专利名称：一种低产尿素的黄酒酵母代谢工程菌及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种低产尿素的黄酒酵母代谢工程菌及其构建方法，属于微生物遗传工程领域。
背景技术：
氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，简称EC)，俗称乌拉坦⑴rethane)，分子式为 NH2COOC2H5(CAS#51-79-6)。动物毒理学试验显示，EC对多个物种(包括小鼠、大鼠、仓鼠、 猴)具有致癌作用，能引起动物肺癌、淋巴癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、皮肤癌等恶性肿瘤的发生，表明EC是人类潜在的致癌物质。1974年，EC被世界卫生组织(WHO)下属的国际癌症研究机构(IARC)划为2组B类可致癌物质；2007年3月，IARC进一步提高了 EC的致癌风险等级，将其划分进2组A类可致癌物质名单。
EC是各种发酵酒精饮料(包括中国黄酒、葡萄酒、日本清酒等)酿造过程中伴随产生的副产物，不少国家尤其是一些欧美发达国家对市场上各酒种中的EC含量制定了严格的限定标准。黄酒是我国特有传统酒种，当前黄酒中EC含量较高的现状已成为严重制约我国黄酒业发展尤其是国际化发展的瓶颈之一，严重阻碍了我国黄酒向国际市场的开拓， 同时在高度重视食品安全的今天，对国内消费者也是一个潜在的威胁。因此，研究出适合我国黄酒企业控制EC含量的策略和方法，降低黄酒中EC含量，使其至少与日本清酒国际标准 (< 100 μ g/L)接轨，对于整个中国黄酒业的发展迫在眉睫，具有重大意义。截至目前，我国尚未针对黄酒、葡萄酒等制定EC限量标准，但国家卫生部近两年已开始关注此问题，相信标准的出台只是时间问题。发明内容
本发明的第一个目的是提供一种低产尿素的黄酒酵母代谢工程菌。
本发明提供的低产尿素的黄酒酵母代谢工程菌，是将脲基酰胺酶基因(DUR1，2) 编码框置于酿酒酵母组成型高表达TPIl转录启动子(TPI1 promoter，简写为TPIlp)和转录终止子(TPI1 terminator，简写为TPIlt)控制之下，通过同源重组将TPIlp_DURl， 2-TPIlt基因盒稳定整合入菌株黄酒酵母菌株基因组中得到的黄酒酵母代谢工程菌。
所述脲基酰胺酶基因(DURlJ)的核苷酸序列的GenBank号为NM_001178556。
酿酒酵母组成型高表达TPIl转录启动子、转录终止子TPIlp来源于大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒p^(212 (Invitrogen)。
所述出发菌株黄酒酵母也称为酿酒酵母，购自CICC(中国工业微生物菌种保藏管理中心)，菌株保藏号为CICC30395。
本发明的第二个目的是提供上述低产尿素的黄酒酵母代谢工程菌的构建方法。
本发明提供的构建上述低产尿素的代谢工程菌的方法，是利用代谢工程手段，将脲基酰胺酶基因(DUR1，2)编码框置于酿酒酵母组成型高表达TPIl转录启动子(TPIlp)和转录终止子(TPIlt)控制之下，再通过两端分别连接一段酪氨酸酶相关蛋白1基因(TRPl)同源臂，构建trpI-TPIIp-DURl，2-TPIlt-trpl同源重组基因盒，随后通过同源重组原理将 TPIIp-DURl，2-TPIIt基因序列整合入出发菌株黄酒酵母基因组的TRPl位点，使DUR1，2基因获得稳定高水平表达。
所述酪氨酸酶相关蛋白1基因核苷酸序列的GenBank号为NM_001180315。
本发明所述代谢工程菌可以使细胞能及时分解由精氨酸酶水解精氨酸产生的过多尿素，强化尿素降解途径，大大减少酵母细胞的尿素分泌量。小试黄酒发酵试验表明， 与出发菌株相比，成功构建的低产尿素黄酒酵母代谢工程菌使发酵液中尿素含量下降至 8. 5mg/L (下降了 3. 3倍)，最终使酒液中的EC含量下降至53. 4 μ g/L (下降了 3. 5倍)。 本发明的黄酒酵母代谢工程菌株具有明显的产尿素水平低的特点，利用其发酵生产的黄酒 EC含量低，且风味基本保持不变。
图1是提取的出发菌株黄酒酵母基因组总DNA电泳图(M =Marker ；1，2，3 黄酒酵母基因组总DNA)。
图 2 是 PCR 扩增 DURl，2 基因电泳图(M :Marker ;1，2 :DUR1，2 基因)。
图3是pTO212-DURl，2重组质粒构建过程示意图。
图4是pYX212-DURl，2重组质粒双酶切鉴定电泳图(M :Marker ;1，2 :EcoR I和 BamH I双酶切重组质粒)。
图5 是 YRp7-trpl-TPIlp-DURl，2-TPIlt-trpl 重组质粒构建过程示意图。
图6是生长在选择培养基平板上转化子的照片。
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、TPIIp-DURl，2-TPIIt基因盒的构建
采用酵母基因组提取试剂盒提取黄酒酵母基因组总DNA(图1)。利用因特网上公开的酿酒酵母(S. cerevisiae)标准菌株基因组序列数据库(http//www. yeastgenome. org/)信息，设计合适的引物和酶切位点(PI :ACTGAGGAATTCATGACAGTTAGTTCCGATACAACTGC TG, EcoR I ；P2 TCAGGAGGATCCTCATGCCAATGTCTCTATGACGGCCACT，BamH I)，以提取的基因组 DNA为模板，PCR扩增获得DURl，2基因编码框序列(图2)，双酶切基因与大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒P^(212 (Invitrogen)后，通过DNA连接反应构建重组质粒pTO212-DURl，2，使 DURl，2的表达置于酿酒酵母组成型高表达启动子TPI Ip及终止子TPI It控制下(图3和4)； 通过在TPIlp&TPIlt头尾设计引物，以上述重组质粒为模板，即可一步扩增出TPIIp-DURI, 2-TPIlt基因盒序列。
实施例2、trpI-TPIIp-DURl，2-TPIlt-trpl 基因盒的构建
设计弓I物(P3 TCAGGACCATGGCATTTAATAGAACAGCATCGT，Nco I ；P4 ACTGAGAAGCTTCTTCTGAATCAAACAAG，Hind III)，从黄酒酵母基因组中克隆获得长度1104bp 的包含编码框及部分上下游序列的TRPl基因片段，通过DNA酶切、连接反应亚克隆入载体 YRp7，构建重组质粒YRp7-trpl。设计引物，利用PCR在TPIIp-DURl，2-TPIIt基因盒两端加入酶切位点EcoR V。同时用EcoR V单酶切YRp7-TRPl和TPIlp-DURl，2-TPIlt，通过DNA连接，最终构建出重组质粒YRp7-(trpl-TPIlp-DURl，2-TPIlt-trpl)(图幻。通过设计头尾引物，以重组质粒为模板进行PCR，即可一步扩增出两端分别带有562bp*M2bp trpl同源臂的 trpI-TPIIp-DURl，2-TPIlt-trpl 基因盒序列。
实施例3、整合有TPIIp-DURl，2-TPIIt基因盒的工程菌株的获得
采用醋酸锂转化法，以线形trpI-TPIIp-DURl，2-TPIlt-trpl基因盒片段与环形质粒pUT332 (含phleomycin抗性基因)为外源DNA，将两者共转化感受态黄酒酵母，然后以选择培养基平板(YPD+100 μ g/mL phleomycin)筛选转化子，菌落PCR鉴定出TPIlp_DURl， 2-TPIlt基因盒成功整合入TRPl基因位点的工程菌株，并通过DNA测序确证整合序列的正确性(图6)。利用非选择培养基(YPD)对酵母工程菌株连续传代培养10代，利用野生型酿酒酵母胞内质粒不稳定易丢失的现象(野生型酿酒酵母连续传代10代后胞内质粒丢失概率 80%)，筛选鉴定出丢失抗性(即丢失质粒pUT33》的工程菌株，并通过设计抗性基因的扩增引物，进行菌落PCR，最终获得不含外源物种DNA、整合有TPI Ip-DURl，2-TPI It基因盒的工程菌株。
实施例4、工程菌株与出发菌株的小型发酵试验比较两者发酵指标、尿素、EC及风味物质含量
利用大米醪培养液(浓度14° Bx)以工程菌株和出发菌株分别进行小试规模黄酒发酵，常规方法考察两者综合发酵性能(包括总失重量、总酸、酒精度、氨基态氮)， 发现两者综合发酵性能基本一致(表1)；利用尿素检测试剂盒检测两者发酵液中尿素的含量，发现工程菌株相较出发菌株下降了 3.3倍(表1)；利用固相微萃取和气质联用 (SPME-GC-MS)法检测两者酒液中EC含量，发现工程菌株相较出发菌株下降了 3. 5倍(表 2)；常规方法考察两者的基本风味物质含量发现基本一致(表幻，表明构建的工程菌株具有明显的低产尿素效果，利用其发酵生产的黄酒EC含量低，且风味基本保持不变，具有实际工业应用潜力。
表1利用出发菌株和工程菌株发酵黄酒时各项发酵指标及发酵液中的尿素浓度
权利要求
1.一种低产尿素的黄酒酵母代谢工程菌，是将脲基酰胺酶基因DUR1，2编码框置于酿酒酵母组成型高表达TPIl转录启动子和TPIl转录终止子控制之下，通过同源重组将 TPIlp-DURl，2-TPIlt基因盒稳定整合入菌株黄酒酵母菌株基因组中得到的黄酒酵母代谢工程菌。
2.如权利要求1所述代谢工程菌，其特征在于，所述黄酒酵母来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 30395。
3.权利要求1所述代谢工程菌的构建方法，其特征在于，将脲基酰胺酶基因DUR1，2编码框置于酿酒酵母组成型高表达TPIl转录启动子和TPIl转录终止子控制之下，再通过两端分别连接一段酪氨酸酶相关蛋白1基因同源臂，构建trpl-TPIlp-DURl，2-TPIlt-trpl同源重组基因盒，随后采用同源重组方法将TPIIp-DURl，2-TPIIt基因序列整合入出发菌株黄酒酵母基因组的TRPl位点。
4.如权利要求3所述方法，其特征在于，所述黄酒酵母为CICC30395。
5.如权利要求3所述方法，其特征在于，所述脲基酰胺酶基因DURl，2与大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒Ρ^(212连接，构建重组质粒pTO212-DURl，2，使DURl，2的表达置于酿酒酵母组成型高表达启动子TPIlp及终止子TPIlt控制下。
6.如权利要求3所述方法，其特征在于，所述trpI-TPIIp-DURl，2-TPIlt-trpl构建方法为1)从黄酒酵母基因组中克隆获得长度1104bp的包含编码框及部分上下游序列的TRPl 基因片段，通过DNA酶切、连接反应亚克隆入载体YRp7，构建重组质粒YRp7-trpl ；2)设计引物，利用PCR在TPIIp-DURl，2-TPIIt基因盒两端加入酶切位点EcoRV，同时用EcoR V单酶切YRp7-TRPl和TPIIp-DURl，2_TPIlt，通过DNA连接，最终构建出重组质粒 YRp7-trpI-TPIIp-DURl，2-TPIlt-trpl ；3)通过设计头尾引物扩增出两端分别带有562bp和M2bptrpl同源臂的 trpI-TPIIp-DURl，2-TPIlt-trpl 基因盒序列。
7.如权利要求3所述方法，其特征在于，同源重组方法为采用醋酸锂转化法，以线形 trpI-TPI Ip-DURl，2-TPI lt_trpl基因盒片段与含phleomycin抗性基因的环形质粒pUT332 为外源DNA，将两者共转化感受态黄酒酵母，然后筛选转化子。
8.权利要求1所述低产尿素的黄酒酵母代谢工程菌应用于发酵生产黄酒。
全文摘要
本发明公开了一种低产尿素的黄酒酵母代谢工程菌及其构建方法，是将脲基酰胺酶基因DUR1，2编码框置于酿酒酵母组成型高表达TPI1转录启动子和TPI1转录终止子控制之下，通过同源重组将TPI1p-DUR1，2-TPI1t基因盒稳定整合入菌株黄酒酵母菌株基因组中得到的黄酒酵母代谢工程菌；本发明的黄酒酵母代谢工程菌株具有明显的产尿素水平低的特点，利用其发酵生产的黄酒EC含量低，且风味基本保持不变，具有广阔的应用前景。
文档编号C12N1/19GK102533573SQ20111035535
公开日2012年7月4日 申请日期2011年11月10日 优先权日2011年11月10日
发明者周景文, 朱旭亚, 管政兵, 陆健, 陈坚 申请人:江南大学