专利名称：烟碱生物合成ao基因启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物基因工程技术领域，具体涉及ー种烟碱生物合成AO基因启动子及其应用。
背景技术：
烟碱(Nicotin)，又称尼古丁，化学名称为1-甲基-2_(2_吡啶基)吡咯烷，分子式为CltlH4N2，是ー种天然存在于烟草中的生物碱，是烟草中特有的。烟碱能够对人产生一定的生理刺激作用，是使烟草具有商品价值的主要因素。随着烟碱的生物活性越来越受到人们的重视，其应用也越来越广泛，对它们的开发已经逐渐深入到食品、保健、医药和日用用化エ等多个领域，应用前景非常广阔。如烟草替代品生产需要大量的烟碱目前对烟草依赖的 治疗方法包括药物治疗、心理治疗、针灸和中药治疗等，经美国FDA批准的治疗方案和药物主要有烟碱替代疗法如烟碱贴剂、ロ胶、鼻喷雾剂和吸入剂等，采用nAChR抑制剂药物治疗，如安非他酮和注射剂如酒石酸瓦伦尼克林，还有美卡拉、去甲替林、可乐定和抗焦虑药等，这些烟碱替代物的生产需要大量提取烟碱作为原料；另外，烟碱还广泛应用于环保农药的开发以及特种疾患药物的生产烟碱系列农药属植物杀虫剂，因其具有蒸薰、胃毒、触杀功能及迅速降解无残留等特点广泛用于粮食、油料、蔬菜、水果、牧草等农作物的杀虫剂，是生产绿色食品的理想的高效杀虫剂和生物性农药，它还广泛应用在医药エ业上，是研制治疗心血管、皮肤病、蛇毒等疾患药物的特种原料。还可用其所制得的柠檬酸烟碱应用于高级香烟的品种改良剂组分等，而且随着烟草エ业、精细化工、制药、有机合成、国防、农药等的迅速发展。市场对烟碱的需求与日俱增，特别是高纯烟碱的需求更大。烟碱分子包含ー个吡咯烷环和吡啶环，而吡啶环是由NAD途径合成的，吡咯烷环是由基本氨基酸经过中间产物腐胺形成的。參与烟碱生物合成的蛋白包括天冬氨酸氧化酶(aspartate oxidase, AO),喹啉酸合成酶(quinolinate synthase, QS),喹啉酸憐酸核糖基转移酶(quinolinate phospho-ribosyltransferase,QPT)，鸟氨酸脱羧酶(ornithinedecarboxylase, 0DC),腐胺 N-甲基转移酶(putrescine N-methytransferase, PMT)(Katoh et al. , 2005; Cane et al. , 2005), ニ胺氧化酶(diamine oxidase, DA0),编码这些蛋白的基因都可以在况かk中找到。其中腐胺N-甲基转移酶由三个基因编码(PMTI，PMT2, PMT3) (Shoji et al.，2000)。如果要通过编码这些酶类的基因来调控烟碱的合成，则首先应当找到其对应的启动子。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供ー种可对烟碱生物合成起调控作用的AO基因启动子及其嵌合基因。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是
一种烟碱生物合成AO基因启动子，其核苷酸序列为
(I)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或(2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经重复、缺失、替换或移位等常规技术手段改造而形成的具有同等功能的核苷酸序列。扩增上述AO基因启动子的引物对，具有SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。—种嵌合基因，其中包含上述烟碱生物合成AO基因启动子以及与之可操作连接的、编码目的基因的序列。ー种植物转化载体，其中包含上所述嵌合基因。
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ー种转基因植物细胞，其中包含上述嵌合基因。ー种转基因植物组织，其中包含上述嵌合基因。上述烟碱生物合成AO基因启动子或上述嵌合基因在调控烟碱生物合成中的应用。本发明具有积极有益的效果
烟碱AO基因启动子区域产生基础水平的转录，调控区域能够对不同的环境条件作出应答，对烟碱合成基因的表达水平做出相应的调节(根据需要进行上调或下调)，进而对烟草种植生产出适量烟碱含量的烟叶以及生产出高品质的烟碱提取原料有着重要的现实意义。
图1为PCR扩增烟碱基因启动子电泳图，其中左图以N.tabacum基因组DNA为模板，右图以N. sylvestris基因组DNA为模板；
图2为A0，QS, QPT基因启动子中含有的保守的转录结合位点框架图；通过使用Genomatix公司的FrameWorker软件分析单个的转录结合位点构建的框架图；转录结合位点的的组织(包括DNA链的特异性，相对顺序)都是保守的；不同基因启动子中转录结合位点的距离变化非常小；不同顔色代表不同转录因子的结合位点；单线上面的符合代表转录结合位点位于有义链，而单线下面的符合代表转录结合位点位于反义链；
图3为A0，QS, QPT基因启动子中发现的转录因子示意模式图；该模式图由Genomatix公司的Fast软件分析得到；模式图中变化距离反应了三个基因启动子序列中不同的转录因子结合位点之间的距离。
具体实施例方式以下结合具体实施例进ー步阐述本发明。下述实施例中所涉及的试验方法或分析方法，如无特别说明，均为常规方法，所用试剂如无特别说明，均为市售。实施例1烟碱合成基因的分离、鉴定
烟碱合成基因AO, QS, QPT2, ODC, DAO, PMTI, PMT2和PMT3启动子序列均从况sylvestris基因组序列中提取得到，这些基因在基因组中的位置如下表I所示。其中烟碱合成基因AO启动子序列的如SEQ ID NO.1所示。表I各启动子在况かis基因组中的位置
权利要求
1.一种烟碱生物合成AO基因启动子，其核苷酸序列为 (1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或 (2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经重复、缺失、替换或移位改造而形成的具有同等功能的核苷酸序列。
2.扩增权利要求1所述AO基因启动子的引物对，其特征在于，具有SEQID NO. 2和SEQID NO. 3所示的核苷酸序列。
3.一种嵌合基因，其中包含权利要求1所述烟碱生物合成AO基因启动子以及与之可操作连接的、编码目的基因的序列。
4.一种植物转化载体，其中包含权利要求3所述的嵌合基因。
5.一种转基因植物细胞，其中包含权利要求3所述的嵌合基因。
6.一种转基因植物组织，其中包含权利要求3所述的嵌合基因。
7.权利要求1所述烟碱生物合成AO基因启动子或权利要求3所述嵌合基因在调控烟碱生物合成中的应用。
全文摘要
本发明涉及烟碱生物合成AO基因启动子及其应用。该烟碱生物合成AO基因启动子从N.sylvestris基因组序列中提取得到，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。烟碱AO基因启动子区域产生基础水平的转录，调控区域能够对不同的环境条件作出应答，对烟碱合成基因的表达水平做出相应的调节(根据需要进行上调或下调)，进而对生产出高品质的烟碱提取原料有着重要的现实意义。
文档编号C12N15/82GK103013996SQ20121022140
公开日2013年4月3日 申请日期2012年6月30日 优先权日2012年6月30日
发明者刘国顺, 张松涛, 贾宏昉, 崔红, 刘卫群, 杨永霞 申请人:河南农业大学