专利名称：一种同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法
技术领域：
本发明涉及一种环介导间接PCR检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法，属于生物医药体外分子诊断技术。
背景技术：
我国是养猪大国，养殖规模化、集约化程度不断提高，以病毒性传染病为首的猪病是目前影响养猪效益的主要因素之一，给养猪业造成了极大危害，尤以高致病性PRRSV引起的猪高热病为主。在引起猪高热症状的众多病毒因子中PRRSV扮演重要角色，是主要病原，其次为PCV2，再次为CSFV等。近年来，PRRSV在我国猪群中感染已极为普遍，并常因感染猪的免疫抑制，导致其它病原体的混合感染；PCV2感染无明显的临床症状，但可破坏免疫系统，造成免疫抑制，易继发并发其它病原体感染，尤其是和PRRSV的混合感染，使患病猪的致死率显著上升；由于PRRSV或PCV2感染猪的免疫抑制，促使了猪瘟的进一步流行，猪瘟的发病率和死亡率都有所回升。随着PRRSV、PCV2和CSFV等病毒因子在大范围内长期流行，病毒变异，毒力增强，一种和两种以上病原的混合感染，导致猪高热疾病仍将呈高发态势，如何防控仍将是未来很长时间内我国养猪业必须面临的实际问题。这3种病毒是引起猪“高热病”的主要病原，目前针对这3种病毒的实验室检测多采用剖检观察病理组织变化，再综合临床症状进行初步判断，对于多病毒混合感染的猪“高热病”，则很难通过剖检鉴别不同病原，而血清学检测如中和试验、ELISA和胶体金试纸等检测技术，普遍存在灵敏度和特异性低，不利于流行病监测和疾病管理。PCR技术是一种高度特异性和敏感性的分子诊断技术，广泛应用于上述3种病原的检测。常规PCR是利用1对特异性引物检测1种病原，对于多病原的混合感染需要多次PCR检测，检测时间长、成本高；在常规PCR基础上发展起来的多重PCR是在1支PCR管中利用多对特异性引物进行PCR扩增，可同时检测多种病原感染，在临床上对混合感染的鉴别诊断具有独特的应用价值。然而，多重PCR除具有易污染，假阳性和假阴性较高等常规PCR的缺点外，由于多重PCR扩增一般涉及2对或2对以上的引物，引物之间的交叉反应常常导致多重PCR检测灵敏度和特异性出现不同程度的下降，限制了多重PCR的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，以实现对3种病毒的环介导间接PCR检测。为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，利用PRRSV、PCV2和CSFV3种病毒核酸设计3对特异性探针，利用PCR制备探针标记的报告基因，然后再通过报告基因的环化和反向PCR扩增，实现对3种病毒的环介导间接PCR检测。具体包括以下步骤
(1)探针和引物的设计根据GenBank数据库中猪圆环病毒2型(PCM)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的高度保守性核苷酸序列设计3对特异性探针；选择大豆Lectin基因作为报告基因，并以此基因片段的核苷酸序列为模板设计1对正向PCR扩增引物和1对反向PCR扩增引物；将3对特异性探针分别置于正向PCR扩增引物的上下游引物的末端，即构成3对针对不同病毒的标记用引物，将标记用引物和反向PCR扩增引物进行合成，用于环介导间接PCR扩增；(2)病毒核酸的制备；(3)报告基因的制备；用3对标记用引物分别扩增大豆Lectin基因，经PCR产物回收后获得3种标记的报告基因，每条报告基因两端带有2条探针，此3种报告基因分别针对不同病毒；(4)单病毒环介导间接PCR检测；将不同的报告基因与待检核酸混合，报告基因携带的探针与目的基因进行杂交，形成杂合分子，之后在嗜热DNA聚合酶和嗜热DNA连接酶作用下，经缺口补平及连接，实现报告基因的环化，再采用反向PCR扩增报告基因，间接检测3种病毒；(5)多病毒环介导间接PCR检测；将3种报告基因与待检核酸混合，经探针杂交、缺口补平及连接，实现报告基因的环化，再采用反向PCR扩增报告基因，间接检测3种病毒。所述步骤(1)中用于检测PCV病毒的标记引物序列为上游引物P1 GAAACCAGCTGTGGCTGA TCAAGAAGCCTCATCAC下游引物P2 CCTTCGGATATA CTGTCATTTCACCAGGGTTTAGTT其中斜体部分为探针序列；所述步骤(1)用于检测PRRSV病毒的标记引物序列为上游引物P3 AAACCAGTCCAGAGGCAA TCAAGAAGCCTCATCACA
下游引物 P4 AAAGCCTCGTGTTGGGT TTTCACCAGGGTTTAGTT其中斜体部分为探针序列；所述步骤(1)用于检测PRRSV病毒的标记引物序列为上游引物P5 GATGACTTCAGGTCCGGGCTGTG CAAGAAGCCTCATCACA下游引物P6 TCGTCAACCGATGAGATAGGG TTTCACCAGGGTTTAGTT其中斜体部分为探针序列；所述步骤⑴进行反向PCR扩增的引物序列为上游引物P7ACGTGCTAGTGATGGCTAAG下游引物P8TGTTGAGTCCTCTAGGTTGT。所述步骤(1)检测3种病毒的标记引物序列在合成时，引物的5’末端均进行磷酸化修饰。所述步骤(1)检测3种病毒的报告基因为大豆Lectin基因。所述步骤(2)用氯仿+蛋白酶K法制备核酸DNA，采用Trizol试剂法制备核酸RNA。所述步骤(3)备的针对PCV病毒的报告基因序列包含列表中的SEQIDN0. 1。
所述步骤(3)备的针对PRRSV病毒的报告基因序列包含列表中的SEQIDN0. 2。所述步骤(3)中制备的针对CSFV病毒的报告基因序列包含列表中的SEQIDN0. 3。所述步骤(4)、(5)中环介导间接PCR检测主要包括2步反应第一步反应报告基因的环化，通过探针与目的基因的杂交形成杂合分子，再经缺口补平及连接实现报告基因的环化，将目的基因的检测置换为对报告基因的检测；第二步反应反向PCR扩增，以环化的报告基因为模板，利用反向引物扩增报告基因，实现对目的基因的间接检测。所述步骤0)、(5)中环介导间接PCR检测为反应体系为30 μ 1，其中反向PCR扩±曾弓L P7、P8 # 10pmol，dNTPs 0. 3mM, IOXTaq DNALigase ReactionBuffer 3μ 1, IOXExTaq Buffer 3 μ 1，Taq DNA Ligase 0· 3 μ 1，Ex Taq 0. 20 μ 1，探针标记的报告基因和待检样本的核酸溶液各2μ 1 ；反应分三步进行，首先，进行95°C变性5min ；之后按95°C 50sec,60°C 8min 进行 5 个循环；最后按 95°C 30sec,52°C 30sec,72°C 30sec 进行 25 个循环。所述步骤(4)、(5)中环介导间接PCR检测所用连接酶为Taq DNA Ligase0本发明的方法是针对常规PCR和多重PCR检测的缺点，对PRRSV、PCV2和CSFV 3种病毒核酸设计3对特异性探针，利用PCR制备探针标记的报告基因，然后再通过报告基因的环化和反向PCR扩增，实现对3种病毒的环介导间接PCR检测。针对多重PCR的缺点，本研究在常规PCR基础上建立环介导环间接PCR，其基本原理是将两段相邻的特异性探针分别连接在一段无关的报告基因首尾两端，带探针的报告基因可通过首尾探针序列与待测模板互补杂交，杂交体单链部分经缺口补平、连接环化后，再采用反向PCR扩增含探针的环状报告基因而实现对病原菌的间接检测，目前尚未有利用该技术同时检测PCV2，CSFV和PRRSV 3种病原的报道。本研究中，针对3种病毒设计3对特异性探针，标记相同的报告基因，设计1对反向PCR扩增引物，建立环介导间接PCR检测体系，可同时检测病料组织中PRRSV、PCV2和CSFV 3种病原，旨在为科学防控猪病提供一定参考。通过临床试验表，本发明具有检测背景单一，灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，既可用于单病毒检测，又可用于多病毒同时检测，为PRRSV、PCV2和CSFV 3种病毒临床诊断及流行病学调查提供了一种工具。
图1为以质粒pMD18-T-LeCtin为模板，采用常规PCR扩增大豆Lectin基因片段用作报告基因的产物电泳图；图2为利用制备好的DNA或cDNA溶液和特异性探针标记的报告基因分别进行PCV2、CSFV和PRRSV 3种病毒环介导间接PCR检测的电泳图；图3为利用制备好的DNA或cDNA溶液和特异性探针标记的报告基因同时进行PCV2、CSFV和PRRSV 3种病毒环介导间接PCR检测的电泳图；图 4 为制备好的 PCV2，CSFV, PRRSV, PRV, PPV, Haemophilus parasuis 和 ETEC 7种病原核酸分别进行PCV2、CSFV和PRRSV 3种病毒环介导间接PCR检测结果，以评估单病毒检测的特异性；图 5 为制备好的 PCV2，CSFV, PRRSV, PRV, PPV, Haemophilus parasuis 和 ETEC 7种病原核酸同时进行PCV2、CSFV和PRRSV 3种病毒环介导间接PCR检测结果，以评估多病毒检测的特异性；图6为将PCV2，CSFV，PRRSV 3种病毒核酸样本进行倍比稀释后，分别进行PCV2、CSFV和PRRSV 3种病毒环介导间接PCR检测结果，以评估单病毒检测的灵敏度；图7为将PCV2，CSFV, PRRSV 3种病毒核酸样本进行倍比稀释后，同时进行PCV2、CSFV和PRRSV 3种病毒环介导间接PCR检测结果，以评估多病毒检测的灵敏度。
具体实施例方式实施例1环介导间接PCR检测PCV、PRRSV和CSFV 3种猪源性病毒的方法1.1探针与引物的设计分析GenBank数据库已发表的PCV2、PRRSV和CSFV基因序列，以基因的保守区为模板，利用I^rimer Premier 5. 0软件设计针对不同病毒靶标的探针，用以标记报告基因，本实验中所采用的报告基因为大豆Lectin基因，PCR标记所用引物及反向PCR扩增引物均由上海生工合成，引物Pl P6的5’端进行磷酸化修饰，划线部分为探针序列。引物序列见表1。表1标记引物和反向PCR扩增引物序列及特性
引物序列探针靶产物k度引
标物
用途
Pl GAAACCAGCTGTGGCTGATCAAGAAGCCTCATCACA标
PCV2372bp
P2 CCTTCGGATATACTGTCATTTCACCAGGGTTTAGTT记
P3 AAACCAGTCCAGAGGCAATCAAGAAGCCTCATCACA报
PRRSV 371bp
P4 AAAGCCTCGTGTTGGGTTTTCACCAGGGTTTAGTT告
权利要求
1.一种同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于利用PRRSV、PCV2和CSFV 3种病毒核酸设计3对特异性探针，利用PCR制备探针标记的报告基因，然后再通过报告基因的环化和反向PCR扩增，实现对3种病毒的环介导间接PCR检测。
2.根据权利要求1所述的同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于具体包括以下步骤(1)探针和引物的设计根据GenBank数据库中猪圆环病毒2型(PCM)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的高度保守性核苷酸序列设计3对特异性探针；选择大豆Lectin基因作为报告基因，并以此基因片段的核苷酸序列为模板设计1对正向PCR扩增引物和1对反向PCR扩增引物；将3对特异性探针分别置于正向PCR扩增引物的上下游引物的末端，即构成3对针对不同病毒的标记用引物，将标记用引物和反向PCR扩增引物进行合成，用于环介导间接PCR扩增；(2)病毒核酸的制备；(3)报告基因的制备；用3对标记用引物分别扩增大豆Lectin基因，经PCR产物回收后获得3种标记的报告基因，每条报告基因两端带有2条探针，此3种报告基因分别针对不同病毒；(4)单病毒环介导间接PCR检测；将不同的报告基因与待检核酸混合，报告基因携带的探针与目的基因进行杂交，形成杂合分子，之后在嗜热DNA聚合酶和嗜热DNA连接酶作用下，经缺口补平及连接，实现报告基因的环化，再采用反向PCR扩增报告基因，间接检测3种病毒；(5)多病毒环介导间接PCR检测；将3种报告基因与待检核酸混合，经探针杂交、缺口补平及连接，实现报告基因的环化，再采用反向PCR扩增报告基因，间接检测3种病毒。
3.根据权利要求1所述的同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于所述步骤(1)中用于检测PCV病毒的标记引物序列为上游引物 Pl GAAACCAGCTGTGGCTGA TCAAGAAGCCTCATCAC下游引物 P2 CCTTCGGATATACTGTCA TTTCACCAGGGTTTAGTT其中斜体部分为探针序列；所述步骤(1)用于检测PRRSV病毒的标记引物序列为上游引物 P3 AAACCAGTCCAGAGGCAA TCAAGAAGCCTCATCACA下游引物 P4 AAAGCCTCGTGTTGGGT TTTCACCAGGGTTTAGTT其中斜体部分为探针序列；所述步骤(1)用于检测PRRSV病毒的标记引物序列为上游引物 P5 GATGACTTCAGGTCCGGGCTGTG TCAAGAAGCCTCATCACA下游引物 P6 TCGTCAACCGATGAGATAGGG TTTCACCAGGGTTTAGTT其中斜体部分为探针序列；所述步骤(1)进行反向PCR扩增的引物序列为上游引物 P7ACGTGCTAGTGATGGCTAAG下游引物 P8TGTTGAGTCCTCTAGGTTGT。
4.根据权利要求1所述的同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于所述步骤⑴检测3种病毒的标记引物序列在合成时，引物的5’末端均进行磷酸化修饰。
5.根据权利要求1所述的同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于所述步骤(1)检测3种病毒的报告基因为大豆Lectin基因。
6.根据权利要求1所述的同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于所述步骤(2)用氯仿+蛋白酶K法制备核酸DNA，采用Trizol试剂法制备核酸RNA。
7.根据权利要求1所述的同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于所述步骤C3)备的针对PCV病毒的报告基因序列包含列表中的SEQIDN0. 1。
8.根据权利要求1所述的同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于所述步骤⑶备的针对PRRSV病毒的报告基因序列包含列表中的SEQIDN0. 2。
9.根据权利要求1所述的同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于所述步骤(3)中制备的针对CSFV病毒的报告基因序列包含列表中的 SEQIDN0. 3。
10.根据权利要求1所述的同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于所述步骤(4)、(5)中环介导间接PCR检测主要包括2步反应第一步反应报告基因的环化，通过探针与目的基因的杂交形成杂合分子，再经缺口补平及连接实现报告基因的环化，将目的基因的检测置换为对报告基因的检测；第二步反应反向PCR扩增，以环化的报告基因为模板，利用反向引物扩增报告基因，实现对目的基因的间接检测；所述步骤G)、(5)中环介导间接PCR检测为反应体系为 30μ 1，其中反向 PCR 扩增引物 P7、P8 各 lOpmol，dNTPs 0. 3mM, IOXTaq DNA LigaseReaction Buffer 3μ 1, IOXEx Taq Buf f er3 μ 1, Taq DNA Ligase 0. 3 μ 1, Ex Taq·0. 20μ1，探针标记的报告基因和待检样本的核酸溶液各2μ1 ；反应分三步进行，首先，进行95°C变性5min ；之后按95 °C 50sec,60°C 8min进行5个循环；最后按95 °C 30sec,·52°C 30sec,72°C 30sec 进行 25 个循环。
全文摘要
本发明公开了一种同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，利用PRRSV、PCV2和CSFV3种病毒核酸设计3对特异性探针，利用PCR制备探针标记的报告基因，然后再通过报告基因的环化和反向PCR扩增，实现对3种病毒的环介导间接PCR检测。本发明针对3种病毒设计3对特异性探针，标记相同的报告基因，设计1对反向PCR扩增引物，建立环介导间接PCR检测体系，可同时检测病料组织中PRRSV、PCV2和CSFV3种病原，旨在为科学防控猪病提供一定参考。通过临床试验表，本发明具有检测背景单一，灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，既可用于单病毒检测，又可用于多病毒同时检测，为PRRSV、PCV2和CSFV3种病毒临床诊断及流行病学调查提供了一种工具。
文档编号C12Q1/70GK102382905SQ20111034138
公开日2012年3月21日 申请日期2011年11月2日 优先权日2011年11月2日
发明者王永芬, 王老七, 边传周, 郑鸣 申请人:郑州牧业工程高等专科学校