专利名称：一种凡纳滨对虾热休克蛋白基因启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地说是凡纳滨对虾热休克蛋白基因启动子。
背景技术：
凡纳滨对虾俗称南美白对虾，是世界上最重要的三种经济对虾之一，也是我国重要的海水养殖种类，目前可占我国对虾总产量的80%以上。然而，当前凡纳滨对虾的养殖业存在着种质退化、病害频发的难题，特别是对虾白班综合征病毒(WSSV)的大规模爆发严重 制约了我国凡纳滨对虾养殖业的健康发展。转基因是物种种质改良的重要手段，其一般指将人工构建的基因功能元件导入到生物体基因组中，达到改变生物体的性状的目的。当前，转基因技术在经济动植物的性状改良中表现出了巨大的潜在应用价值，如转抗病害基因农作物，转生长因子鲑鱼以及可以在乳腺中分泌药物的转基因动物(生物反应器)等。转基因技术在凡纳滨对虾中也有着广阔的应用前景，如将抗病基因导入对虾中，产生抗病品系，将有可能从根本上解决当前对虾养殖业中WSSV频发的顽疾；将生长因子类的基因导入对虾中，有希望培育出高产、低生长周期的品系，缩小养殖成本，增加养殖效益。当前，在凡纳滨对虾中尚无转基因的应用。除导入及整合方法的限制外，可用基因元件(包括对虾源启动子和功能基因)的缺乏也是重要的限制因素之一。启动子是人工构建转基因载体的不可或缺的重要组成成份，它决定了所转入的基因的表达情况，如表达时间、部位、强度等等。热休克蛋白HSC70是一种重要的生物活性蛋白，参与了生物体内众多的生理过程。Hsc70基因表达的一个重要特征是呈组成型表达，而在高温或病原刺激下又能呈上调表达趋势；而这种表达特征主要取决于hsc70基因的启动子组成。将hsc70基因的启动子元件应用于转基因研究中，可以通过控制温度的高低方便地调控导入基因的表达量，使生物体的性状按照人类的意志进行改变，有重要的应用价值。此外，由于该启动子来自于凡纳滨对虾本身，不存在病毒启动子可能引起的生物安全问题，安全高效。该专利对凡纳滨对虾hsc70基因启动子的发现和其功能的阐明与应用，将有助于凡纳滨对虾转基因育种技术的研究及经济性状的改良。
发明内容
本发明目的在于提供一种凡纳滨对虾热休克蛋白基因启动子。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种凡纳滨对虾热休克蛋白基因启动子凡纳滨对虾热休克蛋白基因启动子为下述任一项(I)凡纳滨对虾热休克蛋白基因启动子为序列表中SEQ ID NO. I碱基序列；(2)与序列表中SEQ ID NO. I限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列；(3)是序列表中SEQ ID NO. I的片段、遗传变体或缺失体，且能控制下游基因转录的DNA分子。
所述启动子作为启动海洋生物组织特异性地表达目标基因的启动子的用途。所述启动子与与之进行可操作的有效基因连接，而后插入载体中构成表达载体。所述有效基因包括如免疫相关基因LGBP、hsp70、lectin、toll等，生长相关基因如myostatin、actin、tubulin、EGF 等，其它重要生理基因如 vasa、SOX、BMP、NOTCH 等；载体为表达载体如 pCMVp-NEO-BAN、pEGFP、pEGFT-Actin、pSV2、CMV4 等。而后以可表达的方式将有效基因与所述的启动子连接，得重组片段；将上述重组片段插入载体中；用该载体转化宿主细胞，培养该细胞表达有效基因。本发明具有如下优点I.本发明获得凡纳滨对虾热休克蛋白基因启动子，其采用BAC克隆全测序及启动 子预测方法，比传统的染色体步移方法更简单快捷。2.本发明将凡纳滨对虾热休克蛋白基因启动子用于转基因载体构建的优势在于(I)热休克蛋白hsc70是一种组成型表达的基因，并且其基因启动子在热刺激后表现出表达量增加的现象。其在转基因后即可源源不断地表达目的基因，而且可以利用热激法使目的基因有更闻水平的表达，从而控制目的基因表达量的闻低。另外，热休克蛋白参与了对虾体内多种生理过程，必定为一个高效表达的调控元件；用热休克蛋白基因启动子构建转基因载体，所携带的外源基因表达效率很可能会大大提高。(2)在对虾转基因实验中使用对虾自身启动子，不会带入病毒等其他生物的核酸序列，具有更高的生物安全性，有利于将来转基因对虾进入市场。3.本发明使用EGFP基因为报告基因构建转基因载体的优点在于EGFP是加强型绿色荧光蛋白，容易观察和检测，能极大地提高转基因动物的筛选效率，有利于对虾转基因技
术的建立。
图I为凡纳滨对虾转基因表达载体pLvHscPl-EGFP构建示意图。图2为凡纳滨对虾热休克蛋白基因启动子表达载体pLvHscPl-EGFP转染昆虫细胞sf9的荧光观察结果。图中Al为热激后3h荧光表达情况，A2为未热激组；B1为热激后6h荧光表达情况，B2为未热激组。
具体实施例方式本发明利用BAC克隆筛选技术、启动子预测技术、DNA扩增及测序技术克隆了凡纳滨对虾热休克蛋白基因启动子；在此基础上利用载体构建技术将所克隆的启动子与携带加强型绿色突光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP)的质粒结合，构建了携带凡纳滨对虾自源启动子和EGFP报告基因的表达载体。它可以在昆虫细胞中启动基因的表达，且表达量可以经热激后上调。实施例I含凡纳滨对虾热休克蛋白基因hsc70的BAC克隆的筛选凡纳滨对虾BAC文库克隆池的构建，包括以下步骤(I)板池的构建以一个384孔板为单位，将384个克隆等量混合，得到的混合克隆为一个板池。
(2)行池和列池的构建384孔板每一行的24个克隆等量混合，得到的混合克隆为一个行池，每一列的16个克隆等量混合，得到的混合克隆为一个列池。(3)超级池的构建将板池按一定顺序排列到96孔板中，再对这些排放于96孔板上的板池进行行池和列池的构建。含凡纳滨对虾热休克蛋白基因的阳性克隆的筛选根据凡纳滨对奸hsc70基因序列(GenBank No. EF495128)设计正向引物5' -CCCTTCACCATCATCAACGAGA -3'及反向引物 5' -TCCAAGGTGCCACGGAACAGAT-3'。以构建的各克隆池为模板，用PCR方法筛选阳性克隆。首先以超级池为模板确定阳性克隆所在的384孔板，再以该板的行池和列池为模板，确定阳性克隆在板上的位置。以阳性克隆菌液为模板，进行PCR扩增。将PCR产物测序，证实确为扇贝热休克蛋白基因hsp70序列。对确定含有柿孔扇贝热休克蛋白基因序列的BAC克隆进行全测序。
凡纳滨对虾热休克蛋白基因启动子，如SEQ ID NO I.所示序列I TATGCGTCAGTGCGAGTGTGTGCATAAGTGCATGAAGAAACGTGATCATAGAGATTTTAC 6061 ATGAAACGTATAGAAGGATGAATGTATGAATGTATGAATGTATGCTATGTATGAAAATCC 120121 TGTAACGGTTAATGGTTAAATCAAATGAACGTACTAGACATCAGAGGCCATACAAAAACA 180181 ACAGAAAACCCTCGTCCTGTTTAGCAACGCGTTCTTTTCCGCTTTGCACCGGGTAGACCC 240241 CAGTCGTCACCGGAAGTGCTTTCATTTCCCACTAAATTTTTCCTTTCTCAACAACAGAAG 300301 AATCGTCAGCGCGTTTTGTTTCCAGAAATTAAAGCCAATCGATTTTCCACGCAGCATCTT 360361 CCTATTACGTAAAAGTTTTTCGCCAAAGCTTCGACGCACGAGACATAATATTCAGCGGAA 420421 TAATTCGTTTCGGAGCTTTTCTCGACGGAAGATGATCTCCCCGAAATACACCTTGTACTA 480481 AAAATGTAACTATTTATAACCAGACCGCATGTCCGTCACGTGAAGTTAGCATTCACGTGG 540541 AGGGTGTGAAGTTCCGCGAGAGGGTTGGTATGCCTGGAATATTTGGTAAAGCCTAGATCA 600601 TAATTTCGATTTCCGAATGATACAACGTCATTCTCTTTCTTATTCATCATCATATATCCG 660661 TCAACACATMTCCTACTAMTATCTCCTCGAMTTCTTAAAATAAAGCGTAATTCCAM 720721 CTCAAAACGAGTMTTACCATGTGMTAGTTACAGGTATGGCAGTGTATGGCAGCTGCCA 780781 GCCGCCGCGTCCCTTTMCAGAGGTTTGGTAAGTTCGAGACTGMTGGAATTTTACATGA 840841 MCGATATAAAGMCTGATGATTAATTATTTCTGTGAMTATGATMTGCATTTTCTTGC 900901 AGTAATTAGCTTTTCAGTTGMGAATATATATTTACCGTAGATTCCTTTATTTMTGAGC 960961 ATTTGTTACCGGMGTATMTGGTGGAAATCGATGGCCAAGAAMTTCTAGMTTCTATG 10201021 ATMGTTCTTACTGTATAATGAMTATAGATAAMTTAAATTGAAACTCTATGATMCTA 10801081 ATTAATTGTATTTGTACATAMCGMTTGTGTGATTCTATGMGATGCGAGAGAGTGTAA 11401141 CGTGTGAGTGTTTGAAATGTAGGTACGAGCGAGGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG 12001201 AGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGATAAAMGGACA 12601261 GGCTTTTCGGACATACMCAACAGTCTTACGCAATGAATTATATAATACTGTCGAGGGCA 13201321 TGTTMCTGAGTGATGTGTGATTCMGTTTTTATCMTGTGACTGATAAAGTTACCGAGG 13801381 ACAGCTGATGATTAGGMTTCGTAGAATMCAAMGACATATTTCMCACATTAAATATA 14401441 CGTCGTTAGAGTATGGATTGTATATTTACTGATATTGGTGTTTCCTTTTATATAAMCAA 15001501 MTAATTGTAGAMTTTTGGCGTTTTTATTTCATTTTTTTTTCTTTATTAGGAGTMGTA 15601561 CTCAGTCAMTGGGTATTTTMCGACCAGTTGACTGCATTTTCATTTTGAAMGTACCAT 1620
1621 CGCTTCTAATCATTMTGAGMCATTTAAGTCGMGCTTAAATCTGACTGCATGATATTC 16801681 TTGCTTTCGCCATATTACAAAAATMGTAMTAATGGAAACAAACTGCAATMGATTATA 17401741 ACACCTGTMGCCTGAMTGACTGTGMTATATTTTCAGCTATTATATCGAATAAATATG 18001801 ATTGGTTCAGTTGATGTAMCGTGTCATACCTTACACGAATTATATTTCACTACTATGAT 18601861 ACCTTTAGCGTTATTGTCMGACTGGTAACCCATAGACATTCTAGATATTATCMTTATC 19201921 ATMGCGAACMTTTACTMTAMGACACTTTTTTCCMCTGTGTCTGAAGMGTTATTT 19801981 TTACTCCGGGCTCTACGGTTGCATAAAGCCGGGCCACGTGATACTCTCGTAGATGGTCCC 20402041 CCGCGCCCAGACCTCGCTGGCTGGCTGGCTCGCTCTGCCATGAGGTCGCTTCCCACGTGG 2100 2101 TGACGGAGCCGCTGTCATGTTGGCACGCCTGGTACGCCGAGCCGTTCTGCGGTGACGCGC 21602161 GTAAMTTCCCGCCAAATATTGTCCAATCAGCGTTGACCATTCCGGCATTGTTGACCMT 22202221 GAGAACGGTTCTTTTACTACGTCACTGTTATGAAGCCCTACGATTGGGACCAGMGTGAC 22802281 GTCATGMCTAGGAGCTCTCTGMTGGCCMCGTTCCGAAGMGGTTCTAGMGGTTTAC 23402341 AAAGGGGTCGATGTCGCCGCTTTATGGATTTGTCGMGTCATACCAGCCGGAGACCGAGA 24002401 GAAGAGAGGACGTATTACAGCTAGCTCTMGGACTATTTAAAAATATCTAAMTAAGGTA 24602461 AGCCAATGATCTATTTG2477(a)序列特征*长度2477碱基对*类型核苷酸*链型单链*拓扑结构线性(b)分子类型DNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源凡纳滨对奸(Litopenaeus vannamei)(f)特异性名称Promoter实施例2凡纳滨对虾热休克蛋白基因启动子片段的克隆分析测得的BAC克隆全长，将编码热休克蛋白基因hsc70的第一个碱基记为+1。取-3800至O位置的碱基序列进行启动子预测。在-700、-1600和-3100碱基处分别预测到三个分值很高(分别是0.701、0.773和0.696)的启动子区域。经同源性比对得知，该基因在-1200碱基处还有转录，故将-3700至-1200间的碱基序列定为热休克蛋白基因的启
动子区。在该启动子两侧设计引物，并加上不同的没切位点(Xho I和BamH I)，用聚合酶链式反应(PCR)扩增启动子区。设计正向引物Fl :5' -CTCGAGTATGCGTCAGTGCGAGTGTG -3'及反向引物Rl 5/ -GGATCCCAAATAGATCATTGGCTTACCTTAT-3'并在以下的反应体系中进行聚合酶链式反应(PCR)扩增SEQ ID NO I.所示序列表中启动子区，PCR产物电泳并进行胶回收。反应体系模板(BAC质粒)1μ I ;正向引物(lOpmol/μ 1)0. 5μ I ;反向引物(lOpmol/μ 1)0. 5μ I ； IOxTaq DNA 聚合酶缓冲液 2. 5 μ I ；MgCl2 (2. 5 μ mol/L) I. 5 μ I ;脱氧核苷酸混合物dNTP (IOmmoI/L) O. 5 μ I ；Taq DNA聚合酶O. 25 μ I ;灭菌水18. 25 μ I ;总体积25 μ I。将胶回收纯化所得PCR产物连接pMD19_T simple载体过夜；将连接产物转化DH5ci大肠杆菌菌株，涂布含氨苄青霉素的平板，37 °C培养过夜；挑选含重组子的阳性克隆，利用载体引物M13 (正向引物5 ^ -GTTTTCCCAGTCACGAC-3 ,;反向引物
-CAGGAAACAGCTATGAC-3/ )及启动子序列特异引物PCR扩增并测序验证，具体为步骤如
下挑取10个单克隆，并以挑取的单克隆细菌为模板，分别用上述两组引物对其进行PCR扩增。反应体系为模板(单克隆菌液)1μ I ;正向引物(lOpmol/μ 1)0. 5 μ I ;反向引物(IOpmol/μ I) O. 5 μ I ; IOxTaq DNA 聚合酶缓冲液 2. 5 μ I ；MgCl2 (2. 5 μ mol/L) I. 5 μ I ;脱 氧核苷酸混合物dNTP (IOmmoI/L) O. 5 μ I ；Taq DNA聚合酶O. 25 μ I ;灭菌水18. 25 μ I ;总体积 25 μ I0两组引物都有扩增、且电泳条带大小与序列长度一致的的单克隆视为阳性克隆。提取阳性克隆的质粒(用TIANGEN普通质粒小提试剂盒，目录号DP103)，对提取的质粒进行测序，证实质粒中所含的序列为目标启动子序列。实施例3启动子表达载体与转基因载体pLvHscPl-EGFP的构建用限制性内切酶Xho I和BamH I对提取的质粒进行双酶切，并回收SEQ ID NOI.所示序列表中启动子片段；再用限制性内切酶Xho I和BamH I对载体pEGFP_l进行双酶切，并回收被线性化的pEGFP-1载体；用T4连接酶过夜连接回收的启动子片段和pEGFP-Ι载体。连接体系如下，pEGFP-Ι与启动子片段的摩尔比控制在I : 2-6之间。将连接产物转化DH5a大肠杆菌菌株，涂布含卡那霉素的平板，37°C培养过夜。挑选含重组子的阳性克隆。利用pEGFP-Ι载体引物和启动子特异引物同时检测。连接体系T4连接酶 I μ I ;10x Buffer I μ I ；pEGFP-1 I μ I ;启动子片段 7 μ I ;总计，10 μ Io其中pEGFP-Ι载体引物如下正向引物FI :5' -CTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGG-3'反向引物Rl :5' -CCTTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTC-3'。实施例4转基因载体pLvHscPl-EGFP的活性验证(I)昆虫细胞sf9的培养及传代，将对数生长期的sf9细胞经计数，以6xl05/ml的细胞密度传代至6孔板中，27°C过夜培养。(2)转染，在细胞密度达到铺板面积80-90%时开始转染。转染mix的配制用超纯水配制IOOul浓度为20ng/ul转染载体。混合均匀后加Fugene HD转染试剂7ul，混合均匀。室温放置15分钟。加入到6孔板中，培养基液面以下，混合均匀。(3)转染18h后对一组进行热激42 °C 30分钟，另一组不做处理。热激后3h和6h时分别观察两组荧光表达情况，两组均能观察到荧光，而热激组比未热激组表达量高(参见图2)。
权利要求
1.一种凡纳滨对虾热休克蛋白基因启动子，其特征在于凡纳滨对虾热休克蛋白基因启动子为下述任一项 (1)凡纳滨对虾热休克蛋白基因启动子为序列表中SEQID NO. I碱基序列； (2)与序列表中SEQID NO. I限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列； (3)是SEQID NO. I的片段、遗传变体或缺失体，且能够控制下游基因转录的DNA分子。
2.—种权利要求I所述的凡纳滨对虾热休克蛋白基因启动子的应用，其特征在于所述启动子作为启动海洋生物组织特异性地表达目的基因的启动子的用途。
3.按权利要求2所述的凡纳滨对虾热休克蛋白基因启动子的应用，其特征在于以可表达的方式将有效基因与所述启动子连接，得重组片段；将上述重组片段插入载体中；用该载体转化宿主细胞，培养该细胞表达有效基因。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种凡纳滨对虾热休克蛋白基因启动子。采用BAC克隆筛选及测序分析、启动子预测、DNA扩增及测序、载体构建等技术得到凡纳滨对虾热休克蛋白基因启动子，具有序列表中SEQ ID NO.1碱基序列；在此基础上用所克隆的启动子与携带加强型绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒结合，构建了含凡纳滨对虾自源启动子的EGFP基因表达载体；将该表达载体转染昆虫细胞sf9，观察到绿色荧光蛋白有较强的表达，且在热激后有更高水平的表达；该发明获得凡纳滨对虾热休克蛋白基因启动子，其采用含目的基因的BAC克隆全测序及启动子预测方法，比传统的染色体步移方法更简单快捷。
文档编号C12N15/63GK102757964SQ201110341708
公开日2012年10月31日 申请日期2011年10月28日 优先权日2011年10月28日
发明者张晓军, 李富花, 相建海, 赵翠, 郇聘 申请人:中国科学院海洋研究所