一种从微囊藻中提取类菌胞素氨基酸Shinorine的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从微囊藻中提取类菌胞素氨基酸Shinorine的方法，具体如下：1）将微囊藻粉与甲醇混合，超声，加热后，离心并收集上清；2）将上清液氮气吹干与蒸馏水复溶；3）加入氯仿混匀；4）离心，收集上清；5）针式过滤器过滤；6）利用strata-x固相萃取小柱处理，滤液冷冻干燥。利用本发明提取的类菌胞素氨基酸Shinorine，该方法简单，操作方便，安全可靠，最终产品的纯度达到85%-95%，可以作为标准品使用，为后续大规模提取定量打下坚实基础。
【专利说明】—种从微囊藻中提取类菌胞素氨基酸Shinor ine的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术和资源利用与可持续发展领域，更具体涉及一种从微囊藻提取类菌胞素氨基酸Shinorine的方法。
【背景技术】
[0002]目前，对微囊藻的利用几乎是空白，更不用说从微囊藻中提取类菌胞素氨基酸并加以利用了。
[0003]类菌胞素氛基酸(mycosporine and mycosporine_like)是一大类以环己稀丽为基本骨架，与不同类型氨基酸通过缩合作用形成的水溶性物质，能在真菌、海洋细菌、蓝藻和真核藻类细胞中合成，并在海生无脊椎动物和鱼类等生物体内积累，其分子大小一般小于400Da，这类物质在310-360nm范围内具有很强的光吸收能力。很多微囊藻都含有类菌胞素氨基酸，他们能帮助微囊藻抵抗紫外线的侵袭，为微囊藻的生长创造条件。类菌胞素氨基酸这类具有极强的抗紫外辐射的能力，可用于光保护行业，特别是化妆品行业。目前，我国使用的光保护物质主要是化学合成，长期使用化学合成物质对人体皮肤容易造成伤害，从而不利于人类健康。
[0004]而且，目前国内对类菌胞素氨基酸的提取涉及很少，并且纯度不高。特别是目前世界范围内都没有 商品的类菌胞素氨基酸标准品。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种从微囊藻中提取类菌胞素氨基酸Shinorine的方法，该方法简单，操作方便，安全可靠。
[0006]本发明的另一个目的在于提供了一种从微囊藻中提取类菌胞素氨基酸Shinorine的方法在制备的类菌胞素氨基酸Shinorine中的应用。通过该方法，得到的最终产品的纯度达到85%-95%，可以作为标准品使用，或其他商品化用途，为后续大规模提取定量打下坚实基础。为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施:
[0007]—种从微囊藻中提取类菌胞素氨基酸Shinorine的方法,具体步骤如下:
[0008]1.将微囊藻粉与无水甲醇以Ig:10-40ml的比例进行混合，先置于超声清洗仪中100%超声处理5-10min，然后置于40_50°C的水浴锅中处理2.5-4小时，期间上下混匀数次，9000-11000rpm/min条件下离心,离心15_20min,取上清；滤洛以上述微囊藻粉与无水甲醇的比例重新加入无水甲醇抽提，重复抽提2~3次，将收集的上清合并；
[0009]2.将收集的上清液置于氮吹仪中，氮气吹干，以蒸馏水与藻粉重量比为1:1~5:1加入蒸馏水复溶；
[0010]3.在复溶后溶液中加入等体积的氯仿，充分混匀；
[0011]4.以9000-11000rpm/min的条件下离心15_20min,收集上清液；
[0012]5.上清液过0.22 μ m针式过滤器，收集滤液；
[0013]6.滤液再经过strata-x固相萃取小柱处理，收集的滤液在-50~_60°C下冷冻干燥后称重。
[0014]本发明所用试剂或材料市售的均可使用，步骤6中用固相萃取小柱处理滤液时，可依据常规方式处理，或选择以下处理方式，步骤如下:
[0015]a:活化,先使用10_40ml的无水甲醇,然后使用10_40ml超纯水活化小柱,流速为2_5ml/min ；
[0016]b:上样:上样前样品溶液中加入0.2m/L的NaOH溶液，使样品pH值到6.5-8.0 ；
[0017]c:淋洗:先使用无水甲醇20-60ml,再使用超纯水活化20_60ml ;流速为2_5ml/min ；
[0018]d:洗脱:洗脱溶液使用0.1% (v:v)HCl甲醇10_20ml (所用HCL浓度为lm/1)，流速 2_5ml/min ；
[0019]e:收集的滤液在-50~-60°C下冷冻干燥后称重。
[0020]优选的，在步骤d中的洗脱溶液总体积不变的情况下，进行两次相同条件洗脱。[0021 ] 优选的，上样时不施加压力，使溶液自然流下。
[0022]所述的微囊藻可通过常规方式 进行培养，也可通过本发明所述方式进行，具体培养步骤如下:
[0023]1.培养液的配制:常规蓝藻培养基；
[0024]2.微囊藻的培养:
[0025](I)一级培养:由试管原种接种到250ml的培养瓶中，通气培养，调节气流到1_2L/min,气流经过针头式过滤器(0.22 μ m)无菌处理连接，光强控制在40-60 μ EnT2s'温度控制在25-28°C，当培养5-8天后，转入二级培养；
[0026](2)二级培养:将一级培养所得的培养物接入到2L培养瓶中，通气培养，调整气流到3-4L/min，气流经过针头式过滤器(0.22 μ m)无菌处理连接，光强控制在60-80 μ EnT2iT1,温度控制在25-28°C，当培养5-10天后，转入三级培养；
[0027](3)三级培养:将二级培养所得的培养物转移到IOL的培养瓶中，通气培养，调整气流到4-6L/min，气流经过针头式过滤器(0.22 μ m)无菌处理连接，光强控制在80-100 μ Επι?温度控制在25-28 °C，培养8-10天。
[0028]所述的微囊藻粉可通过常规方式制备，或采用本发明的制备方法，具体如下:
[0029]将微囊藻液超声波处理3个循环，每个循环超声波处理3min，暂停lmin，超声后的藻液置于离心机中离心，离心速度9000-11000rpm/min离心15_20min,获得微囊藻藻泥，-60一-80°C冷冻后，置于冷冻干燥机，-50一-60°C得到微囊藻藻粉。
[0030]本发明与现有技术相比，具有以下优点和显著地效果:
[0031]提取物杂质少，Shinorine纯度高，操作方便，设备简单，安全可靠，适用于制备标准品。
【具体实施方式】
[0032]实施例1:
[0033]微囊藻的培养:
[0034]1.培养液的配制:常规蓝藻培养基；
[0035]2.微囊藻的培养:[0036](I) 一级培养:由试管原种(4ml)接种到250ml的培养瓶中(内有培养基200ml)，通气培养，调节气流到l_2L/min，气流经过针头式过滤器(0.22 μ m)无菌处理连接，光强控制在40-60 μ EnT2S'温度控制在25-28 °C，当培养5_8天后，转入二级培养；
[0037](2) 二级培养:将一级培养所得的培养物全部接入到2L培养瓶(内有培养基1L)中，通气培养，调整气流到3-4L/min，气流经过针头式过滤器(0.22 μ m)无菌处理连接，光强控制在60-80 μ EnT2s-1,温度控制在25-28°C，当培养5_10天后，转入三级培养；
[0038](3)三级培养:将二级培养所得的培养物全部转移到IOL的培养瓶(内有培养基8L)中，通气培养，调整气流到4-6L/min，气流经过针头式过滤器(0.22 μ m)无菌处理连接，光强控制在80-100 μ EnT2s-1，温度控制在25-28°C，培养8_10天，即得微囊藻液。
[0039]将微囊藻液超声波处理3个循环，每个循环超声波处理3min，暂停lmin，超声后的藻液置于离心机中离心，11000rpm/min离心15_20min，-60一-80°C冷冻后，置于冷冻干燥机，-50~_60°C得到微囊藻藻粉。
[0040]所述的微囊藻为PCC7806铜绿微囊藻。
[0041]实施例2: [0042]一种从微囊藻中提取制备类菌胞素氨基酸Shinorine的方法，其步骤如下:
[0043]1.称取IOg实施例1制得的微囊藻粉加入100ml无水甲醇，先置于超声清洗仪中100%超声处理15min，然后置于45°C的水浴锅中处理3小时，期间上下混匀10次，11000rpm/min条件下离心15min,取上清,滤洛中重新加入100ml无水甲醇抽提,重复抽提3次，将收集的上清合并；
[0044]2.将收集的上清液置于氮吹仪中，氮气吹干后，使用IOml蒸馏水复溶；
[0045]3.将复溶后的溶液取出，加入等体积的氯仿，充分混匀；
[0046]4.以11000rpm/min的条件下离心15min,收集上清液；
[0047]5.上清液过0.22 μ m针式过滤器，收集滤液；
[0048]6.滤液再经过固相萃取小柱处理，收集的滤液在-50~_60°C下冷冻干燥后称重。过柱的具体步骤如下:
[0049]a:活化,先使用IOml的无水甲醇,然后使用IOml超纯水活化小柱,流速3ml/min ；
[0050]b:上样:上样前样品溶液中加入0.2m/l的NaOH溶液，使最终pH值为7.5 ;
[0051]c:淋洗:先使用无水甲醇20ml匀速淋洗,然后使用超纯水20ml匀速淋洗；流速3ml/min。
[0052]d:洗脱:使用洗脱溶液0.1% (v/v)的HCl甲醇5ml (所用HCL浓度为lm/1)进行洗脱，流速为3ml/min,收集滤液；
[0053]e:洗脱:再用洗脱溶液0.1% (v/v)的HCl甲醇5ml进行洗脱(所用HCL浓度为lm/1),收集滤液,流速为3ml/min;
[0054]f:将d、e两步收集的收集的滤液在-50~_60°C下冷冻干燥后称重。
[0055]本实施例所使用的针式过滤器为尼龙材料；固相萃取柱为phenomenex生产strata-χ 型号，规格是 6ml200mg ；
[0056]IOg 的藻粉获得 18.95mg 的 Shinorine,纯度是 95%。
[0057]本发明实施例中所述技术方案如未特别说明，均为本领域常规技术。
【权利要求】
1.一种从微囊藻中提取类菌胞素氨基酸Shinorine的方法,具体步骤如下: 1)将微囊藻粉与无水甲醇以lg:10-40ml的比例进行混合，先置于超声清洗仪中100%超声处理5-10min，然后置于40_50°C的水浴锅中处理2.5-4小时，期间上下混匀数次，9000-11000rpm/min条件下离心,离心15_20min,取上清；滤洛以上述微囊藻粉与无水甲醇的比例重新加入无水甲醇抽提，重复抽提2~3次，将收集的上清合并； 2)将收集的上清液置于氮吹仪中，氮气吹干，以蒸馏水与藻粉重量比为1:1飞:I加入蒸馏水复溶； 3)在复溶后溶液中加入等体积的氯仿，充分混匀； 4)以9000-11000rpm/min的条件下离心15_20min,收集上清液； 5)上清液过0.22 μ m针式过滤器，收集滤液； 6)滤液再经过strata-x固相萃取小柱处理，收集的滤液在-5(T-60°C下冷冻干燥后称重。
2.根据权利要求1所述的方法，固相萃取的具体步骤为: 活化:先使用10-40ml的无水甲醇,然后使用10-40ml超纯水活化小柱,流速为2_5ml/min ； 上样:上样前样品溶液中加入0.2m/L的NaOH溶液，使样品pH值到6.5-8.0 ； 淋洗:先使用无水甲醇20-60ml,再使用超纯水活化20-60ml ;流速为2_5ml/min ； 洗脱:洗脱溶液使用0.1%体积比的HCl甲醇10-20ml，流速2_5ml/min，收集的滤液在-5(T-6(TC下冷冻干燥后称重，所述HCL浓度为lm/1。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:在洗脱溶液总体积不变的情况下，洗脱两次。
4.根据权利要求1或2所述的方法，微囊藻的培养方法如下: A.培养液的配制:常规蓝藻培养基； B.微囊藻的培养: (1)一级培养:由试管原种接种到250ml的培养瓶中，通气培养，调节气流到l_2L/min，气流经过针头式过滤器无菌处理连接，光强控制在40-60 μ EnT2s'温度控制在25-28°C，当培养5-8天后，转入二级培养； (2)二级培养:将一级培养所得的培养物接入到2L培养瓶中，通气培养，调整气流到3-4L/min，气流经过针头式过滤器无菌处理连接，光强控制在60-80 μ EnT2s'温度控制在25-28°C，当培养5-10天后，转入三级培养； (3)三级培养:将二级培养所得的培养物转移到IOL的培养瓶中，通气培养，调整气流到4-6L/min，气流经过针头式过滤器无菌处理连接，光强控制在80-100 μ EnT2s'温度控制在 25-28 °C，培养 8-10 天。
5.权利要求1所述方法在制备的类菌胞素氨基酸Shinorine中的应用。
【文档编号】C07C249/02GK103755589SQ201310702909
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年12月19日 优先权日:2013年12月19日
【发明者】高合意, 虞功亮, 李仁辉 申请人:中国科学院水生生物研究所