专利名称：人pten基因的启动子及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及人PTEN基因的启动子的克隆及应用。
背景技术：
第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白基因(phosphatase and tensin homolog deletedon chromosome ten，PTEN)是于1997年发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，研究发现PTEN不仅与肺癌的发生、发展关系密切，与其他呼吸系统疾病，如支气管哮喘等也有着一定的关系。现有技术公开了 PTEN的基因序列，其位于染色体10q23. 31，全长2001Λ，其成熟蛋白是由403位氨基酸构成的一条多肽链，相对分子质量为56KD ；通过对氨基酸开放读码框 (openreading frame,0RF)的序列分析，提示它含有一个酪氨酸磷酸酶域，以及一个与鸡张力蛋白和牛辅助蛋白同源的大区域；它还包括一个C2域，该域在PTEN与膜的结合中发挥作用，也在调控细胞迁移中发挥一定的作用；在PTEN的结构中，还存在一个有三个氨基酸序列的C端，可结合I^d-95/Dlg/Z0-l(PDZ)域(由90个氨基酸残基组成的重复序列，因最早发现于I^d-95、Dlg和Z0-1而命名，又称为GLGF重复子)，并与恢复PTEN的膜结合有密切关系。研究发现PTEN参与了小鼠哮喘的发病机制。在卵蛋白(OVA)诱发的哮喘小鼠模型中，PTEN蛋白表达和活性均降低，在给予PII抑制剂(渥曼青霉素)或PTEN腺病毒cDNA 后，可明显减少嗜红细胞水平和气道炎症，即上调PTEN表达能治疗哮喘。在过敏原诱发的哮喘小鼠模型给予PPAR- γ促效剂或PPAR- γ腺病毒后，PTEN表达上调。通过测量Akt磷酸化水平的减少发现该上调与PUK活性降低有关。该实验表明PPAR-γ在哮喘发病学中， 通过调节PTEN表达而起到保护作用。上述研究结果表明PTEN参与了人类哮喘的发病机制。哮喘是世界公认的医学难题，被世界卫生组织列为疾病中四大顽症之一。与哮喘相关的症状有咳嗽、喘息、呼吸困难、胸闷、咳痰等。典型的表现是发作性伴有哮鸣音的呼气性呼吸困难。严重者可被迫采取坐位或呈端坐呼吸，干咳或咯大量白色泡沫痰，甚至出现紫绀等。哮喘症状可在数分钟内发作，经数小时至数天，用支气管扩张药或自行缓解。早期或轻症的患者多数以发作性咳嗽和胸闷为主要表现。尽管哮喘的治疗在多方面取得了进步，但没有根本性的突破，尤其遗憾的是中药治疗哮喘离被国际认可的距离很远，个案成功缺少普遍意义，急需寻找新的突破点。尽管有哮喘动物模型，但耗费高、耗时长，且有种属差异，而目前尚无好的体外研究模型，限制了药物的高通量筛选。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于PTEN(第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白基因)的治疗哮喘药物的模型或者方法。本发明提供了一种PTEN启动子转录活性片段，该转录活性片段包括PTEN启动子的-778至-1390区域，或者-1339至-2141区域。例如，该转录活性片段包括PTEN启动子的-778至-2141区域。在本发明的一个实施例中，该转录活性片段是PTEN启动子的-778 至-1390区域；在另一个实施例中，是PTEN启动子的-1339至-2141区域。所述的PTEN全称是第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白基因 (phosphatase andtensin homo log deleted on chromosome ten),其详细介绍可以参见 genbank数据库NM 000314. 4、NP 000305. 3和Hs. 500466。PTEN启动子介绍也可以参见 genbank数据库上述链接。所述的转录活性片段，可以按照PTEN启动子的-778至-1390区域、或者-1339 至-2141区域的序列，人工合成。本发明还提供了一种含有上述PTEN启动子转录活性片段的荧光报告载体。所述的转录活性片段，可以先设计引物，进行聚合酶链反应扩增获得所述的转录活性片段；然后将该转录活性片段连接到荧光报告载体。其制备方法详细包括以下步骤1)克隆了 PTEN的启动子区域参考相关文献报道，选取PTEN启动子可能的转录活性区进行基因扩增。本发明选取PTEN启动子的-778至-2141区域进行扩增(以ATG为+1)，扩增的PTEN启动子片段连到T载体上，送测序。将测序结果和NCBI数据库上的PTEN理论序列比较，结果显示成功克隆了 PTEN的启动子区域。2)构建了 3个含不同长度PTEN启动子区域的荧光报告载体参考相关文献，根据PTEN启动子的转录因子调节位点，将克隆的PTEN启动子再细分为两段1)-778至-1390区域；2)-1339至-2141区域。最终共构建了 3段PTEN启动子区域，分别为:1)-778至-1390区域；2)-1339至-2141区域；3)-778至-2141区域。分别将这三个片段连接到荧光报告载体pGL-3-basic上，将连接好的载体送测序，测序结果显示成功构建了 3个含不同长度PTEN启动子区域的荧光报告载体。然后，通过对荧光报告基因表达的分析确定了 PTEN的启动子的转录活性区域将构建的含3个不同长度PTEN启动子的荧光报告载体转染A549细胞(以PRL-CMV作为校正)，转染后分析firefly荧光素酶和renilla荧光素酶的活性，以firefly/renilla的比值作为启动子转录强弱的依据。荧光素酶实验显示-778至-1390区域和-778至-2141区域的转录活性较高，而-1339至-2141区域的转录活性很低。通过荧光素酶实验基本确定了 PTEN的启动子的转录活性区域为-778至-1390区域。最后，可以利用Trichostatin A(TSA)进行检测将构建的含PTEN-778至-2141 区域的荧光报告载体转染A549细胞(以PRL-CMV作为校正)，转染Mhr后，给予 Trichostatin A(TSA)处理，结果Trichostatin A(TSA)对这段启动子区域有上调作用。本发明构建的含有PTEN启动子转录活性片段的荧光报告载体，可以用做药靶，筛选治疗哮喘的药物。 本发明的PTEN启动子转录活性片段及其相应的荧光报告载体还可以用于制备筛选治疗哮喘的药物的试剂盒。 哮喘是世界公认的医学难题，但是目前尚无好的体外研究模型，限制了药物的高通量筛选。PTEN是最佳的哮喘治疗靶点之一，利用人PTEN基因启动子区构建荧光报告载体建立哮喘研究的体外模型，可用于筛选治疗哮喘的药物。本发明提供了 PTEN启动子转录活性片段，该转录活性片段包括PTEN启动子的-778至-1390区域，或者-1339至-2141区域。 本发明利用建立含有PTEN基因启动子转录活性区的荧光报告载体，对大量单体进行检测， 能够筛选出上调PTEN表达的单体，进而体内实验确认其治疗哮喘的功能，为可能的临床试验打下基础。
图1是PTEN启动子PCR电泳结果图。图2是荧光素酶实验结果图。图3是TSA上调PTEN启动子的转录活性柱状图。
具体实施例方式实施例1 人基因组DNA提取用天根生物的基因组抽提试剂盒抽提正常人全血基因组DNA，方法和步骤如下1)取200ul新鲜血液，加200ulGA溶液，彻底裂解细胞⑵加入20 μ 1蛋白酶K溶液，混勻；3)加200 μ 1缓冲液GB，充分颠倒混勻，56°C放置10分钟；4)加200 μ 1无水乙醇， 充分颠倒混勻力)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，12，OOOrpm( 13, 400Xg)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中；6)向吸附柱 CB3中加入500 μ 1缓冲液⑶(12，000rpm( 13，400Xg)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中；7)向吸附柱CB3中加入700 μ 1漂洗液PW，12，OOOrpm( 13, 400Xg)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中；8)向吸附柱CB3 中加入500 μ 1漂洗液PW，12，OOOrpm( 13，400 Xg)离心30秒，倒掉收集管中的废液。9) 将吸附柱CB3放回收集管中，12，OOOrpm( 13，400 Xg)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱 CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50-200μ 1洗脱缓冲液ΤΒ，室温放置2-5分钟，12，OOOrpm( 13，400Xg)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。实施例2 :ΡΤΕΝ启动子区域1的克隆及荧光报告载体的构建以抽提的正常人血基因组DNA作为模板，首先使用引物Fl和Rl用于扩增PTEN启动子-778至-2141区域，扩增产物的大小为1. 3kbp左右，此区域为PTEN-pomoter-l (如图 1所示)，胶回收该片段。将得到的ΡΤΕΝ-pomoter-l片段用限制性内切酶Bgl II和Kpn I 酶切，然后回收酶切产物。将pGL-3-basic载体用Bgl II和Kpn I进行双酶切，回收酶切产物。将回收的ΡΤΕΝ-pomoter-l酶切片段和pGL-3-basic载体片段在16°C下进行连接反应，转化大肠杆菌感受态细胞后，涂布于含氨苄青霉素的LB平板，37°C过夜培养。在转化后长出的菌落中随机挑选了几个菌落，用Fl和Rl引物做PCR验证。经初步验证正确的克隆送去测序，最终将此载体命名为pGL3-PTEN-p0m0ter-l。引物 Fl :5，-GAAAGTACTTGGTATTTCCCACTCC-3，； (SEQ ID NO 1)引物 Rl :5，-GAAGATCTTAGTCCTGTCGGGTTT-3，(SEQ ID NO 2)。实施例3 :PTEN启动子区域2的克隆及荧光报告载体的构建以抽提的正常人血基因组DNA作为模板，引物F2和Rl用于扩增PTEN启动子-778至-1390区域，扩增产物的大小为0. 6kb左右，此区域为PTEN-pomoter-2 (如图1所示)。 胶回收该片段，将得到的PTEN-pomoter-2片段用限制性内切酶Bgl II和Kpn I酶切，然后回收酶切产物。将pGL-3-basic载体用Bgl II和Kpn I进行双酶切，回收酶切产物。将回收的PTEN-pomoter-2酶切片段和pGL-3-basic载体片段在16°C下进行连接反应，转化大肠杆菌感受态细胞后，涂布于含氨苄青霉素的LB平板，37°C过夜培养。在转化后长出的菌落中随机挑选了几个菌落，用F2和Rl引物做PCR验证。经初步验证正确的克隆送去测序，最终将此载体命名为pGL3-PTEN-pomoter-2。弓I物 F2 :5'-GAAAGTACTTGGTATTTCCCACTCC-3'；引物 Rl 5'-GAAGATCTTAGTCCTGTCGGGTTT-3'。实施例4 :PTEN启动子区域3的克隆及荧光报告载体的构建将pGL3-PTEN-pomoter-l载体用Β ο I和Kpn I进行双酶切，回收酶切小片段 (-1339-2141)。将pGL-3-basic载体用Xho I和Kpn I进行双酶切，回收酶切产物。将回收的pGL3-PTEN-pomoter-l载体酶切小片段和pGL-3-basic载体酶切片段在16°C下进行连接反应，转化大肠杆菌感受态细胞后，涂布于含氨苄青霉素的LB平板，37°C过夜培养。在转化后长出的菌落中随机挑选了几个菌落，摇瓶培养后抽质粒，用》10 I和Kpn I酶切验证。 经初步验证正确的克隆送去测序，最终将此载体命名为pGL3-PTEN-p0m0ter-3。实施例5 :PTEN启动子荧光报告载体的转染及转录活性检测将构建的含3个不同长度PTEN启动子的荧光报告载体转染A549细胞(以 PRL-SV40作为校正)，转染后分析firefly荧光素酶和reni 1 Ia荧光素酶的活性，以 firefly/renilla的比值作为启动子转录强弱的依据。荧光素酶实验显示(图2) :-778 至-1390区域和-778至-2141区域的转录活性较高，而-1339至-2141区域的转录活性很低。通过荧光素酶实验基本确定了 PTEN的启动子的转录活性区域为-778至-1390区域。实施例6 :PTEN启动子荧光报告载体的验证选取已报道的能上调PTEN转录活性的化合物"Trichostatin A(TSA)对构建的 PTEN启动子荧光报告载体进行验证。将构建的pGL3-PTEN-p0m0ter-l的荧光报告载体转染 A549细胞(以PRL-SV40作为校正)，转染后分析firefly荧光素酶和reniIla荧光素酶的活性，以firefly/renilla的比值作为启动子转录强弱的依据。荧光素酶实验显示TSA能显著上调PTEN启动子的转录活性(图3)，与相关报道一致，证明本实验构建的PTEN启动子报告基因体系是有效的。
权利要求
1.PTEN启动子转录活性片段，其特征在于，该转录活性片段包括PTEN启动子的-778 至-1390区域，或者-1339至-2141区域。
2.如权利要求1所述的转录活性片段，其特征在于，该转录活性片段是PTEN启动子的-778至-2141区域。
3.权利要求1所述的转录活性片段的制备方法，其特征在于，按照PTEN启动子的-778 至-1390区域、或者-1339至-2141区域的序列，人工合成。
4.一种荧光报告载体，其特征在于，该载体含有权利要求1所述的PTEN启动子转录活性片段。
5.权利要求4所述的荧光报告载体的制备方法，其特征在于，设计引物，进行聚合酶链反应扩增获得所述的转录活性片段；然后将该转录活性片段连接到荧光报告载体。
6.权利要求4所述的荧光报告载体的应用，其特征在于，利用所述的荧光报告载体筛选治疗哮喘的药物。
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，涉及人PTEN基因的启动子的克隆及应用。本发明提供了PTEN启动子转录活性片段，该转录活性片段包括PTEN启动子的-778至-1390区域，或者-1339至-2141区域。本发明利用建立含有PTEN基因启动子转录活性区的荧光报告载体，对大量单体进行检测，能初步筛选出上调PTEN表达的单体，进而体内实验确认其治疗哮喘的功能，本发明为临床试验打下基础，可用于筛选治疗哮喘的药物。
文档编号C12Q1/68GK102465127SQ20111035565
公开日2012年5月23日 申请日期2011年11月10日 优先权日2010年11月15日
发明者倪振华, 王雄彪, 陈清阁 申请人:上海中医药大学附属普陀医院