一种猴头菌乙醇提取物的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种猴头菌乙醇提取物的制备方法，包括：(1)取猴头菌子实体粉碎成颗粒，然后溶于水中沸腾搅拌1～3h，静置冷却至室温后进行超声提取，然后进行离心，静置后取上清液，得猴头菌水提取液；(2)将猴头菌水提取液加入预处理过的大孔树脂，室温下吸附，然后使用乙醇进行洗脱，干燥后得到猴头菌乙醇提取物。本发明具有良好的分离效果、稳定性能和可循环重复利用的特点，适合于规模化生产；而且大孔吸附树脂吸附分离法具有有机溶剂用量少可回收、可重复性使用、再生简单，降低成本等诸多优点，可用于猴头菌中有效成分的富集分离和大工业生产。
【专利说明】一种猴头菌乙醇提取物的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食用菌提取领域，特别涉及一种猴头菌乙醇提取物的制备方法。
【背景技术】
[0002]目前我国以猴头菌为原料用于治疗胃病药品大约有100多种，幽门螺旋杆菌(116110013801:61-砂匕!^)是一种需氧型革兰氏阴性菌，大量临床研究表明能够引起慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌、胃粘膜等胃病。
[0003]猴头菌0161*1(3111111应用于胃肠疾病治疗具有鲜明的中国特色，在临床上广泛用来治疗慢性胃炎、胃十二指肠溃疡等疾病，积累了大量的临床经验和数据。上世纪60年代，上海市农科院食用菌所在我国首先驯化猴头菇人工栽培成功。70年代从民间了解到猴头菇有补胃功能，开始制作猴头糖浆对十二指肠溃疡患者作疗效试验，获得良好的治疗效果。
[0004]目前常用的提取猴头菌的方法主要是常规的水提醇沉，但是这样得到的猴头菌提取物抑制幽门螺旋杆菌活性成分少，并不能投入实际应用。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种猴头菌乙醇提取物的制备方法，该方法具有良好的分离效果、稳定性能和可循环重复利用的特点，适合于规模化生产；而且大孔吸附树脂吸附分离法具有有机溶剂用量少可回收、可重复性使用、再生简单，降低成本等诸多优点，可用于猴头菌中有效成分的富集分离和大工业生产。
[0006]本发明的一种猴头菌乙醇提取物的制备方法，包括:
[0007](1)取猴头菌子实体粉碎成颗粒，然后溶于水中沸腾搅拌1?3匕静置冷却至室温后进行超声提取，然后进行离心，静置后取上清液，得猴头菌水提取液；其中猴头菌颗粒与水的重量比为1:5?10 ；
[0008](2)将猴头菌水提取液加入预处理过的大孔树脂！！？0-100 (河北沧州宝恩化工有限公司)，室温下吸附，然后使用70%?100%乙醇进行洗脱，干燥后得到猴头菌乙醇提取物。
[0009]所述步骤⑴中的离心速度为800011)111，离心时间为10111111。
[0010]所述步骤(2)中的大孔树脂！！？0-100预处理步骤如下:在树脂柱内加入高于树脂层10厘米的90%乙醇浸泡4小时，放出浸液，用蒸馏水洗涤至流出液在试管中加水稀释不浑浊并且洗脱液用紫外光谱扫描不得检出吸收峰为止，再用水洗涤至乙醇含量小于1%，即可。
[0011]所述步骤(2)中的吸附为静态吸附，具体步骤如下:猴头菌水提取液浓度为1001118加1，溶液与大孔树脂的体积比为10:1，摇床1101^111，吸附1211。
[0012]所述步骤(2)中的洗脱为静态洗脱或动态洗脱。
[0013]所述静态洗脱具体为:将已吸附的大孔树脂！！？0-100，经3倍柱床体积的蒸馏水洗脱后，用95%乙醇溶液4倍柱床体积置恒温摇床110rpm、25°C、2h的条件下进行洗脱，颜色由深至浅，洗至无色；动态洗脱具体为:采用湿法或干法装柱的方式装柱，层析柱规格为径高比1:8，猴头菌水提取液上样浓度为0.lkg/L，树脂上样量为Ikg/1L，流速为1.5mL/min,用95%乙醇溶液进行洗脱。
[0014]所述步骤(2)中的干燥为冷冻干燥，最终得到颜色为黑褐色的猴头菌提取物产品O
_5] 有益.效果
[0016](I)本发明具有良好的分离效果、稳定性能和可循环重复利用的特点，适合于规模化生产；而且大孔吸附树脂吸附分离法具有有机溶剂用量少可回收、可重复性使用、再生简单，降低成本等诸多优点，可用于猴头菌中有效成分的富集分离和大工业生产；
[0017](2)本发明与未使用大孔树脂吸附前相比，该猴头菌醇提物抑菌活性提高了 20倍，优于未处理的猴头菌醇提物。
【具体实施方式】
[0018]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0019]实施例1
[0020]水提法制备猴头菌粗活性物质:
[0021]称取粉碎机粉碎成颗粒的猴头菌子实体干粉0.2kg，溶于水中沸腾搅拌I?3h，之后静置冷却至室温后用超声波进行超声2h提取,然后进行离心8000rpm, 1min,静置后取上清液，得猴头菌水提取物；其中猴头菌颗粒与水的重量比为1:5?10。
[0022]实施例2
[0023]大孔树脂性能的筛选
[0024](I)大孔树脂的预处理
[0025]取HPD-100，HPD-400，D101, AB-8 (购自河北沧州宝恩化工有限公司)，在树脂柱内加入高于树脂层10厘米的90%乙醇浸泡4小时，放出浸液，用蒸馏水洗涤至流出液在试管中加水稀释不浑浊并且洗脱液用紫外光谱扫描不得检出吸收峰为止，再用水洗涤至乙醇含量小于1%，即可使用。
[0026](2)树脂的吸附
[0027]量取已预处理的HPD-100、HPD-400、D101、AB-8大孔树脂各3份，每份1mL,分别置于250mL的三角瓶中，加入实施例1的样液10mL,即样液:树脂=10:1。置在摇床llOrpm，25°C，12h，使充分吸附。
[0028](3)树脂的洗脱
[0029]已吸附饱和的树脂，用3倍柱体积(BV)蒸馏水进行冲洗，以洗去杂质及不吸附成分，然后加入50mL的95%乙醇置恒温摇床IlOrpm, 25 °C, 2h的条件下进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，回收乙醇，得浓缩膏，稀释一定的倍数。
[0030]实施例3[0031〕 抑制幽门螺杆菌的最低抑菌浓度测定
[0032](1)供试样品的配制
[0033]精确称取实施例1制备的猴头菌水提物和实施例2制备得到的乙醇提取物样品于灭过菌的6卯611(101^管中，用75%乙醇配制成一定浓度的溶液。在超声下超声15111111。空白对照为75%乙醇，阳性对照组甲硝唑配置成2！11^111匕
[0034](2)幽门螺旋杆菌菌悬液的制备
[0035]挑取适量培养7211的菌落于11111布氏肉汤培养基中，超声约108，制成相当于
2.81:811(181-(1 (含菌 1 X 107 至 IX 1080? 11./1)菌悬液，该菌悬液现用现配。
[0036](3)羊血布式培养基的制备
[0037]称量81*11(361121培养基28.8并添加1000111[蒸馏水中，调节邱值为7.0±0丨2，分装为每瓶1001111,另加琼脂2吕在121灭囷15111111,临用如加7%无囷羊血。
[0038](4)最低抑菌浓度测定(祖0
[0039]取409 [的75%乙醇加到96孔板八1412中作为阴性对照，于812412加甲硝唑作为阳性对照。取等体积的供试样品加到81-811中，以移液枪按列对各样液进行2倍连续稀释，盖上板盖，紫外下挥干后，用移液枪吸100 ^ I羊血布氏培养基于96孔平板中，于41冰箱放置2处后紫外线照射约1501！！。接下来用无菌棉棒蘸取幽门螺旋杆菌菌悬液，依次接种于各孔中的培养基表面，放入培养箱中汍:5%；002:15%；^2:80% ), 371恒温培养72匕。以体视显微镜下观察各孔培养基表面，无细菌生长的为最低药物稀释浓度即IX。
[0040](5)实验结果
[0041〕 实施例1制备的猴头菌水提物对幽门螺旋杆菌的110101^/111匕实施例2得到的猴头菌乙醇提取物对幽门螺旋杆菌的IX分别为0.5-1呢/此(^0-100)、1-2^/1111 (^0-400) ,0.75-1.5^/1111 (0101)和 0.6-1.2呢/11^8-8)，结果表明使用大孔树脂^0-100吸附洗脱后得到的猴头菌乙醇提取物对11.^101-1 ^100的最低抑制浓度小于使用大孔树脂！！？0-400、八8-8和0101得到的乙醇提取物的最低抑菌浓度，并且与吸附前水提取相比，抑菌活性分别提高了 10倍以上，吸附活性效果较好。
[0042]实施例4
[0043]不同体积分数乙醇的洗脱效果
[0044](1)静态洗脱
[0045]取已吸附的树脂！！？0-100、八8-8，经3倍柱床体积的蒸馏水洗脱后，依次用10%、30%、50%、70%、90%和100%乙醇溶液各4倍柱床体积置恒温摇床1101~卿，251，2卜的条件下进行梯度洗脱，颜色由深至浅，分别洗至无色，收集洗脱液，浓缩至膏。浓缩膏稀释一定的倍数，测对只.￠7101-1的抑菌活性。
[0046](2)动态洗脱
[0047]孔树脂装柱子(径高比1:8),经3倍柱床体积的蒸馏水洗脱后，依次用10%、30%、50%、70%、90%和100%乙醇溶液各4倍柱床体积进行梯度洗脱，猴头菌水提取液上样浓度为0.14/1，树脂上样量为14/1匕流速为1.54/111111分别洗至无色，分段收集洗脱液，并浓缩成膏。用浓缩膏稀释一定的倍数测定对0.1)7101*1的抑菌活性。
[0048](3)实验结果
[0049]结果表明，两种洗脱条件对抑菌活性的效果相同，使用蒸馏水洗脱时IX均大于1mg/mL，而使用1 %、30 %、50 %乙醇洗脱时静态洗脱和动态洗脱液的MIC在5-1Omg/mL之间；使用HPD-100和10% -50%乙醇洗脱得到的洗脱液抑菌活性较差MIC均大于2.5mg/mL，而70%、90%和100%洗脱后得到的洗脱液的MIC分别为0.25-0.5mg/mL, 125_250mg/mL，0.25mg/mL，其中90%乙醇洗脱后的提取物抑制H.pylori ATCC的最低抑菌浓度最小为125-250mg/mL。结果显示抑制幽门螺旋杆菌的活性成分主要集中在70%，90%，100%乙醇洗脱液中，在70%，90 %，100 %三种体积分数的乙醇解吸液中，90 %乙醇对H.pylori抑菌活性最好，并且90%乙醇、100%乙醇洗脱后得到的洗脱液抑菌效果差别不大。
[0050] 实施例5
[0051 ] 体外抑制幽门螺旋杆菌验证实验
[0052]将实施例1制备得到的猴头菌粗提物浸膏配制成100mg/ml的水提取物溶液，然后进行如下方法提取。
[0053](I)HPD-1OO树脂提取:加入5L已预处理的大孔树脂HPD-100到溶解液中吸附24h，期间需不时搅拌，去上清，得到吸附后的大孔树脂，把吸附后的大孔树脂装柱子(径高比1:8)，依次用蒸馏水、50%乙醇溶液各4倍柱床体积进行梯度解吸，流速为1.5mL/min分别洗至无色，再用95%乙醇洗脱并浓缩成膏。
[0054](2)实验结果
[0055]使用HPD-100大孔树脂和95%乙醇提取得到的猴头菌乙醇提取物对五种幽门螺旋杆菌的最低抑制浓度分别为 0.5-lmg/mL(Helicobacter pylori ATCC)、0.125-0.25mg/mL (Helicobacter pylori SSI)、0.5-lmg/mL(Helicobacter pylori ff2504)>lmg/mL(Helicobacter pylori DXF)和 0.5mg/mL(Helicobacter pylori 78);而水提取物对五种幽门螺旋杆菌的最低抑菌浓度分别为2.5-5mg/mL (Helicobacter pylori ATCC)、5mg/mL(Helicobacter pylori SSI)、5mg/mL(Helicobacter pylori ff2504)>2.5-5mg/mL (Helicobacter pylori DXF)和 5mg/mL (He I icobacter pylori 78)。综合分析，使用HPD-100和95%乙醇洗脱得到的猴头菌乙醇提取物的活性提高了 20倍。
[0056](3)讨论
[0057]本实施例采取活性跟踪的方法对分离猴头固体发酵菌丝对H.pylori的抑菌组分进行富集，在选取的四种大孔树脂中，HPD-100大孔树脂对猴头固体菌丝的活性吸附能力最好，并确定了活性物质主要集中在50-95%乙醇洗脱液中最小抑菌活性为0.5-lmg/mL，活性比水提物提高了 20倍。这对以后研究HPD-100大孔树脂对猴头固体菌丝吸附有效活性物质的工艺研究中起到了基础性研究，而且大孔吸附树脂吸附分离法具有有机溶剂用量少可回收、可重复性使用、再生简单，降低成本等诸多优点，是一种高效低耗的分离纯化工艺，可用于猴头菌中有效成分的富集分离和大工业生产。
【权利要求】
1.一种猴头菌乙醇提取物的制备方法，包括: (1)取猴头菌子实体粉碎成颗粒，然后溶于水中沸腾搅拌I?3h，静置冷却至室温后进行超声提取，然后进行离心，静置后取上清液，得猴头菌水提取液；其中猴头菌颗粒与水的重量比为1:5?10 ; (2)将猴头菌水提取液加入预处理过的大孔树脂HPD-100，室温下吸附，然后使用70%?100%乙醇进行洗脱，干燥后得到猴头菌乙醇提取物。
2.根据权利要求1所述的一种猴头菌乙醇提取物的制备方法，其特征在于:所述步骤(1)中的离心速度为8000rpm,离心时间为lOmin。
3.根据权利要求1所述的一种猴头菌乙醇提取物的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中的大孔树脂HPD-100预处理步骤如下:在树脂柱内加入高于树脂层10厘米的90%乙醇浸泡4小时，放出浸液，用蒸馏水洗涤至流出液在试管中加水稀释不浑浊并且洗脱液用紫外光谱扫描不得检出吸收峰为止，再用水洗涤至乙醇含量小于1%，即可。
4.根据权利要求1所述的一种猴头菌乙醇提取物的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中的吸附为静态吸附，具体步骤如下:猴头菌水提取液浓度为100mg/ml，溶液与大孔树脂的体积比为10:1，摇床llOrpm，吸附12h。
5.根据权利要求1所述的一种猴头菌乙醇提取物的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中的洗脱为静态洗脱或动态洗脱。
6.根据权利要求5所述的一种猴头菌乙醇提取物的制备方法，其特征在于:所述静态洗脱具体为:将已吸附的大孔树脂HPD-100，经3倍柱床体积的蒸馏水洗脱后，用95%乙醇溶液4倍柱床体积置恒温摇床110rpm、25°C、2h的条件下进行洗脱，颜色由深至浅，洗至无色；动态洗脱具体为:采用湿法或干法装柱的方式装柱，层析柱规格为径高比1:8，猴头菌水提取液上样浓度为0.lkg/L，树脂上样量为Ikg/1L，流速为1.5mL/min，用95%乙醇溶液进行洗脱。
7.根据权利要求1所述的一种猴头菌乙醇提取物的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中的干燥为冷冻干燥。
【文档编号】A61P1/04GK104398539SQ201410503816
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年9月26日 优先权日:2014年9月26日
【发明者】李亮, 尚晓冬, 谭琦 申请人:上海市农业科学院