专利名称：对土壤中禾谷多粘菌进行检测的方法
技术领域：
本发明涉及农作物病害传播菌的分子诊断技术，属于生物技术领域。
背景技术：
禾谷多粘菌、PolyWxa ^raffii/ ^)是一种禾本科植物根部专性弱寄生低等原生生物，属于鞭毛菌亚门多粘菌属。在世界上的许多国家都有分布。目前的研究表明该菌自身不会对植物造成明显的危害，但是却可以作为至少11种病毒的载体，这些病毒可以引起小麦、大麦、燕麦、水稻等多种作物在内的多种病毒病。禾谷多粘菌传播的病毒常见的有大麦黄花叶病毒(Barley yellow mosaic virus, BYMV，Plumb)、大麦和性花叶病毒(Barley mild mosaic virus，BMMV，)、小麦梭条花叶病毒(Wheat spindle streak mosaic virus,WSSMV)、小麦土传花叶病毒(Soil-borne wheat mosaic virus, SBWMV )等，这些病毒可造成植株分蘖减少、生长受阻、产量及质量下降，给世界粮食生产带来了极大的危害。如在美国的北部、中部和东北部地区由WSSMY的侵染可导致小麦减产对-64%。在加拿大安大略省，WSSMV引起的小麦减产可达3-59%。在我国由 WYMV —般可造成小麦减产20-30%，重病田减产可达50-70%，危害巨大。在我国，禾谷多粘菌主要分布在冬麦区，以长江中下游冬麦区、黄淮冬麦区及西南冬麦区的部分地区为主。其主要传播的病害有大麦黄花叶病毒病、小麦黄花叶病毒病及小麦土传病毒病等。因此研究此类菌在土壤中的数量动态变化对于防治各种麦类作物病害具有重要的意义。传统的病原微生物鉴定都是以染色、培养及生化鉴定等为主，鉴定的周期比较长。 同时许多病原菌对培养基的营养、抗生素的种类及培养条件等的要求较高，给病原菌的快速、准确鉴定带来了很多困难。禾谷多粘菌不能用培养基培养；其厚壁休眠孢子散布于土壤中，存活能够十多年；在病土中禾谷多粘菌的孢子数量非常巨大，将病土稀释15625倍的情况下，仍然能够有效的侵染小麦；这些都造成禾谷多粘菌的研究非常困难，急需一种简单快速的检测技术。PCR技术具有灵敏度高、特异性好、周期短等特点，对不能分离培养的病原菌检测尤其有优势。目前已成为病原菌快速鉴定的一种主要方法。荧光定量PCR是在PCR定性检测基础上发展起来的核酸定量技术，通过在PCR体系中加入荧光染料或荧光探针，在PCR过程中随产物的增加荧光信号实时积累，通过制作标准曲线可实现对未知样本中初始模板量进行定量。近年来PCR及荧光定量PCR技术在其他植物病原菌的鉴定中已经较为广泛的应用，而PCR用于禾谷多粘菌的研究还较少。所见的报道为Ward E等(Ward Ε, Kanyuka K, Motteram J, Kornyukhin D, Adams M J. The use of conventional and quantitative real-time PCR assays for Polymyxa graminis to examine host plant resistance, inoculum levels and intraspecific variation. New Phytologist, 2005, 165(3): 875-885)设计合成了一对特异性引物用于禾谷多粘菌的检测及定量，其设计的引物扩增片段大小为430bp，而荧光定量是利用一条探针，其检测禾谷多粘菌的方法相对于利用荧光染料的检测方法而言需要合成特异性探针、价格昂贵，且PCR片段相对偏长，不适合大量样品的荧光定量检测。
发明内容
本发明的目的在于根据上述研究领域的不足，提供禾谷多粘菌的PCR方法检测方法及快速荧光定量方法。该方法通过设计一对针对禾谷多粘菌的特异性引物，对待测样本进行检测及初始模板定量。检测的特异性好、灵敏度高、实用性强。本发明的目的是这样实现的一种对土壤中禾谷多粘菌进行检测的方法，其特征在于，在NCBI中筛选出多个禾谷多粘菌核糖体rDNA序列，在它们相对于其他菌的rDNA保守区域设计一对特异性引物SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2，通过上游引物SEQ ID No. 1和下游引物SEQ ID No. 2对土壤样本进行PCR扩增，由扩增产物判断土壤中禾谷多粘菌的存在状况。本发明的一种PCR 反应体系为10 X PCR Buffer 2.5 μ , dNTP 2 mM 2.5 μ , 上游引物 10 MM 1.0 μ ，下游引物 10 μΜ 1.0 μ , DNA 1.0 μL, aq DNA polymerase 5 υ/μι 0. 2 μ , ddH20 16. 8 μ ，终体积为 25μ ；PCR 扩增程序为94°C预变性 5 min ； 94°C 变性30 s，55°C退火30 s，72°C延伸30 s，共进行；35个循环；最后72°C延伸8 min。在这种PCR反应体系中，所述的由扩增产物判断土壤中禾谷多粘菌的存在状况是指对扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后将琼脂糖凝胶进行EB染色，在紫外灯下观察，是否存在大小为300bp的DNA条带，由此判断土壤中是否含有禾谷多粘菌。对大小为300bp的DNA条带的特异性片段进行凝胶回收后，进行克隆转化，其测序结果与禾谷多粘菌序列AJ841287的同源性为100%，其测序结果与禾谷多粘菌序列 AJ841287的同源性为100%。本发明的另一种PCR反应体系为2XMaster Mix 10 μ ，上游引物10 μΜ 0.5 PL，下游引物 10 μΜ 0.5 μ , DNA 1.0 μ ，ddH20 8 μ ，终体积为 20μ ;PCR扩增程序为 94°C预变性5 min，94°C变性10 s，55°C退火10 s，72°C延伸20 s，共进行40个循环。在这种PCR反应体系中，所述的由扩增产物判断土壤中禾谷多粘菌的存在状况是指由荧光定量PCR仪根据荧光信号的变化及标准曲线直接测出土壤中禾谷多粘菌实际含量。所述的荧光定量PCR仪可以采用Mratagene公司或ABI公司或Eppendorf公司或BioRad公司或Corbett公司生产的荧光定量PCR仪。本发明的优点在于本发明利用一对合成的特异性引物对土壤样本进行PCR 扩增，通过扩增产物对土壤样本中的禾谷多粘菌进行检测及定量，避免了传统研究中检测禾谷多粘菌的过程繁琐、复杂，且不易计数的缺点。其检测方法方便、快速、特异性好、灵敏度高、实用性强，并且可以同时进行多样本的检测。对于农业生产中相关麦类病害的诊断具有一定的应用价值。
图1为特异性引物SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2扩增土壤DNA的结果。其中，M泳道，DL2000分子量标准；1泳道，麦田土壤DNA ；2泳道，非麦田土壤DNA ；3泳道，阴性对照。图2为引物的特异性扩增检测结果。其中，M泳道，DL2000分子量标准；1泳道，阴性对照；2泳道，质粒；3泳道，禾谷镰刀菌；4泳道，雪腐镰刀菌；5泳道，尖孢镰刀菌6泳道，禾谷丝核菌；7泳道，立枯丝核菌；8 泳道，麦田土壤DNA。图3为荧光定量PCR的扩增动态曲线图。图4为荧光定量PCR的标准曲线图。图5为荧光定量PCR的熔解曲线图。图6为小麦主要生育期内小麦根际土壤中禾谷多粘菌的扩增情况。
具体实施例方式下面通过具体实施方式
的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是本发明的限制，仅仅作示例说明。实施例1
特异性引物的设计、合成
在NCBI中筛选出多个禾谷多粘菌核糖体DNA (rDNA)序列，通过序列分析，在其相对于其他菌的rDNA保守区域设计一对特异性引物SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2 正向引物SEQ ID No. 1 5- CTGCGGAAGGATCATTAGCGTTG -3 反向引物SEQ ID No. 2 5- CCGATACTCAGAGAGGCATGCT -3 引物委托上海生工生物工程公司合成。实施例2
建立禾谷多粘菌扩增的PCR体系与条件特异性引物对由实施例1提供
采用 UltraClean soil DNA Isolation Kit (Mo Bio，USA)提取麦田小麦根际土及非麦田土总DNA，每份土样为0. 5g鲜重，提取的总DNA溶于50 μ ddH20中。PCR反应体系为10 X PCR Buffer 2.5 μ , dNTP 2 mM 2. 5 μ ，正向引物 10 μΜ) 1.0 μ ，反向引物 10 μΜ I. O μι, DNA 1.0 μι, Taq DNA polymerase 5 U/μ 0.2 PL，ddH20 16.8 μ ，终体积为25μ 。PCR扩增程序为94°C预变性5 min ； 94°C变性30 s，55°C退火 30 s，72°C延伸30 s，共进行35个循环；最后72°C延伸8 min。将PCR产物进行电泳分析， 电压110V，30分钟后在紫外灯光下进行产物观察，结果(图1)显示，可以扩增出单一条带， 片段的大小在300bp左右。将特异性片段进行凝胶回收后，进行克隆转化，将获得的阳性克隆交由上海英俊生物技术有限公司进行测序分析。测序结果为SEQ ID No. 3
CTGCGGAAGG ATCATTAGCG TTGAATTGGT CTTGGTGCCA TGCGAAMAC ATGTGGATTG 60 TGGGCTATGT GACCCCTCTG TGGGGGGTAT TTTGTCGCGA ACTCGGGAGA ATTGGCTAAT
120
GGAATCATAA AGATAAACAA AATACAACTC TTAGCAATAG ATATCTTGGT TCCCGCAACG180
ATGAAGAACG CAGCGAAATG CGATACGTAA TGCGAATTGC AGAATTCAGT GAATCATCGA
240
ATCTTTGAAC GCAAGTTGCG CTTTCGAGAG CCCTCGGAAG CATGCCTCTC TGAGTATCGG
300
该序列与 Ward E 等(Ward Ε, Kanyuka K, Motteram J, Kornyukhin D, Adams M J. The use of conventional and quantitative real-time PCR assays for Polymyxa graminis to examine host plant resistance, inoculum levels and intraspecific variation. New Phytologist, 2005, 165(3) : 875-885)获得的禾谷多粘菌序列 (AJ841287)的同源性为100%。说明获得的序列正确。实施例3 引物的特异性检测
选择5种土壤中常见的病原真菌禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、雪腐镰刀菌(Fusarium fliKa/e)、尖抱 廉刀菌 ifusariumaxysporum)、无谷电极鬼{Rhizoctonia cerealis)及立枯丝核菌(J^izoctonia soIani)进行引物的验证，提取这几种菌纯培养物的总DNA为模板，以构建的质粒DNA[由实施例2获得的大小在300bp左右特异性片段进行琼脂糖凝胶回收后连接PMD-19T载体(TaKaRa，大连)，克隆转化后获得]及小麦根际土壤 DNA为阳性对照，参照实施例2条件进行PCR扩增。结果显示，只有在质粒及土壤中DNA有扩增产物，几种菌都没有相应的扩增产物。结果说明引物的特异性很好，可以用于禾谷多粘菌的特异性分析。实施例4
荧光定量PCR体系的建立及检测限分析特异性引物对由实施例1提供
(1)用于标准曲线的质粒DNA的制作过程利用Ultra Clean soil DNA Isolation Kit试剂盒(Mo Bio，美国)对小麦根际土壤进行DNA提取，利用上述特异性引物及PCR扩增条件进行扩增，获得300bp的产物，将产物进行琼脂糖凝胶回收后连接PMD-19T载体 (TaKaRa，大连)，克隆筛选后进行测序分析，测序结果(SEQ ID No. 3)显示与GenBank中多个禾谷多粘菌的序列100%同源，说明所获得序列正确，阳性质粒可用于质粒标准品的制作。(2)质粒标准品的制作与扩增条件选取序列正确的阳性克隆提取质粒，按下述公式计算质粒拷贝数
质粒拷贝数(copy/μ ) =质粒浓度(g/μ ) X6. 023X 1023 (copyM)/MW (g/mol)(其中MW=(克隆载体长度+目的片段长度)(bp) X324X2g/ (mol bp)。取构建好的质粒进行IO7-IO1c0PyAa系列梯度稀释，以稀释好的质粒为模板，进行荧光定量PCR分析，同时设置阴性对照。20 μ 反应体系2XMaster Mix 10 μ , ddH20 8 μ ，正向引物 10 Mmol/L 0.5 μ ，反向引物 10 Mmol/L 0.5 μ , DNA 1.0 μ 。PCR 反应条件为94°C预变性5 min，94°C变性10 s，55°C退火10 s，72°C延伸20 s，共进行40个循环。反应在Rotor Gene 6000仪器(Corbett，Australia)上进行，标准曲线、扩增曲线及熔解曲线由仪器自动生成。结果显示扩增动力学曲线(图3)呈S型曲线。标准曲线显示(图4)，质粒拷贝数在IO7-IO1c0PyAi范围内，Ct值与质粒拷贝数呈现良好的线性关系，直线回归方程的相关系数R2为0. 99597，引物的扩增效率为0. 96。从熔解曲线(图5)可以看出扩增产物单一， Tm值非常均一，引物的特异性好。结果显示荧光定量PCR的检测限为IO1c0PyAa模板(图 3)。实施例5
冬小麦主要生育期根际土壤中禾谷多粘菌生长动态分析采用实施例4的荧光定量PCR体系
荧光定量PCR仪采用Corbett公司(Australia)生产的Rotor Gene 6000荧光定量PCR 进行。分别于冬小麦生长的返青期、孕穗期、扬花期、灌浆期及成熟期在相同地点采集小麦根际土壤，提取DNA，利用实施例1提供的特异引物对采用实施例4的扩增体系进行扩增， 结果记录在图6中，根据标准曲线计算即可获得土壤样本中初始禾谷多粘菌的含菌量。结果显示在小麦生长的主要生育期内，土壤中的禾谷多粘菌数量呈现先上升后下降的趋势， 在小麦扬花期土壤中禾谷多粘菌的数量最多。
权利要求
1.一种对土壤中禾谷多粘菌进行检测的方法，其特征在于，在NCBI中筛选出多个禾谷多粘菌核糖体rDNA序列，在它们相对于其他菌的rDNA保守区域设计一对特异性引物SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2，通过上游引物SEQ ID No. 1和下游引物SEQ ID No. 2对土壤样本进行PCR扩增，由扩增产物判断土壤中禾谷多粘菌的存在状况。
2.根据权利要求1所述的对土壤中禾谷多粘菌进行检测的方法，其特征在于，PCR反应体系为10 X PCR Buffer 2.5 μ , dNTP 2 mM 2.5 μ ，上游引物 10 μΜ 1.0 μ ，下游引物 10 μΜ 1.0 μ , DNA 1.0 μ , Taq DNA polymerase 5 U/μ 0.2 μ , ddH20 16. 8 PL，终体积为25μ ；PCR扩增程序为94°C预变性5 min ； 94°C变性30 s，55°C退火30 s， 72°C延伸30 s，共进行35个循环；最后72°C延伸8 min。
3.根据权利要求1或2所述的对土壤中禾谷多粘菌进行检测的方法，其特征在于，所述的由扩增产物判断土壤中禾谷多粘菌的存在状况是指对扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后将琼脂糖凝胶进行EB染色，在紫外灯下观察，是否存在大小为300bp的 DNA条带，由此判断土壤中是否含有禾谷多粘菌。
4.根据权利要求3所述的对土壤中禾谷多粘菌进行检测的方法，其特征在于，对大小为300bp的DNA条带的特异性片段进行凝胶回收后，进行克隆转化，其测序结果与禾谷多粘菌序列AJ841287的同源性为100%。
5.根据权利要求1所述的对土壤中禾谷多粘菌进行检测的方法，其特征在于，所述PCR 反应体系为2XMaster Mix 10 μ ，上游引物10 MM 0.5 μ ，下游引物10 μΜ 0.5 μ , DNA 1.0 μ , ddH20 8 μ ，终体积为20μ ;PCR扩增程序为94°C预变性5 min ;94°C变性 10 s，55°C退火10 s，72°C延伸20 s，共进行40个循环。
6.根据权利要求1或5所述的对土壤中禾谷多粘菌进行检测的方法，其特征在于，所述的由扩增产物判断土壤中禾谷多粘菌的存在状况是指由荧光定量PCR仪根据荧光信号的变化及标准曲线直接测出土壤中禾谷多粘菌实际含量。
7.根据权利要求5所述的对土壤中禾谷多粘菌进行检测的方法，其特征在于，所述的荧光定量PCR仪为Stratagene公司或ABI公司或Eppendorf公司或BioRad公司或Corbett 公司生产的荧光定量PCR仪。
全文摘要
本发明涉及一种对土壤中禾谷多粘菌进行检测的方法，其特征在于，在NCBI中筛选出多个禾谷多粘菌核糖体rDNA序列，在它们相对于其他菌的rDNA保守区域设计一对特异性引物SEQIDNo.1和SEQIDNo.2，通过上游引物SEQIDNo.1和下游引物SEQIDNo.2对土壤样本进行PCR扩增，由扩增产物判断土壤中禾谷多粘菌的存在状况。
文档编号C12Q1/04GK102424835SQ201110353970
公开日2012年4月25日 申请日期2011年11月10日 优先权日2011年11月10日
发明者史建荣, 吴季荣, 徐剑宏, 林凡云, 祭芳 申请人:江苏省农业科学院