，并按8∶2的比例相混和，然后用0.3g/Kg的剂量作治疗量，灌胃于已用博莱霉素致敏的肺纤维化小鼠，在给药后第7、14和28天，比较观察各组病理切片的肺泡炎、肺纤维化程度和肺组织中的羟脯氨酸含量，并与正常小鼠、博莱霉素模型组和激素治疗组相比较。结果本发明治疗组的肺泡炎Saepiel评分值为1.13，肺纤维化程度的Saepiel评分值为0.50，肺组织羟脯氨酸含量为0.66μg/mg，三项指标和模型组比，均呈显著差异(P＜0.01＝。见表2、3、4。
实例5按实施例一介绍的提取方法，分别制备得冬虫夏草菌提取物和三七提取物。然后按9∶1的比例相混和，用0.15g/Kg的剂量作治疗量，灌胃于已用博莱霉素致敏的肺纤维化小鼠，比较各组第7、14天病理切片的肺泡炎、肺纤维化程度和第28天的肺组织羟脯氨酸含量，并与正常小鼠、博莱霉素模型组和激素治疗组相比较。结果用本实施例配方来治疗肺纤维化，与实施例一、二相似，均能明显减轻由博莱霉素致敏的肺纤维化程度，即其肺泡炎、肺间质纤维化和胶原化程度，均得到明显改善。见表2、3、4。
权利要求
1.一种冬虫夏草菌和三七提取物的组合物，其特征在于所述组合物含有重量配比％为90％～10％的冬虫夏草菌提取物与10％～90％的三七提取物。
2.根据权利要求1所述冬虫草和三七提取物的组合物，其特征在于其中所述冬虫夏草菌的原料为中国被毛孢的菌絲体或菌粉。
3.一种如冬虫夏草菌和三七提取物的组合物的制备方法，其特征在于所述制备方法包括下列步骤(一)冬虫夏草菌提取物的制备(1)取中国被毛孢发酵菌絲体或菌粉，加菌丝体或菌粉计8-10倍量w/v的水，在90-98℃下搅拌提取1-3小时；或将中国被毛孢菌絲体或菌粉，直接用30-70％乙醇回流提取3次而得，溶剂用量第一次为以菌丝体或菌粉汁8-10倍量w/v，第2、3次为5-8倍量量w/v，提取时间各为1-3小時；(2)过滤后得水提取液①；残渣另用5-8倍量w/v的水，在90-98℃下搅拌提取1-2小时，过滤得水提取液②，再用5-8倍量w/v的水，在90-98℃下搅拌提取1-2小时，过滤得水提取液③；(3)将步骤(2)水提取液①、②、③合并，或将步骤(1)直接用30-70％乙醇回流提取3次的乙醇回流提取液，减压浓缩至比密度达1.04-1.09的浓缩液；(4)取水提后的残渣，加3-5倍量w/v的95％乙醇，回流萃取1-3小时，过滤后得醇提液④，残渣再加3-5倍量w/v的95％乙醇回流萃取2次，过滤得醇提液⑤、⑥；(5)合并醇提液④、⑤、⑥，经减压浓缩得流浸膏；(6)将上述水提浓缩液和流浸膏混和均匀，经喷雾干燥或冰冻干燥或真空干燥，得冬虫夏草菌提取物；冬虫夏草菌提取物中的虫草腺苷含量以腺苷计不低于0.5％、虫草酸含量以甘露醇计不低于20％，虫草多糖含量以葡葡糖计不低于5％。(二)三七提取物的制备(1)醇提取三七生药粗粉，用8-12倍量w/v的50-75％乙醇回流提取2-3小时，过滤得醇提液；残渣再用8-10量w/v70-75％乙醇，重复提取2次，每次1-2小時，将3次醇提液减压浓缩至干，得三七醇提物；(2)吸附用非极性的大孔吸附树脂作吸附剂，型号为HPD-100、D-101或AB-8；先将上述三七醇提物加水溶解，配成每毫升相当于含生药0.3-0.5g的溶液，然后流经层析柱，使三七皂苷吸附于大孔吸附树脂上；(3)脱附先用水洗脱层析柱，以去除糖等杂质。然后再用50-70％乙醇洗脱；使三七皂苷从吸附柱上脱附下来；(4)脱色合并含皂苷的醇洗脱液，加1％活性炭攪拌脱色30分钟；(5)干燥过滤得脱色液，脱色液经减压浓缩后、真空干燥得本品，其三七总皂苷的含量不低于70％。
4.一种权利要求1所述冬虫夏草菌和三七提取物的组合物在制备防治肺纤维化药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的冬虫夏草菌和三七提取物的组合物在制备防治肺纤维化药物中的应用，其特征在于所述药物为口服颗粒剂、片剂、胶囊剂或口服液。
全文摘要
本发明公开了冬虫夏草菌提取物和三七提取物及其在制备防治肺纤维化药物中的应用。冬虫夏草菌提取物是由中国被毛孢发酵菌粉进一步经水和乙醇提取、浓缩而成。其虫草腺苷、虫草酸和虫草多糖比原菌粉高3－8倍。三七提取物由三七生药经乙醇提取，大孔径吸附树脂分离、纯化而得，其三七总皂苷含量比原三七生药高7－10倍。将冬虫夏草菌和三七提取物，按90－10％和10－90％的重量％配比为原料制成药物组合物，用于治疗肺纤维化，1－4周后，显示其肺泡炎症、肺间质纤维化和胶原化均有显著减轻，在临床上有很大的应用价值。
文档编号A61K9/48GK101062074SQ20071004145
公开日2007年10月31日 申请日期2007年5月30日 优先权日2007年5月30日
发明者杨庆尧, 顾振纶, 杨晓彤, 张永胜, 李强, 展端, 糜可, 冯慧琴 申请人:上海芝草生物技术有限公司