专利名称：马铃薯pinⅡ基因启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体地说，涉及一种马铃薯pin II基因启动子及其应用。
背景技术：
随着生命科学、基因组学、生物信息学等学科的发展，转基因技术研究日新月异，转基因作物种植面积逐年增加。转基因作物中目的基因的表达强弱，很大程度上影响着转基因作物的应用。影响基因表达的因素有很多，主要有以下五方面:核酸的结构、转录强弱、转录后修饰、翻译效率和翻译后修饰，其中转录强弱起着重要作用。调控基因转录强弱的是启动子，因此开发强启动子对转基因作物的培育具有重要意义。植物基因工程中常用的启动子按其作用方式和功能可分为三类:组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子。组成型启动子在所有组织中都启动基因表达，具有持续性，不表现时空特异性；RNA和蛋白质表达量也是相对恒定的。此类启动子的代表性启动子有烟草花叶病毒CaMV35S启动子、玉米泛素基因Ubiquitin启动子和水稻肌动蛋白基因Actin启动子。诱导型启动子在正常情况下不能启动基因的表达,但受某些物理、化学、生物信号的刺激后，此类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平，如拟南芥逆境诱导启动子rd29A。在组织特异性启动子的调控下，基因的表达往往只发生在某些特定的器官和组织，并往往表现发育调节的特性，如烟草花粉绒毡层细胞中特异表达基因启动子TA29。抗病虫基因越来越多的应用于农作物，使作物产量得到了大幅度的提高。为了提高这些抗病虫基因在转基因作物中的表达，多是使用异源组成型强启动子调控表达，如CaMV35S。由于CaMV35S启动子来源于病毒，从生物安全角度考虑，其在一定程度上影响了转基因作物的推广。随着转基因技术的发展，多基因转化成为植物基因工程研究的新热点，亟待开发更多有效的启动子。因此直接从植物克隆高效表达的启动子具有重要的应用价值。 马铃薯蛋白酶抑制剂II (PIN II)属于丝氨酸蛋白酶抑制剂，主要存在于马铃薯、西红柿等茄科植物中。该蛋白编码基因表达具有多样性:在储藏器官如马铃薯块茎、西红柿果实中是组成型表达，而在叶片中是诱导表达，可响应多种理化诱导信号，如机械损伤、虫害、热刺激、电刺激、茉莉酸、乙烯、脱落酸、蔗糖、系统素等。马铃薯蛋白酶抑制剂II的mRNA在损伤处理3-4小时后开始积累，9小时时达到峰值，然后逐渐下降；马铃薯蛋白酶抑制剂II蛋白在损伤处理4小时后即可检测到，并逐渐增加，可在最高值保持数天。马铃薯蛋白酶抑制剂II蛋白编码基因不仅在损伤部位诱导表达，而且可以在损伤部位的远端诱导表达。基于马铃薯蛋白酶抑制剂II基因的表达特性，克隆研究该基因启动子具有重要的理论意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有高效启动活性的马铃薯pin II基因启动子及其应用。为了实现本发明目的，本发明的马铃薯pin II基因启动子，其核苷酸序列为:i)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；或ii) SEQ ID N0.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由i)衍生的核苷酸序列。本发明还提供含有上述启动子的表达盒。本发明还提供含有上述启动子的载体，所述载体为植物表达载体，例如植物双元表达载体等。本发明还提供含有上述表达盒或载体的宿主细胞。本发明还提供含有上述启动子的转化植物细胞。本发明还提供马铃薯pin II基因启动子在调控下游基因表达中的应用，优选下游基因为GUS基因。本发明进一步提供马铃薯pin II基因启动子在制备转基因植物中的应用。例如，可以将目的基因可操作地连接到马铃薯Pin II基因启动子之下，构建得到表达盒，进一步可将该表达盒导入植物表达载体，将获得的重组表达载体通过比如，农杆菌介导、基因枪法以及花粉管通道等方式转化植物，获得转基因植物。从而可以通过引入抗虫、抗病、抗逆等基因，培育出抗虫、抗病、抗逆植物，提高植物抗虫、抗病和/或抗逆活性。本发明的启动子可用于制备本领域公知的转基因植物，用于控制外源或内源基因的表达，所述植物为双子叶植物或单子叶植物，如烟草、拟南芥等。本发明从克隆马铃薯pin II基因启动子入手，通过对马铃薯pin II基因启动子结构和序列的分析，验证了马铃薯Pin II基因启动子的功能。将本发明的启动子构建成GUS融合表达载体，转化烟草和拟南芥。GUS组织化学染色和GUS酶活性测定结果均表明，本发明提供的启动子能启动GUS基因的表达，具有强启动子活性，为植物抗逆基因工程研究提供了新的启动子元件，也为下一步植物遗传改良和产业化研究奠定了基础。
图1为本发明实施例1中马铃薯pin II启动子PCR扩增结果。图2为本发明实施例2中载体pCAMBIA1300-pin I1-GUS的构建流程示意图。图3为本发明实施例4中转基因烟草幼苗染色分析结果。图4为本发明实施例5中转基因烟草叶片和转基因拟南芥叶片GUS酶活定量分析结果。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行或按照制造生产厂商的使用说明。实施例1马铃薯pin II基因启动子的克隆
根据登录号X04118在GenBank中查询马铃薯蛋白酶抑制剂II基因核酸序列。根据此核酸序列设计引物扩增马铃薯pin II启动子片段。设计的引物为:正向引物5’-AACTGCAGCCCAATTCAAAGAACTTG-3’ (SEQ ID N0.2)，5’ 端引入 PstI 酶切位点，反向引物5’ - CGCGGATCCTTAATTAGTACTGCCTCT-3’ (SEQ ID N0.3)，5’ 端引入 BamHI 酶切位点。以马铃薯基因组DNA为模板，PCR扩增pin II启动子序列，得到928bp的PCR产物(图1)。PCR反应体系:
权利要求
1.马铃薯pinII基因启动子，其特征在于，其核苷酸序列为: i)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；或 ii)SEQID N0.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由i)衍生的核苷酸序列。
2.含有权利要求1所述启动子的表达盒。
3.含有权利要求1所述启动子的载体。
4.含有权利要求2所述表达盒或权利要求3所述载体的宿主细胞。
5.权利要求1所述的启动子在调控下游基因表达中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，下游基因为GUS基因。
7.权利要求1所述启动子在制备转基因植物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
9.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于，所述植物为烟草、拟南芥。
全文摘要
本发明涉及马铃薯pinⅡ基因启动子及其应用，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由其衍生的核苷酸序列。本发明从克隆马铃薯pinⅡ基因启动子入手，通过对马铃薯pinⅡ基因启动子结构和序列的分析，验证了马铃薯pinⅡ基因启动子的功能。将本发明的启动子构建成GUS融合表达载体，转化烟草和拟南芥。GUS组织化学染色和GUS酶活性测定结果均表明，本发明提供的启动子能启动GUS基因的表达，具有强启动子活性，为植物抗逆基因工程研究提供了新的启动子元件，也为下一步植物遗传改良和产业化研究奠定了基础。
文档编号C12N5/10GK103146704SQ20131006948
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月5日 优先权日2013年3月5日
发明者王国英, 张生学, 刘允军 申请人:中国农业科学院作物科学研究所