专利名称：镇痛活性肽grr两个突变体及其制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，涉及镇痛活性肽GRR两个突变体及其获得方法与应用，具体地说，本发明涉及镇痛活性肽GRR两个突变体及其衍生物、类似物、活性片段的结构及其制备方法，以及作为镇痛药物在医药领域中的应用。
背景技术：
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在专利一镇痛活性肽GRR及其制备与应用(申请人:沈阳药科大学；发明人:张景海等；专利申请号:201010107462.5 ;申请公布号:CN101880319 A)中并未提及其突变体的及其衍生物的研究，而利用生物技术发现并获得了镇痛活性肽GRR两个突变体及其衍生物、类似物、活性片段是一项较新的技术，目前尚无人研究。发明内容:
本发明的目的是提供镇痛活性肽GRR两个突变体及其衍生物、类似物、活性片段以及其制备与应用。具体是利用生物技术，在镇痛活性肽GRR的基础上筛选获得镇痛活性肽GRR两个突变体及其衍生物、类似物、活性片段；镇痛活性肽GRR两个突变体的镇痛生物活性较镇痛活性肽GRR具有显著提高的发明属性。镇痛活性肽GRR两个突变体及其衍生物、类似物、活性片段获得方法简单易行，可与任何载体混合制备医学上可接受的剂型。本发明是利用生物技术或化学合成技术解决获得方法，获得仍具有镇痛活性的镇痛活性肽GRR两个突变体及其衍生物、类似物、活性片段。本发明是通过如下技术方案实现的，它包括:针对镇痛活性肽GRR的镇痛活性，利用基因工程技术获得一系列镇痛活性肽GRR突变体及其部分片段或衍生物或类似物，通过获得表达产物的实验动物体内镇痛活性，以获得可以进一步开发镇痛类药物的镇痛活性肽GRR突变体及其部分片段或衍生物或类似物。本发明所述的获得方法常规、简单、产量高，不仅具有重要的指导意义和实用价值，也为工业化生产奠定了基础。本发明是针对镇痛活性肽GRR突变体的镇痛活性，利用基因工程技术获得一系列镇痛活性肽GRR突变体部分片段或衍生物或类似物，通过获得表达产物的实验动物体内镇痛活性，以获得可以进一步开发镇痛类药物的镇痛活性肽GRR突变体及其部分片段或衍生物或类似物。本发明提供多种镇痛活性肽GRR突变体及其部分片段或衍生物或类似物的制备方法，它包括:利用基因工程技术进行表达或通过化学合成获得。基因工程技术方法包括:
⑴将镇痛活性肽GRR突变体及其部分片段或衍生物或类似物的编码DNA重组至表达载
体；
⑵用步骤⑴的重组表达载体转化适当的宿主细胞(原核或真核细胞)；
⑶在适合的诱导表达条件下，培养步骤⑵的被转化的宿主细胞；
⑷收获并纯化所得到的表达产物。本发明提供上述镇痛活性肽GRR突变体及其部分片段或衍生物或类似物的表达产物分离纯化方法。 可使用盐析沉淀、超滤、离子交换层析、疏水作用层析和凝胶过滤等方法，从细胞的溶胞产物及培养液中分离并纯化所需的表达产物。在表达产物的分离和纯化过程中，可使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)、酶联免疫吸附法(ELISA)或蛋白免疫印迹法(WESTERN)检测表达产物的存在及相应分子大小。
本发明首次进行上述镇痛活性肽GRR突变体及其部分片段或衍生物或类似物的体内镇痛生物学活性实验。
本发明还提供了上述镇痛活性肽GRR突变体及其部分片段或衍生物或类似物在生物制药领域的应用，具体地说是镇痛生物活性。
本发明的再一个目的是提供含有如上限定的蛋白质及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。可按照制药工业领域已知的基本原则和方法制备适于胃肠道外途径给药的药物组合物(如参见Remington’ s Pharmaceutical Science, 15th.,Mack Publishing Company, 1980)。可通过各种给药途径,特别是静脉内、肌肉内、关节内、腹腔内、鼻内、皮内、皮下等胃肠道外途径投用本发明的药物组合物。
本发明的另一个目的是提供如上限定的蛋白质在生产镇痛药物中的应用。可使用本发明的蛋白或含有该蛋白质的药物组合物作为治疗剂，用于治疗特定类型人体的各种疼痛相关疾病。本发明的药物组合物的治疗有效剂量一般应根据疾病的性质、严重程度及对药物的敏感适应性，以及给药途径等诸多因素由临床医生按照个体化原则来确定。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞，常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。
:图1为镇痛活性肽GRR突变体I氨基酸序列 图2为镇痛活性肽GRR突变体2氨基酸序列 具体实施方式
: 下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。
实施例1: 镇痛活性肽GRR突变体I基因的获得 本实施例描述用于表达获得本发明镇痛活性`肽GRR突变体之一基因的构建策略和基本方法。
根据镇痛活性肽GRR的氨基酸序列及其基因序列，针对第五位氨基酸残基一Y(酪氨酸)，利用常规基因工程技术，以镇痛活性肽GRR基因为出发基因，将其转换为F (苯丙氨酸)，从而获得镇痛活性肽GRR突变体I基因，该基因编码的镇痛活性肽GRR突变体I的结构如下:GRDAFIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。
实施例2: 镇痛活性肽GRR突变体2基因的获得 本实施例的策略、基本方法和基本过程同实施例1。
根据镇痛活性肽GRR的氨基酸序列及其基因序列，针对第四十二位氨基酸残基一Y(酪氨酸)，利用常规基因工程技术，以镇痛活性肽GRR基因为出发基因，将其转换为F (苯丙氨酸)，从而获得镇痛活性肽GRR突变体2基因，该基因编码的镇痛活性肽GRR突变体2的结构如下:GRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKFGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。
实施例3:
镇痛活性肽GRR突变体I及其衍生物、类似物、活性片段的获得
1.镇痛活性肽GRR突变体I及其衍生物、类似物、活性片段基因的构建
本实施例列举描述用于表达本发明镇痛活性肽GRR突变体I基因的构建策略和基本方法。根据镇痛活性肽GRR突变体I (结构参见图1.)的N末端和C末端氨基酸序列，分别设计相应寡核苷酸引物，同时在上述两个寡核苷酸引物的5'端，分别加上各自的限制性核酸内切酶水解位点序列，以便基因重组的实施；以实施例1获得的镇痛活性肽GRR突变体I基因为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测产物并进行核酸片段的凝胶回收；经过上述提及的限制性核酸内切酶双酶切后与同样进行双酶切的质粒在T4 DNA Iigase的作用下进行重组连接，热转化大肠杆菌感受态细胞DH 5 α，经过菌落PCR和限制性核酸内切酶酶切验证筛选获得阳性转化子后提交生物技术服务公司进行DNA序列测定。结果表明，通过上述基因工程的方法成功构建镇痛活性肽GRR突变体I表达重组载体。同理，利用基因工程技术，可以分别获得镇痛活性肽GRR突变体I衍生物、类似物、活性片段基因。2.镇痛活性肽GRR突变体I及其衍生物、类似物、活性片段的获得
利用基因过程技术，将镇痛活性肽GRR突变体I基因重组至大肠杆菌表达质粒中，提取质粒进行测序。该重组表达质粒编码表达产物的结构特征为GRDAFIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRRo将阳性重组质粒热转化大肠杆菌BL21UDE3)，然后从该LB固体平板(含相应筛选抗生素)上挑取单菌落后接种至3 ml LB (含相应抗生素)，于37 °C, 200 r/min振荡过夜培养。按照1%接种量将过夜培养物接种至400 ml含相应抗生素的新鲜LB培养基的三角瓶中，于37 0C, 200 r/min振荡培养至0D600为0.6-0.8，加入终浓度为0.166 mmol/L的诱导物异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，培养4 h。结束发酵，3000 g、4 °C离心20 min，收集菌体。用40 ml裂解缓冲液(0.1 M PBS, 0.15 M NaCl, 50 mM咪唑)重悬菌体，进行超声破碎，超声结束后于12，000g、4 °C离心20 min，得上清液，所得沉淀按照上述步骤重复破碎一次，合并两次上清液，直接上样于0.1 M PBS (pH 8.0)预先平衡好的金属离子螯合层析柱，经过两个不同阶段的PH缓冲液分别充分洗涤5个柱床体积后，使用0.5 M咪唑(pH 9.0)进行洗脱并收获该洗脱液。所得产物经过15% SDS-PAGE验证其纯度。由柱层析色谱图和SDS-PAGE图谱说明，重组蛋白质获得高效表达，达到电泳纯度。上述获得的表达产物，利用化学法在M处断裂肽链，从而获得镇痛活性肽GRR突变体I，结构特征为:GRDAFIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRRo同上原则获得表达产物,其结构特征为:M GRDAFIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRRo3.镇痛活性肽GRR突变体I在酵母中的表达及其纯化
将编码镇痛活性肽GRR突变体I基因用寡核苷酸引物进行扩增，获得插入片断。PCR反应所使用的5'寡核苷酸引物序列含有EcoR V限制性内切酶的酶切位点和镇痛活性肽GRR突变体I的N末端区域氨基酸序列的编码序列，3'端引物序列含有EcoR I限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止密码子和镇痛活性肽GRR突变体I的C末端区域氨基酸序列的编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于酵母表达载体pPIC9K上的限制性内切酶酶切位点(其中EcoR V和SnaB I的内切酶切口为平末端)，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和KarO，一个来自2μ质粒的复制子，一个AOXl启动子，在毕赤酵母中可由甲醇诱导高效表达，一个α -因子的信号肽序列，一个转录终止信号，一个HIS4选择性标记以及整合序列。
用SnaB I和EcoR I消化pPIC9K载体，用EcoR V和EcoR I消化插入片段，随后将插入片段连入PPIC9K载体，连接产物热转化E.coli DH 5 α菌株，在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在含有Amp (ΙΟΟμ g/ml)的LB液体培养基中过夜培养含所需构建物的克隆。抽提质粒，测序验证插入片段正确插入。
取质粒线性化后，电转化入酵母细胞，线性化的重组载体通过与宿主基因组的同源序列发生同源重组产生稳定的酵母转化体。利用G418筛选出高拷贝的整合转化子。将筛选得到的菌株接种于装有25ml MGY、BMG或BMGY培养基的250ml摇瓶中，于28 30°C/250 300转/分培养至0D600 = 2 6 (16 18 h);室温下3000转/分离心5min，收集菌体，用1/5到1/10原培养体积的丽、BMM或BMMY重悬菌体(约10 20ml);将步骤2所得的菌液置于IOOml的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28 30°C /250 300转/分的摇床上继续生长；每24h向培养基中添加100%甲醇至终浓度为0.5 1.0% ;分离样品的上清液 ，用截留分子量为3000Da的超滤膜超滤除去色素，用SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。该体系表达产物结构特征为:GRDAFIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR 。
实施例4: 镇痛活性肽GRR突变体2及其衍生物、类似物、活性片段的获得 本实施例的策略、基本方法和基本过程同实施例3。
在大肠杆菌表达获得的重组镇痛活性肽GRR突变体2结构特征为:MHHHHHHMGRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKFGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRRo 该表达产物，利用化学法在M处断裂肽链，从而获得镇痛活性肽GRR突变体2，结构特征为:GRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKFGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRRo
同上原则获得表达产物,其结构特征为:MGRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKFGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRRo
利用酵母表达获得的表达产物结构特征为:GRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKFGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRRo 实施例5: 镇痛活性肽GRR两个突变体分子中半胱氨酸残基被替换表达产物的获得本实施例获得镇痛活性肽GRR两个突变体分子中半胱氨酸残基被替换表达产物的策略和基本方法，类同实施例1-4的策略和基本方法。
获得的镇痛活性肽GRR突变体I (C12S)突变体表达产物，其结构特征为:镇痛活性肽GRR突变体I的第12位C突变为S。
获得镇痛活性肽GRR突变体I (C16S)突变体表达产物，其结构特征为:镇痛活性肽GRR突变体I的第16位C突变为S。获得镇痛活性肽GRR突变体I (C22S)突变体表达产物，其结构特征为:镇痛活性肽GRR突变体I的第22位C突变为S。获得镇痛活性肽GRR突变体I (C26S)突变体表达产物，其结构特征为:镇痛活性肽GRR突变体I的第26位C突变为S。获得镇痛活性肽GRR突变体I (C36S)突变体表达产物，其结构特征为:镇痛活性肽GRR突变体I的第36位C突变为S。获得镇痛活性肽GRR突变体I (C46S)突变体表达产物，其结构特征为:镇痛活性肽GRR突变体I的第46位C突变为S。获得镇痛活性肽GRR突变体I (C48S)突变体表达产物，其结构特征为:镇痛活性肽GRR突变体I的第48位C突变为S。获得镇痛活性肽GRR突变体I (C63S)突变体表达产物，其结构特征为:镇痛活性肽GRR突变体I的第63位C突变为S。获得镇痛活性肽GRR突变体I (C12S，C63S)突变体表达产物，其结构特征为:痛活性肽GRR突变体I的第12和63位C突变为S。获得镇痛活性肽GRR突变体I (C16S，C36S)突变体表达产物，其结构特征为:痛活性肽GRR突变体I的第16和36位C突变为S。获得镇痛活性肽GRR突变体I (C22S，C46S)突变体表达产物，其结构特征为:痛活性肽GRR突变体I的第22和46位C突变为S`。获得镇痛活性肽GRR突变体I (C26S，C48S)突变体表达产物，其结构特征为:痛活性肽GRR突变体I的第26和48位C突变为S。获得的镇痛活性肽GRR突变体2 (C12S)突变体表达产物，其结构特征为:镇痛活性肽GRR突变体2的第12位C突变为S。获得镇痛活性肽GRR突变体2 (C16S)突变体表达产物，其结构特征为:镇痛活性肽GRR突变体2的第16位C突变为S。获得镇痛活性肽GRR突变体2 (C22S)突变体表达产物，其结构特征为:镇痛活性肽GRR突变体2的第22位C突变为S。获得镇痛活性肽GRR突变体2 (C26S)突变体表达产物，其结构特征为:镇痛活性肽GRR突变体2的第26位C突变为S。获得镇痛活性肽GRR突变体2 (C36S)突变体表达产物，其结构特征为:镇痛活性肽GRR突变体2的第36位C突变为S。获得镇痛活性肽GRR突变体2 (C46S)突变体表达产物，其结构特征为:镇痛活性肽GRR突变体2的第46位C突变为S。获得镇痛活性肽GRR突变体2 (C48S)突变体表达产物，其结构特征为:镇痛活性肽GRR突变体2的第48位C突变为S。获得镇痛活性肽GRR突变体2 (C63S)突变体表达产物，其结构特征为:镇痛活性肽GRR突变体2的第63位C突变为S。获得镇痛活性肽GRR突变体2(C12S，C63S)突变体表达产物，其结构特征为:痛活性肽GRR突变体2的第12和63位C突变为S。
获得镇痛活性肽GRR突变体2(C16S，C36S)突变体表达产物，其结构特征为:痛活性肽GRR突变体2的第16和36位C突变为S。
获得镇痛活性肽GRR突变体2 (C22S，C46S)突变体表达产物，其结构特征为:痛活性肽GRR突变体2的第22和46位C突变为S。
获得镇痛活性肽GRR突变体2 (C26S，C48S)突变体表达产物，其结构特征为:痛活性肽GRR突变体2的第26和48位C突变为S。
实施例6: 体内镇痛活性一小鼠醋酸扭体法 本实施例通过小鼠体内镇痛模型确定镇痛活性肽GRR突变体的体内生物活性-镇痛活性。此外也旨在验证镇痛活性肽GRR突变体衍生物、类似物、活性片段的镇痛活性。蛋白浓度采用Lowry方法进行测定。
小鼠醋酸扭体法镇痛模型:将冰醋酸作为化学刺激物注入昆明种小鼠腹腔内，继而引起深部的、大面积而较持久的疼痛刺激，致使小鼠产生“扭体”反应(腹部内凹、躯干与后腿伸张、臀部高起)。
18-22 g昆明种小鼠，雌雄各半，随机分组，每组8只，尾静脉注射样品，20 min后按0.2 ml/20 g腹腔注射0.6% (v/v)醋酸引起内脏痛,5 min后记录小鼠10 min内的扭体次数。以吗啡为阳性对照，生理盐水为空白对照，按照下述公式计算各个给药组的扭体反应抑制率。
权利要求
1.镇痛活性肽GRR两个突变体，其特征在于，它们具有如下氨基酸序列: GRDAFIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGA DSGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR ；GRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKFGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRRo
2.根据权利要求1所述的镇痛活性肽GRR两个突变体，其特征在于，所述的突变体是针对镇痛活性肽GRR的第五位、第四十二位氨基酸残基分别进行突变获得的。
3.根据权利要求1所述的镇痛活性肽GRR两个突变体，其特征在于，所述的镇痛活性肽GRR两个突变体的镇痛活性保守性氨基酸残基包括所述的镇痛活性肽GRR两个突变体的N-末端第12位、第16位、第22位、第26位、第36位、第46位、第48位和第63位这八个半胱氨酸残基。
4.镇痛活性肽GRR两个突变 体的衍生物或类似物或活性片段，其特征在于，它包含权利要求1-3任何一项所述的氨基酸序列全序或片段。
5.如权利要求1所述的镇痛活性肽GRR两个突变体或权利要求4所述的镇痛活性肽GRR两个突变体的衍生物或类似物或活性片段的制备方法，可以利用基因工程技术进行表达获得，其特征在于，表达宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于: ⑴将镇痛活性肽GRR突变体及其部分片段或衍生物或类似物的编码DNA重组至表达载体； ⑵用步骤⑴的重组表达载体转化适当的宿主细胞； ⑶在适合的诱导表达条件下，培养步骤⑵的被转化的宿主细胞； ⑷收获并纯化所得到的表达产物。
7.如权利要求1所述的镇痛活性肽GRR两个突变体或权利要求4所述的镇痛活性肽GRR两个突变本的衍生物或类似物或活性片段的制备方法，可以利用化学合成技术获得，其特征在于，化学合成为人工合成或合成仪合成。
8.镇痛活性肽GRR两个突变体及其衍生物或类似物或活性片段在制备镇痛药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于:所述的镇痛活性肽GRR两个突变体及其衍生物或类似物或活性片段可以与药学上可接受的载体混合制备临床上可接受的注射剂、口服制剂、透皮吸收制剂、粘膜吸收制剂。
全文摘要
本发明涉及生物医药技术领域，涉及利用基因工程技术获得镇痛活性肽GRR两个突变体、镇痛活性肽GRR两个突变体衍生物、类似物、活性片段的结构及其制备方法和镇痛活性肽GRR两个突变体及其衍生物、类似物、活性片段作为镇痛药物在医药领域中的应用。所述的镇痛活性肽GRR两个突变体氨基酸序列如下GRDAFIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。和GRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKFGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。所述的镇痛活性肽GRR两个突变体及其衍生物或类似物或活性片段可以与药学上可接受的载体混合制备临床上可接受的注射剂、口服制剂、透皮吸收制剂、粘膜吸收制剂等用于各类痛症。本发明所述的镇痛活性肽GRR两个突变体具有较好的镇痛活性，其获得方法常规、简单、产量高。
文档编号C12N15/63GK103102403SQ20111035439
公开日2013年5月15日 申请日期2011年11月10日 优先权日2011年11月10日
发明者张景海, 邓理, 崔勇, 赵勇山, 宋永波, 赵明沂, 刘岩峰, 张嵘, 吴春福 申请人:沈阳药科大学