专利名称：一种快速提取悬钩子属植物总rna的方法
技术领域：
本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种快速提取悬钩子属植物总RNA的方法
背景技术：
获得高质量总RNA是进行分子生物学研究如基因表达水平研究、基因操作如RNA 干扰、转基因等下游研究的前提条件。悬钩子属植物的树莓、黑刺莓中富含有花青素苷、原花青素等多酚类次生代谢产物，这些物质给总RNA提取带来了重重困难酚类化合物极易被氧化成褐色物质，然后与RNA不可逆地结合，导致RNA活性丧失，或形成不溶复合物导致在用氯仿抽提时RNA的大量丢失。商业试剂盒，比如Trizol试剂盒在应对该类植物总RNA提取时显得无能为力，而传统的总RNA提取方法如CTAB、SDS等需要较多的植物材料，且需要使用多步抽提来去除多糖、蛋白和基因组DNA。目前使用最多的方法是在植物细胞破碎后，使用LiCl进行RNA的选择性沉淀，达到去除基因组DNA或多糖的目的。但该方法最大的缺点是耗时太长，一般都选择沉淀过夜。若改成醇沉淀，DNA污染特别严重，需要进一步使用DNase处理，然后经过酚-氯仿抽提以灭活DNase，结果造成RNA的大量损失。另外，LiCl沉淀后的洗脱过程要求严格，因为残留的Li+，Cl_会对后续的逆转录及PCR扩增产生负面的影响。所以我们迫切需要一种更方便快捷，而且能有效去除多糖、多酚以及基因组DNA 等物质的RNA提取方法。
发明内容
本发明创造了一种适用于悬钩子属植物的简单、快速的总RNA提取方法。该方法的特征在于按以下步骤执行1)取离心管，向离心管中加入700 ΙΟΟΟμ 1去糖缓冲液，并加入5 15μ 1 β -巯基乙醇，于_20°C预冷5 IOmin ；2)取新鲜植物材料或经液氮速冻后-80°C保存的植物材料0. 1 0. 15g，加入 0. Ig交联聚乙烯基吡咯烷酮，在液氮冷冻条件下研磨成粉状，迅速转移至步骤1)的离心管中，温柔上下颠倒混勻后于冰上静置IOmin ；3)在 4°C下按照 3200 Xg 离心 5 IOmin ；4)彻底去除步骤3)离心所得上清液，向沉淀中加入700 1000 μ 1 65°C预热的细胞裂解液，涡旋lmin，于55 65°C保温20 30min ；5)待步骤4)中的混合液冷却至室温后，按顺序加入细胞裂解液等体积的水饱和酚，1/80-1/50裂解液体积的pH调节剂，1/5裂解缓冲液体积的氯仿，剧烈震荡aiiin ；6)在 4°C下按照 16000 Xg 离心 5 IOmin ；7)将步骤6)离心所得上清液转入另一离心管，向管中加入适量核酸沉淀剂， 于-20°C静置30min以上，在4°C下按照16000 Xg离心IOmin后弃上清液，保留沉淀；
8)将步骤7)离心所得沉淀用体积分数为70 75%乙醇洗涤后室温风干，用DEPC 处理水溶解后-80°C保存；其中，步骤1)、2)、3)、4)可以替代为步骤9)取离心管，向离心管中加入700 ΙΟΟΟμ 1裂解缓冲液，并加入5 15μ 1 β -巯基乙醇，于55 65°C预热5 IOmin ；10)取新鲜植物材料或液氮速冻后_80°C保存的植物材料0. 1 0. 15g，加入0. Ig 交联聚乙烯基吡咯烷酮，在液氮冷冻条件下研磨成粉状，迅速转移至步骤9)的离心管中， 涡旋Imin，于55 65°C保温20 30min ；按上述方案，所述去糖缓冲液为0. 05M氯化钠、50mM pH 8. 0的乙二胺四乙酸二钠、200mM pH 8. 0的三羟甲基氨基甲烷。细胞裂解液为30g/L十六烷基三甲基溴化铵、 1. 4M氯化钠、50 IOOmM pH 8. 0的乙二胺四乙酸二钠、100 200mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷以及20g/L聚乙烯吡咯烷酮K30。pH调节剂包括但不限于弱酸如冰醋酸、草酸。所述核酸沉淀剂包括但不限于无水乙醇、异丙醇，使用的无水乙醇体积为上清体积的2 2. 5 倍，使用异丙醇体积为上清体积的0. 8 1倍。按上述方案，所述方法适用于悬钩子属下的树莓、黑莓以及其他种或变种。所述植物材料包括叶片、花、花蕾以及果实。本发明有益之处与已有CTAB法相比，本发明可以快速提取悬钩子属植物各器官组织总RNA，用时短，在3小时之内可以轻松完成，而已有方法需要12小时以上。为达到去除蛋白质、多糖以及基因组DNA的目的，传统方法需经过2 3轮抽提及2轮以上沉淀，操作步骤繁琐，本方法只进行1轮抽提及1轮沉淀，简化了操作流程。本方法在去蛋白之前增加一步可选的去糖步骤，可以根据RNA提取材料中糖分含量高低进行选择，增加了方法的适用性，能适用于悬钩子属植物树莓、黑莓等植物。
图1是采用本方法提取的黑莓果实总RNA凝胶电泳图；图1中L是标准分子量参考，1 4分别是采用本方法提取的黑莓果实总RNA的4 次重复，4000,2200和1000分别指向标准分子量参考中的4000、2200和1000个核苷酸的条
带位置；图2是采用本方法提取的黑莓果实总RNA反转录后，黑莓查尔酮合成酶基因CHS 和肌动蛋白β-actin基因的PCR扩增凝胶电泳图；图2中M2和Ml是标准分子量参考，1和2分别是采用本方法提取的黑莓果实总 RNA经反转录后，黑莓查尔酮合成酶基因CHS的PCR扩增凝胶电泳位置；3是采用本方法提取的黑莓果实总RNA经反转录后，黑莓肌动蛋白β -actin基因的PCR扩增凝胶电泳位置； 100，300，500，700,900和1200分别指向标准分子量参考M2中的100，300，500，700,900和 1200个核苷酸的条带位置；100，200，300,400, 500和600分别指向标准分子量参考Ml中的 100，200，300，400，500和600个核苷酸的条带位置。
具体实施例方式1、本发明按以下步骤进行实施
1)取离心管，向离心管中加入700 ΙΟΟΟμ 1去糖缓冲液，并加入5 15μ 1 β -巯基乙醇，于_20°C预冷5 IOmin ；2)取新鲜植物材料或液氮速冻后_80°C保存的植物材料0. 1 0. 15g，加入0. Ig 交联聚乙烯基吡咯烷酮，在液氮冷冻条件下研磨成粉状，迅速转移至步骤1)的离心管中， 温柔上下颠倒混勻后于冰上静置IOmin ；3)在 4°C下按照 3200 Xg 离心 5 IOmin ；4)彻底去除步骤3)离心所得上清液，向沉淀中加入700 1000 μ 1 65°C预热的细胞裂解液，涡旋lmin，于55 65°C保温20 30min ；5)待步骤4)中的混合液冷却至室温后，按顺序加入细胞裂解液等体积的水饱和酚，1/80-1/50裂解液体积的pH调节剂，1/5裂解缓冲液体积的氯仿，剧烈震荡2min ；6)在 4°C下按照 16000 Xg 离心 5 IOmin ；7)将步骤6)离心所得上清液转入另一离心管，向管中加入上适量核酸沉淀剂， 于-20°C静置30min以上，在4°C下按照16000 Xg离心IOmin后弃上清液，保留沉淀；8)将步骤7)离心所得沉淀用体积分数为70 75%乙醇洗涤后室温风干，用DEPC 处理水溶解后-80°C保存；其中，步骤1)、2)、3)、4)可以替代为步骤9)取离心管，向离心管中加入700 ΙΟΟΟμ 1细胞裂解液，并加入5 15μ 1 β -巯基乙醇，于55 65°C预热5 IOmin ；10)取新鲜植物材料或液氮速冻后_80°C保存的植物材料0. 1 0. 15g，加入0. Ig 交联聚乙烯基吡咯烷酮，在液氮冷冻条件下研磨成粉状，迅速转移至步骤9)的离心管中， 涡旋Imin，于55 65°C保温20 30min ；按上述方案，所述去糖缓冲液为0. 05M氯化钠、50mM pH 8. 0的乙二胺四乙酸二钠、200mM pH 8. 0的三羟甲基氨基甲烷。细胞裂解液为30g/L十六烷基三甲基溴化铵、 1. 4M氯化钠、50 IOOmM pH 8. 0的乙二胺四乙酸二钠、100 200mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷以及20g/L聚乙烯吡咯烷酮K30。pH调节剂包括但不限于弱酸如冰醋酸、草酸。所述核酸沉淀剂包括但不限于无水乙醇、异丙醇，使用的无水乙醇体积为上清体积的2 2. 5 倍，使用异丙醇体积为上清体积的0. 8 1倍。2、实施例 1 1)取2ml离心管，向离心管中加入1000 μ 1去糖缓冲液，并加入5 μ 1 β -巯基乙醇，于-20°C预冷IOmin ;2)取液氮速冻后_80°C保存的黑莓果实0. 1 0. 15g，加入0. Ig交联聚乙烯基吡咯烷酮，在液氮冷冻条件下研磨成粉状，迅速转移至步骤1)的离心管中，温柔上下颠倒混勻后于冰上静置IOmin ；3)在4°C下按照3200Xg离心IOmin ；4)彻底去除步骤3)离心所得上清液，向沉淀中加入700 μ 1 65°C预热的细胞裂解液，涡旋lmin，于60°C保温30min ；5)待步骤4)中的混合液冷却至室温后，按顺序加入水饱和酚700 μ 1，13 μ 1冰醋酸，140 μ 1氯仿，剧烈震荡2min ；6)在4°C下按照16000 Xg离心IOmin ；7)将步骤6)离心所得上清液500 μ 1转入另一离心管，向管中加入500μ 1-20°C预冷的异丙醇，上下颠倒混勻后于-20°C静置30min，在4°C下按照16000Xg离心IOmin后弃上清液，保留沉淀；8)将步骤7)离心 所得沉淀用体积分数为75%乙醇洗涤后室温风干，用DEPC处理水30 μ 1溶解后-80°C保存；
按上述方案，所述去糖缓冲液为0. 05M氯化钠、50mM pH 8. 0的乙二胺四乙酸二钠、200mM pH 8. 0的三羟甲基氨基甲烷。细胞裂解液为30g/L十六烷基三甲基溴化铵、 1. 4M氯化钠、50 IOOmM pH 8. 0的乙二胺四乙酸二钠、100 200mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷以及20g/L聚乙烯吡咯烷酮K30。3、实施例 2:1)取2ml离心管，向离心管中加入700μ1裂解缓冲液，并加入5μ1 β-巯基乙醇，于60°C预热IOmin ；2)取新鲜树莓叶片0. 1 0. 15g，加入0. Ig交联聚乙烯基吡咯烷酮，在液氮冷冻条件下研磨成粉状，迅速转移至步骤1)的离心管中，涡旋lmin，于60°C保温30min ；3)待步骤2)中的混合液冷却至室温后，按顺序加入水饱和酚700 μ 1，12 μ 1冰醋酸，140 μ 1氯仿，剧烈震荡2min ；4)在4°C下按照16000 Xg离心IOmin ；5)将步骤4)离心所得上清液500 μ 1转入另一离心管，向管中加入1250μ 1-20°C预冷的无水乙醇，上下颠倒混勻后于-20°C静置30min，在4°C下按照16000Xg离心IOmin后弃上清液，保留沉淀；6) 将步骤5)离心所得沉淀用体积分数为75%乙醇洗涤后室温风干，用DEPC处理水50μ 1溶解后-80°C保存；按上述方案，所述裂解缓冲液为30g/L十六烷基三甲基溴化铵、1.4M氯化钠、 50 IOOmM pH 8. 0的乙二胺四乙酸二钠、100 200mM pH 8. 0的三羟甲基氨基甲烷以及 20g/L聚乙烯吡咯烷酮K30。4、实施效果图1显示的是采用本方法提取的黑莓果实总RNA完整的RNA条带，条带清晰，明亮，无降解，完整性好，且基因组DNA条带不明显，说明RNA纯度高。图2是采用本方法提取的黑莓果实总RNA反转录的cDNA为模板，PCR扩增的黑莓查尔酮合成酶基因CHS和肌动蛋白β -actin基因，条带清晰明亮，说明该RNA完全能适用于其后的克隆、表达等实验要求。表1为本方法提取的黑莓叶片、花以及果实总RNA的得率及纯度，可见所提取的总 RNA无蛋白、多糖污染，质量符合后续使用要求。表1黑莓叶片、花以及果实总RNA的得率及纯度
权利要求
1.一种快速提取悬钩子属植物总RNA的方法，其特征在于以下操作(1)取2ml离心管，向离心管中加入700 1000μ 1去糖缓冲液，并加入5 15 μ 1 β -巯基乙醇，于_20°C预冷5 IOmin ；(2)取新鲜植物材料或经液氮速冻后-80°C保存的植物材料0.1 0. 15g，加入0. Ig交联聚乙烯基吡咯烷酮，在液氮冷冻条件下研磨成粉状，迅速转移至步骤(1)的离心管中，温柔上下颠倒混勻后于冰上静置IOmin ；(3)在4°C下按照3200Xg离心5 IOmin ；(4)彻底去除步骤(3)离心所得上清液，向沉淀中加入700 1000μ 1 65°C预热的细胞裂解液，涡旋lmin，于55 65°C保温20 30min ；(5)待步骤(4)中的混合液冷却至室温后，按顺序加入细胞裂解液等体积的水饱和酚， 1/80-1/50裂解液体积的pH调节剂，1/5裂解缓冲液体积的氯仿，剧烈震荡2min ；(6)在4°C下按照16000Xg离心5 IOmin ；(7)将步骤(6)离心所得上清液转入另一离心管，向管中加入上适量核酸沉淀剂， 于-20°C静置30min以上，在4°C下按照16000 Xg离心IOmin后弃上清液，保留沉淀；(8)将步骤(7)离心所得沉淀用体积分数为70 75%乙醇洗涤后室温风干，用DEPC 处理水溶解后-80°C保存；
2.根据权利要求1所述步骤⑴、(2)、(3)、⑷可以替代为(1)取2ml离心管，向离心管中加入700 1000μ 1细胞裂解液，并加入5 15 μ 1 β -巯基乙醇，于55 65°C预热5 IOmin ；(2)取新鲜植物材料或液氮速冻后-80°C保存的植物材料0.1 0. 15g，加入0. Ig交联聚乙烯基吡咯烷酮，在液氮冷冻条件下研磨成粉状，迅速转移至步骤(1)的离心管中，涡旋 lmin,于 55 65°C保温 20 30min ；
3.根据权利要求1所述总RNA提取方法，其特征在于所述去糖缓冲液为0.05M氯化钠、50mM pH 8. 0的乙二胺四乙酸二钠、200mM pH 8. 0的三羟甲基氨基甲烷；
4.根据权利要求1或2所述总RNA提取方法，其主要特征在于使用碱性细胞裂解液裂解细胞，所述细胞裂解液为30g/L十六烷基三甲基溴化铵、1.4M氯化钠、50 IOOmM pH 8.0的乙二胺四乙酸二钠、100 200mM pH 8. 0的三羟甲基氨基甲烷以及20g/L聚乙烯吡咯烷酮K30 ；
5.根据权利要求1或2所述总RNA提取方法，其特征在于在细胞彻底裂解后，再使用 PH调节剂调节混合液pH，使用的pH调节剂包括但不限于弱酸如冰醋酸、草酸；
6.根据权利要求1或2所述总RNA提取方法，其特征在于使用的核酸沉淀剂包括但不限于无水乙醇、异丙醇；
7.根据权利要求1或2所述总RNA提取方法，核酸沉淀时，使用的无水乙醇体积为上清体积的2 2. 5倍；使用异丙醇体积为上清体积的0. 8 1倍；
8.根据权利要求1或2所述总RNA提取方法，其适用于悬钩子属下的树莓、黑莓以及其他种或变种；
9.根据权利要求1或2所述总RNA提取方法中植物材料包括但不限于果实、叶片及花。
全文摘要
本发明公开了一种快速提取悬钩子属植物总RNA的方法；其特征在于取少量悬钩子属植物材料，液氮冷冻下研磨成粉，经过可选的去糖、离心步骤，或直接加入碱性细胞裂解液，进行温浴裂解；完成后通过酚-弱酸-氯仿抽提，离心去除蛋白以及绝大部分基因组DNA；上清液中加入醇进行沉淀；离心收集RNA沉淀，经过乙醇洗涤、风干后用DEPC灭菌水溶解，-80℃保存。本发明避免了使用LiCl沉淀，一步抽提去除蛋白、基因组DNA，用醇沉淀RNA，操作简单，整个过程在3小时内完成；本方法提取悬钩子属植物总RNA只需要0.1-0.2g材料，增加可选去糖步骤，适用于悬钩子属植物树莓、黑莓等多种植物材料。
文档编号C12N15/10GK102329792SQ20111034121
公开日2012年1月25日 申请日期2011年11月1日 优先权日2011年11月1日
发明者余昊唯, 刘泽静, 汤浩茹, 王小蓉, 贾慧峰, 陈清 申请人:四川农业大学