专利名称：用于检测egfr外显子21多态性的引物组及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于检测EGFR外显子21多态性的引物组以及所述引物组的应用。
背景技术：
已经认为表皮生长因子受体(EGFR)在肺癌中起重要作用。能够阻抑(suppress) EGFR功能的药物已被用于肺癌治疗的领域。被用于治疗非小细胞肺癌患者的EGFR酪氨酸激酶抑制剂(如吉非替尼(gefitinib)、埃罗替尼(erlotinib)等等)作为此类药物已知。 这些药物不仅被用于肺癌，也被尝试用于腺癌。然而，在一些患者组中，EGFR酪氨酸激酶抑制剂的效果有时似乎不够。另外，在另一组患者中，尽管EGFR酪氨酸激酶抑制剂在开始诱导反应，但是存在EGFR酪氨酸激酶抑制剂的效果逐渐降低的情况，这与预期相反。因为这些原因，已针对抑制剂的使用研究了预测EGFR酪氨酸激酶抑制剂效果的因素，并已发现EGFR基因突变是此类重要因素。已知的预测性因素的例子包括EGFR外显子在密码子 790 处的突变(T790M) (JP2008-529532, Cancer Research, Vol. 66，No. 16，2006， pp. 7854-7858)，外显子 18 在密码子 719 处的突变(G719X) (Cancer Research, Vol. 66， No.16，2006，pp.7854-7858)。EGFR外显子21在密码子858处由亮氨酸到精氨酸的突变(EGFR外显子21L858R) 已被明确地认为能增强吉非替尼的肿瘤减小效应。因为在高百分比(约45%)的肺癌中发现了 EGFR突变，所以EGFR突变作为在给药前要考虑的预测性因素来说是重要的。直接测序方法(J.Clin. Oncology, Vol 23，No 11 (April 10) ,2005 pp. 2513-2520)或 SMAP(SMart-Abplification Process)方法(Clin Cancer Res2007 ； Vol. 13 (17) September 1,2007 :pp. 4974-4983)已知是检测 EGFR 外显子 21L858R 的技术。同时，突变检测方法已知是容易、灵敏并且可靠的检测突变的方法，该方法包括， 通过在一个反应中既使用突变型又使用野生型(正常型)引物，来优先扩增具有突变的碱基的核酸序列(W0 2010/001969)。
发明内容
实际测试中使用的样品是来自血浆或血清的可溶的DNA。在此类DNA中检测突变需要高特异性。然而，在直接测序方法中，特异性通常被认为是约10%，这可能不足以检测可溶DNA中的突变。同时，尽管SMAP方法在灵敏度的角度来看可能是足够的，但是对材料 (例如引物)的设计可能不容易，实际的操作可能是复杂的。考虑这些情况进行了本发明。本发明涉及提供下述探针以及所述探针的应用，所述探针能够以高灵敏度容易地检测EGFR外显子21多态性的探针。本发明第一方面的一个示例性实施方式是[1]用于检测EGFR外显子21中多态性的引物组，所述引物组包含Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸，并且能够通过使用SEQ ID NO 1 中的区域作为模板进行扩增，所述区域包含SEQ ID NO 1的第172792个碱基，Pl寡核苷酸具有10个碱基到50个碱基的长度，并且具有胞嘧啶作为与SEQ IDNO 1的第172792个碱基互补的碱基，P2寡核苷酸具有10个碱基到50个碱基的长度，并且具有腺嘌呤作为与SEQ ID NO 1的第172792个碱基互补的碱基，和Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸满足下述相关性中的至少一种P1寡核苷酸的解链温度高于P2寡核苷酸的解链温度；或Pl寡核苷酸比P2寡核苷酸长一个或多个碱基。本发明的第一方面的另一个示例性实施方式是[2] [1]的引物组，其中Pl寡核苷酸或P2寡核苷酸中的至少一个在不同于与SEQ ID NO :1的第172792个碱基互补的碱基位置的位置包含至少一个与SEQ ID NO :1的碱基序列不互补的碱基。本发明的第一方面的另一个示例性实施方式是[3] [1]或[2]的引物组，其中Pl 寡核苷酸或P2寡核苷酸中的至少一个在不同于与SEQ ID NO :1的第172792个碱基互补的碱基位置的位置包含额外的序列，所述额外的序列由连续的2到10个与SEQ ID NO 1的碱基序列不互补的碱基形成，并且位于所述寡核苷酸链的5'末端。本发明的第一方面的另一个示例性实施方式是W] [1]到[3]中任一项的引物组，其中Pl寡核苷酸或P2寡核苷酸中的至少一个在不同于与SEQID NO 1的第172792个碱基互补的碱基位置的位置包含错配碱基或包含与SEQ ID NO :1的碱基序列不互补的2到 20个错配碱基的序列，所述位置。本发明的第一方面的另一个示例性实施方式是[5] [1]到[4]中任一项的引物组，其中Pl寡核苷酸或P2寡核苷酸中的至少一个在从其3'末端起的第1位到第3位中的一处包含与SEQ ID NO 1的第172792个碱基互补的碱基。本发明的第一方面的另一个示例性实施方式是W] [1]到[5]中任一项的引物组，其中，Pl寡核苷酸的解链温度比P2寡核苷酸的解链温度高0. 1°C到20°C。本发明的第一方面的另一个示例性实施方式是[7] [1]到W]中任一项的引物组，其还包含与下述序列同源的引物，所述序列处于SEQ ID NO :1碱基序列中较模板核酸序列更靠5'末端侧的区域中，其中所述模板核酸序列与Pl寡核苷酸或P2寡核苷酸互补。本发明的第一方面的另一个示例性实施方式是[8] [1]到[7]中任一项的引物组，其包含SEQ ID NO :2到SEQ ID NO :11的寡核苷酸中的至少一个作为Pl寡核苷酸，和 SEQ ID NO 12到SEQ ID NO 21的寡核苷酸中的至少一个作为P2寡核苷酸。本发明的第二方面的一个示例性实施方式是[9]用于检测EGFR外显子21中多态性的引物，所述引物能够通过使用SEQ ID NO :1中的区域作为模板进行扩增，所述区域包含SEQ ID NO 1的第172792个碱基，并且所述引物是下述寡核苷酸，所述寡核苷酸具有10 个碱基到50个碱基的长度，并且具有胞嘧啶作为与SEQ ID NO 1的第172792个碱基互补的碱基。本发明的第二方面的另一个示例性实施方式是[10] [9]的引物，其在不同于与 SEQ ID NO 1的第172792个碱基互补的碱基位置的位置包含至少一个与SEQ ID NO 1的碱基序列不互补的碱基。本发明的第二方面的另一个示例性实施方式是[11] [9]或[10]的引物，其在不同于与SEQ ID NO 1的第172792个碱基互补的碱基位置的位置包含一个或多个与SEQ ID NO 1的碱基序列不互补的碱基，其中所述一个或多个不互补的碱基选自下组，所述组由额外的序列，其由连续的2到10个碱基形成，并且位于所述引物5'末端；
错配碱基；和2到20个错配碱基的序列组成。本发明的第二方面的另一个示例性实施方式是[12] [9]到[11]的引物，其在从其3'末端起的第1位到第3位中的一处包含与SEQ ID NO 1的第172792个碱基互补的碱基。本发明的第三方面的一个示例性实施方式是[13]检测EGFR基因中多态性的方法，所述方法包括(I)通过使[1]到[8]中任一项的引物组与包含核酸的核酸样品接触并使用所述核酸作为模板，来进行扩增；(II)通过使单链核酸与探针接触，获得由所述单链核酸和探针形成的杂交体，所述单链核酸通过所述扩增获得，所述探针能够检测EGFR外显子21中的多态性；(III)通过改变包含所述杂交体的样品的温度从而解离所述杂交体，测量基于所述杂交体的解离的信号的改变；(IV)基于所述信号变化测定作为解链温度的、所述杂交体解离的温度；和(V)基于所述解链温度检查EGFR外显子21L858R的存在或评价具有EGFR外显子 21L858R的核酸的丰度比。本发明的第三方面的另一个示例性实施方式是[14] [13]的方法，其中所述扩增和所述杂交体的获得同时进行。本发明的第四方面的一个示例性实施方式是[15]评价EGFR酪氨酸激酶抑制剂的方法，所述方法包括用[13]或[14]的方法检测EGFR基因中的多态性；和基于所述检测的结果评价核酸样品来源对EGFR酪氨酸激酶抑制剂的抗性，或 EGFR酪氨酸激酶抑制剂的效果。本发明的第五方面的一个示例性实施方式是[16]可用于在[13]或[14]的方法中的引物，所述引物是SEQ ID NO :2到SEQ ID NO 11中任一的Pl寡核苷酸，或SEQ ID NO: 12到SEQ ID NO 21中任一的P2寡核苷酸。本发明的第六方面的一个示例性实施方式是[17]包含[1]到[8]中任一的引物组的试剂盒。本发明的第六方面的另一个示例性实施方式是[18] [17]的试剂盒，其还包含能够检测EGFR外显子21L858R的探针。
图IA是核酸混合物解链曲线的例子。图IB是核酸混合物的差异解链曲线的例子。图2是标准曲线的例子。图3是通过与本发明的实施例相关的引物组获得的、不具有突变的核酸混合物的解链曲线。图4是通过与本发明的示例性实施方式相关的引物组获得的、具有0. 突变含量的核酸混合物的解链曲线。图5是通过与本发明的示例性实施方式相关的引物组获得的、具有0.3%突变含量的核酸混合物的解链曲线。图6是通过与本发明的示例性实施方式相关的引物组获得的、具有突变含量的核酸混合物的解链曲线。
具体实施例方式引物组本发明一个方面的一个示例性实施方式的引物组检测EGFR外显子21中的多态性。引物组至少具有Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸，并且能够通过使用SEQ ID N0:1中的区域作为模板进行扩增，其中所述区域至少具有SEQ ID NO 1的第172792个碱基。Pl寡核苷酸具有10个碱基到50个碱基的长度，并且具有胞嘧啶(C)作为与SEQ ID NO 1的第172792个碱基互补的碱基。P2寡核苷酸具有10个碱基到50个碱基的长度，并且具有腺嘌呤(A)作为与SEQ ID NO 1的第172792个碱基互补的碱基。Pl寡核苷酸的解链温度(Tm)高于P2寡核苷酸的解链温度，和/或Pl寡核苷酸比 P2寡核苷酸长一个或多个碱基。引物组具有下述Pl寡核苷酸和下述P2寡核苷酸，所述Pl寡核苷酸是突变型引物，其具有C作为与SEQ ID NO 1的第172792个碱基互补的碱基，并且可被用于检测EGFR 外显子21多态性，所述P2寡核苷酸是野生型引物，其具有A作为与SEQ ID NO :1的第 172792个碱基互补的碱基，其中Pl寡核苷酸的解链温度高于P2寡核苷酸，或Pl寡核苷酸比P2寡核苷酸长一个或多个碱基。通过在一个反应体系中使用这两种寡核苷酸作为引物， 可以容易地以高灵敏度检测EGFR外显子21的多态性。“EGFR外显子21L858R”在本文中表示EGFR基因外显子21中的突变，其中密码子 858中的亮氨酸被突变成精氨酸。“EGFR外显子21的多态性”在本文中表示“EGFR外显子21L858R”。"EGFR外显子21的碱基序列”在本文中表示SEQ ID NO 1的序列，其为GenBank 登记号 NC000007(版本:NC000007. 13)，55086724-55275030 的 Gene ID :1956。EGFR外显子21L858R的突变在本文中表示下述突变，其中SEQ IDNO :1的第 172792个碱基从胸腺嘧啶(T)突变成鸟嘌呤(G)。SEQ ID NO=I中所示碱基序列的第172792位被特定地称作“突变位点”。“模板核酸序列”在本文中表示SEQ ID NO=I中所示的碱基序列作为模板的部分， 引物退火到其上，从而进行核酸的扩增。“解链温度(Tm) ”表示双链核酸解离的温度。所述温度通常被定义为下述温度在所述温度下波长260nm处样品的吸光度提高达到相对于通过提高样品温度所能够到达的吸光度总提高而言的50%。即，加热双链核酸(例如DNA溶液)时，260nm处的吸光度提高。 这由于DNA的解链而发生，所述DNA的解链是这样一种现象双链DNA两条链之间的氢键通过加热而松开，随后双链DNA解离成单链DNA。当所有双链DNA解离并变成单链DNA时，其吸光度可以是加热开始时吸光度(仅双链DNA的吸光度)的约1. 5倍，从而可以确定解链的完成。Tm以所述现象为基础来定义。术语“步骤”不仅包括独立的步骤，也包括不能与另一步骤清楚区分的步骤，前提条件是实现了所述步骤的预期效果。使用“从……到……”表示数字范围在本文中表示下述数值范围，所述范围包括作为最小值被标明为范围下限的数值，和作为最大值被标明为范围上限的数值。除非另有说明，涉及组合物中组分含量时，如果组合物包含属于组分范围内的多种物质，则含量表示组合物中多种物质含量的总和。引物组引物组至少具有Pl寡核苷酸(其为突变型引物)和P2寡核苷酸(其为野生型引物)。Pl寡核苷酸能够通过使用SEQ ID NO 1中的区域作为模板进行扩增，其中所述区域包括位于SEQ ID NO 1中第172792位突变位点处的碱基。Pl寡核苷酸具有10个碱基到50个碱基的长度，并且具有胞嘧啶作为与SEQ ID NO :1的第172792个碱基互补的碱基。P2能够通过使用SEQ ID NO=I中的区域作为模板进行扩增，其中所述区域包括位于SEQ ID NO 1中第172792位突变位点处的碱基。P2寡核苷酸具有10个碱基到50个碱基的长度，并且具有腺嘌呤作为与SEQ IDNO 1的第172792个碱基互补的碱基。Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸需要处于下述相关性中的至少一种P1寡核苷酸具有高于P2寡核苷酸的Tm，或Pl寡核苷酸比P2寡核苷酸长一个或多个碱基。满足上述相关性中的至少一种时，Pl寡核苷酸可比P2寡核苷酸对模板核酸序列具有更高的亲和力，并且可具有对模板核酸序列更强的结合特性。因此，通过使用Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸二者作为引物在一个反应中扩增核酸时，使用Pl寡核苷酸的扩增可以是优先的，并且由此能够容易地以高灵敏度检测突变型EGFR外显子21的多态性。可以满足关于Tm的相关性和关于碱基长度的相关性之一或二者。当Pl寡核苷酸具有高于P2寡核苷酸的Tm时，Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸之间的 Tm差异不被特别限制。例如，其可优选地从0. 1°C到20°C，更优选地从0. 1°C到10°C，进一步更优选地从0. 1°C到5°C。在该范围内，可以阻抑假阳性。Tm在本文中表示杂交体的Tm， 所述杂交体由具有基本完全互补性的碱基序列组成。通过GC含量调节Tm时，可通过例如相对递增的GC含量建立相对高的Tm。在实施方式中，可优选将Pl寡核苷酸的GC含量设定为高于P2寡核苷酸的GC含量。或者，通过向寡核苷酸序列中并入例如修饰，来使用LNA作为RNA类似物、使用PNA作为肽核酸、使用 BNA作为交联的核酸等等，可以将寡核苷酸的Tm设定为比不包括此类修饰的另一寡核苷酸相对更高。当Pl寡核苷酸比P2寡核苷酸长一个或多个碱基时，Pl寡核苷酸具有更高的对模板序列的亲合力。因此，与使用P2寡核苷酸的扩增相比，使用Pl寡核苷酸的扩增可优先进行。可优选地如下实现关于Tm的相关性和关于碱基长度的相关性P1寡核苷酸或P2 寡核苷酸中的至少一个，在不同于与SEQ ID NO :1的第172792个碱基互补的碱基位置的位置上，具有至少一个与SEQ ID NO :1的碱基序列不互补的碱基。这可使得这些相关性能够通过序列的构建被调节。
可以通过针对与突变位点不同的位置处的非互补性碱基，选择寡核苷酸中插入或添加的位置、碱基数量、碱基类型等等，来调节寡核苷酸的Tm或碱基长度。基于此种考虑， 碱基可被置于Pl寡核苷酸或P2寡核苷酸中，或置于二者中。添加一个或多个碱基以延长Pl寡核苷酸的长度时，可优选将碱基添加至突变位点的5’末端侧的位点，以及，可更优选地将碱基添加至与Pl寡核苷酸的模板核酸序列互补的区域的5’末端侧的位点，从而可例如阻抑假阳性。使得Pl寡核苷酸比P2寡核苷酸更长时，寡核苷酸之间的差异不受具特别限制。 在实施方式中，差异可以是1个碱基到20个碱基，优选地1个碱基到10个碱基，更优选地 1个碱基到5个碱基。被添加以延长Pl寡核苷酸长度的碱基可以与SEQ ID NO=I中所示碱基序列互补或不互补。当碱基与SEQ ID NO :1中所示碱基序列不互补时，碱基可与下文阐述的额外的序列连续或不连续。当每条寡核苷酸“能够通过使用SEQ ID NO :1中的区域作为模板进行扩增，其中所述区域包含SEQ ID NO 1的第172792个碱基”时，这意味着使用寡核苷酸作为扩增反应例如PCR(聚合酶链式反应)的引物时，寡核苷酸退火至包括突变位点的预定区域上，并且能够扩增与具有突变位点的序列互补的序列。因此，每条寡核苷酸可以是与SEQ ID NO 1 中所示碱基序列完全互补的序列，与SEQ ID NO :1中所示碱基序列部分互补的序列，或具有部分不互补的碱基(错配碱基)的序列，只要其能够退火至SEQ ID NO 1中所示碱基序列中包括突变位点的预定区域即可。错配碱基表示不形成G-C或A-T的正确配对的核酸碱基， 并且特定地表示产生G-G、G-A、G-T、A-A、A_C、C_T、C-C或T-T的错配碱基对的核酸碱基。例如，如下文所述，可优选每条寡核苷酸是部分互补的序列，或是具有部分错配的碱基的序列，只要关于Tm的相关性或关于碱基长度的相关性不被破坏即可。使用此类序列时，例如，检测突变的灵敏度可被提高，并且假阳性可被降低。每条寡核苷酸的长度可以在从10个碱基到50个碱基的范围内，并且可优选地在从15个碱基到40个碱基的范围内，并可更优选地在从18个碱基到25个碱基的范围内，只要上文所述关于Tm的相关性或关于碱基长度的相关性不被损坏即可。在所述范围内的长度例如可提高检测灵敏度，并且高效地阻抑假阳性。碱基长度可与Pl寡核苷酸的其他结构特征一起被调节。不互补的碱基(不是与突变位点互补的碱基)可以是下述额外的序列，所述序列由连续的2到10个碱基形成，并且位于寡核苷酸链的5’末端。此类额外的序列例如可提高检测灵敏度，或可阻抑假阳性。可被分别添加至Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸的额外的序列可以是与SEQ ID NO=I 中所示碱基序列不互补的3个碱基到10个碱基，优选地4个碱基到9个碱基，更优选地5 个碱基到7个碱基。对5’末端添加额外的序列时，例如可提高灵敏度，并且可高效地阻抑每条引物退火至每条其他模板核酸序列，或可提高扩增效率。另外，当额外的序列的长度在所述范围内时，例如假阳性可被阻抑，或扩增效率可被提高。在Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸中，额外的序列可以具有相同或不同的长度，并且可具有相同或不同的碱基序列。在一些实施方式中，额外的序列具有不同的碱基序列可以是优选的。额外序列的碱基序列的GC含量可优选地从约40%到60%，但其不特别限于此。GC含量处于该范围内时，例如可维持突变型序列或野生型序列的扩增效率。另外，对Pi寡核苷酸和P2寡核苷酸二者添加额外的序列时，Pl寡核苷酸的额外序列的GC含量可优选地更高。在这种情况下，突变型序列检测的灵敏度可被提高。Pl寡核苷酸可在其3’区中具有碱基(胞嘧啶)作为与EGFR外显子21L858R的突变位点互补的碱基。在Pl寡核苷酸中，可优选地，3’末端中第1个到第3个碱基中的任一是与突变位点处碱基互补的碱基。当与突变位点处碱基互补的碱基被置于此类位置中时， 例如检测灵敏度可被提高，或假阳性可被阻抑。注意，“3’末端的第1个碱基”在本文中表示3’末端的碱基，“3’末端的第3个碱基”表示当3’末端被定义为第1个碱基时从3’到5’方向计数的第三个碱基。在另一方面，P2寡核苷酸可在其3’区具有碱基(腺嘌呤)作为与EGFR外显子 21L858R的突变位点互补的碱基。在Pl寡核苷酸中，可优选地，3’末端中第1个到第3个碱基中的任一是与突变位点处碱基互补的碱基。当与突变位点处碱基互补的碱基被置于此类位置中时，例如，检测灵敏度可被提高，或假阳性可被阻抑。Pl寡核苷酸中与突变位点互补的碱基与3’末端的距离(碱基位置)可与P2寡核苷酸中的相同或不同。在一些实施方式中，Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸中与突变位点互补的碱基到3’末端的距离可优选地是相同的。当Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸中的距离相同时，例如，检测灵敏度可被提高或假阳性可被阻抑。在一些实施方式中，一个碱基或连续的2-20个碱基可以是错配碱基，其为位于不是寡核苷酸链中突变位点之处的不互补的碱基。引入此类错配碱基时，例如，检测灵敏度可被提高或假阳性可被阻抑。尽管此类错配碱基的总数可根据组成每条寡核苷酸的碱基序列而变化，但是总数可优选地为10个或更少、更优选地为5个或更少、进一步更优选地为3个或更少。当错配碱基的数量在此类范围内时，这可以是有利的，例如，检测灵敏度可被提高或假阳性可被阻抑。此类错配碱基可优选地被置于突变位点5’末端侧的位置中。特别地，位于突变位点5’末端侧第3个到第7个碱基中的至少1个碱基可优选地被制成错配碱基，位于突变位点5’末端侧第3个到第5个碱基中的至少1个碱基可更优选地被制成错配碱基。使用此类位置时，例如，检测灵敏度可被提高或假阳性可被阻抑。当Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸二者均具有错配碱基时，可优选地，Pl寡核苷酸中错配碱基的位置与P2寡核苷酸中错配碱基的位置不彼此对应。错配碱基的位置可以是不同的。其可优选地偏离1-6个碱基，更优选地偏离2-3个碱基。另外，例如当Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸均具有错配碱基时，可优选地与P2寡核苷酸中错配碱基的位置相比，Pl寡核苷酸中错配碱基的位置处于更远的3’末端侧。当Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸中错配碱基的位置这样相关时，例如，假阳性可被阻抑。与SEQ ID NO=I中所示碱基序列不互补的任何碱基可被用作错配碱基。在实施方式中，腺嘌呤㈧或胸腺嘧啶⑴可由于它们相对弱的结合活性而是优选的。使用“A”或 “T”时，例如，假阳性可被阻抑。注意在EGFR外显子21的突变位点周围存在多态性，这与本文要检测的多态性不相关。需要时可向Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸二者中不是检测靶标的碱基添加突变，从而使得由此类无关多态性导致的影响无效。此类碱基在本文中被称作“无效突变”。可在Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸二者或之一中添加额外的序列。另外，可在Pl寡
核苷酸或P2寡核苷酸二者或之一中添加错配碱基。用于多态性检测的引物组包括至少一个Pl寡核苷酸和至少一个P2寡核苷酸。在
实施方式中，引物组中可包括两个或更多的Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸二者或之一，只要上
文所述关于Tm的相关性或关于碱基长度的相关性通常不被破坏即可。Pl寡核苷酸的例子在表1中展示，P2寡核苷酸的例子在表2中展示。注意表1
和2中的下划线的“A”或“T”表示错配碱基，5’末端侧的大写字母表示额外的序列。表1
和表2中各寡核苷酸3’末端的碱基是与突变位点处的碱基互补的碱基。另外，表1和表2
中的“(a)，，表示无效突变。注意Tm用MELTCALC 计算。表 权利要求
1.用于检测EGFR外显子21中多态性的引物组，所述引物组包含Pl寡核苷酸和P2寡核苷酸，并且所述引物组能够通过使用SEQ ID NO :1中的区域作为模板进行扩增，所述区域包含SEQ ID NO 1的第172792个碱基，所述Pl寡核苷酸具有10个碱基到50个碱基的长度，并且具有胞嘧啶作为与SEQ ID NO 1的第172792个碱基互补的碱基，所述P2寡核苷酸具有10个碱基到50个碱基的长度，并且具有腺嘌呤作为与SEQ ID NO 1的第172792个碱基互补的碱基，和所述Pl寡核苷酸和所述P2寡核苷酸满足下述相关性中的至少一种所述Pl寡核苷酸的解链温度高于P2寡核苷酸的解链温度；或所述Pl寡核苷酸比P2寡核苷酸长一个或多个碱基。
2.权利要求1所述的引物组，其中所述Pl寡核苷酸或P2寡核苷酸中的至少一个在不同于与SEQ ID NO :1的第172792个碱基互补的碱基位置的位置包含至少一个与SEQ ID NO 1的碱基序列不互补的碱基。
3.权利要求1所述的引物组，其中所述Pl寡核苷酸或P2寡核苷酸中的至少一个在不同于与SEQ ID NO :1的第172792个碱基互补的碱基位置的位置包含额外的序列，所述额外的序列由连续的2到10个不与SEQ IDNO 1的碱基序列互补的碱基形成，并且位于寡核苷酸链的5'末端。
4.权利要求1所述的引物组，其中所述Pl寡核苷酸或P2寡核苷酸中的至少一个在同于与SEQ ID NO 1的第172792个碱基互补的碱基位置的位置包含错配碱基或包含与SEQ ID NO 1的碱基序列不互补的2到20个错配碱基的序列。
5.权利要求1所述的引物组，其中所述Pl寡核苷酸或P2寡核苷酸中的至少一个在从其3'末端起的第1位到第3位中的一处包含与SEQ ID NO 1的第172792个碱基互补的碱基。
6.权利要求1所述的引物组，其中所述Pl寡核苷酸的解链温度比所述P2寡核苷酸的解链温度高0. 1°C到20°C。
7.权利要求1所述的引物组，所述引物组还包含与下述序列同源的引物，所述序列处于位于SEQ ID NO :1碱基序列中的模板核酸序列的5'末端侧的区域中，其中所述模板核酸序列与所述Pl寡核苷酸或P2寡核苷酸互补。
8.权利要求1所述的引物组，所述引物组包含SEQID NO 2到SEQID NO 11的寡核苷酸中的至少一个作为Pl寡核苷酸，和SEQ ID N0:12到SEQ ID NO :21的寡核苷酸中的至少一个作为P2寡核苷酸。
9.用于检测EGFR外显子21中多态性的引物，所述引物能够通过使用SEQID NO :1中的区域作为模板进行扩增，所述区域包含SEQ ID NO :1的第172792个碱基，并且，所述引物是下述寡核苷酸，所述寡核苷酸具有10个碱基到50个碱基的长度，并且具有胞嘧啶作为与 SEQ ID NO 1的第172792个碱基互补的碱基。
10.权利要求9所述的引物，所述引物在不同于与SEQID NO :1的第172792个碱基互补的碱基位置的位置包含至少一个与SEQ ID NO :1的碱基序列不互补的碱基。
11.权利要求9所述的引物，所述引物在不同于与SEQID NO :1的第172792个碱基互补的碱基位置的位置包含一个或多个与SEQ ID NO :1的碱基序列不互补的碱基，所述一个或多个不互补的碱基选自由下组，所述组由额外的序列，所述序列由连续的2到10个碱基形成，且位于所述引物5'末端； 错配碱基；和2到20个错配碱基的序列组成。
12.权利要求9所述的引物，所述引物在从其3'末端起的第1位到第3位中的一处包含与SEQ ID NO 1的第172792个碱基互补的碱基。
13.检测EGFR基因中多态性的方法，所述方法包括(I)通过使权利要求1到8中任一项所述的引物组与包含核酸的核酸样品接触并且使用所述核酸作为模板来进行扩增；(II)获得单链核酸和探针形成的杂交体，这通过使所述单链核酸与所述探针接触来实现，所述单链核酸通过所述扩增获得，所述探针能够检测EGFR外显子21中的多态性；(III)通过改变包含所述杂交体的样品的温度从而解离所述杂交体，测量基于所述杂交体解离的信号的改变；(IV)基于所述信号变化测定作为解链温度的、所述杂交体解离的温度；和(V)基于所述解链温度检查EGFR外显子21L858R的存在或评价具有EGFR外显子 21L858R的核酸的丰度比。
14.权利要求13所述的方法，其中所述扩增和所述杂交体的获得同时进行。
15.评价EGFR酪氨酸激酶抑制剂的方法，所述方法包括 用权利要求13所述的方法来检测EGFR基因中的多态性；和基于所述检测的结果评价核酸样品来源对EGFR酪氨酸激酶抑制剂的抗性，或EGFR酪氨酸激酶抑制剂的效果。
16.可用于权利要求13所述的方法中的引物，所述引物是SEQID NO :2到SEQ ID NO 11中任一条的Pl寡核苷酸，或SEQ ID NO 12到SEQ IDNO 21中任一条的P2寡核苷酸。
17.包含权利要求1到8中任一项所述的引物组的试剂盒。
18.权利要求17所述的试剂盒，其还包含能够检测EGFR外显子21L858R的探针。
全文摘要
本发明提供了用于检测EGFR外显子21多态性的引物组及其应用。本发明提供了用于检测EGFR外显子21L858R中多态性的引物组。所述引物组具有P1寡核苷酸和P2寡核苷酸，并且可通过使用包括SEQ ID NO1的第172792个碱基的区域进行扩增。作为与SEQ ID NO1的第172792个碱基互补的碱基，P1寡核苷酸具有胞嘧啶，P2寡核苷酸具有腺嘌呤。P1寡核苷酸的解链温度高于P2寡核苷酸的解链温度，和/或P1寡核苷酸比P2寡核苷酸长一个或多个碱基。本发明还提供了多态性检测引物，使用所述引物组的多态性检测方法，使用所述引物组评价EGFR酪氨酸激酶抑制剂的方法，多态性检测方法中使用的引物和包括所述引物组的试剂盒。
文档编号C12N15/11GK102453764SQ20111034176
公开日2012年5月16日 申请日期2011年10月28日 优先权日2010年10月29日
发明者井口亚希 申请人:爱科来株式会社