专利名称：一种降血压菜籽肽及制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物活性肽的制备技术领域。
背景技术：
油菜是我国重要的油料作物之一，菜籽饼粕中所含的菜籽蛋白是一种非常优良的蛋白质和巨大的植物蛋白资源。清蛋白和谷蛋白为华杂3号菜籽饼粕中的主要分离蛋白， 分别占总分离蛋白的36. 8%和31.6%。其它依次为谷蛋白1%)和醇溶蛋白0.5%)。 氨基酸检测表明菜籽分离蛋白氨基酸含量丰富且平衡，必需氨基酸含量接近50%，而且富含赖氨酸和蛋氨酸等限制性氨基酸。由于所选用的饼粕为低温冷扎原料，在加工过程中蛋白未受热变性，因而保持了蛋白固有特性，可广泛应用于食品、饮料中。随着蛋白质生物化学、生理学与营养学的发展，人们发现，人类摄食蛋白质经消化道酶作用后，更多的是以低肽形式吸收，某些低肽不仅能提供人体生长、发育所需的营养物质，且同时具有防病治病、调节人体生理机能的功效，有些是原食品蛋白质或其组成氨基酸所没有的独特的生理机能。加强对低聚肽的研究与开发，并使之工业化，对有效利用我国的植物蛋白资源，提高人民的营养水平，具有重大的社会意义和良好的经济效益。碱性蛋白酶Alcalase (丹麦NOVO公司)是一种非特异性蛋白质肽键内切酶，来源丰富，酶解能力强，但由于酶反应的专一性，单一酶作用范围小，因此水解时水解度不高，所得多肽分子量较大。而且菜籽蛋白经酶水解后其疏水性氨基酸残基暴露出来，得到的菜籽多肽带有明显的苦味，后期要进行繁琐的脱苦过程，能耗高，成本高，严重阻碍了多肽的推广应用。Flavourzyme复合风味酶(丹麦NOVO公司)是一种内切酶和外切酶的混合酶，可以有效地将疏水性氨基酸从脯氨酸末端切除，降低菜籽多肽的苦味，水解过程水解液PH变化很小，水解度也有较大提高，但是单一使用Flavourzyme水解时，作用力弱，水解度较低。
发明内容
本发明目的是提供一种降血压菜籽肽。本发明的第二个目的是提供一种过程简单，能耗低的降血压菜籽肽的制备方法。本发明的第三个目的是提供一种降血压菜籽肽在制备降血压保健品中的应用。本发明的技术方案概述如下一种降血压菜籽肽的制备方法，包括下述步骤(1)将脱脂后的菜籽饼粕与水按质量比为1 8-15的比例混合，用NaOH水溶液调 pH = 8. 3，搅拌提取 0. 5-1. 5h，3500r/min-5000r/min 离心 15min_25min，沉淀再按固液质量比为1 3-7的比例提取2-3次，合并上清液，以HCl水溶液调pH= 5.0沉淀蛋白，分离出上清液，将上清液再次用HCl水溶液调pH = 3. 7进行二次沉淀蛋白，弃上清液，合并两次沉淀，用去离子水洗涤沉淀2-3次，以NaOH水溶液调pH = 7. 0，搅拌使沉淀复溶，冷冻干燥即为菜籽清蛋白；(2)将所述菜籽清蛋白溶解于蒸馏水中制成质量浓度为3-5%的菜籽清蛋白水溶
3液；按Alcalase酶与菜籽清蛋白的比例为0. 3-0. 4AU/g，将Alcalase酶放入所述菜籽清蛋白水溶液中，在pH = 8. 0，反应温度为45-55 °C的条件下，水解50_70min ；按Flavourzyme酶与菜籽清蛋白的比例为50LAPU/g，再加入Flavourzyme酶，在pH = 7. 0，反应温度为50°C的条件下，水解90-120min ；将酶解液加热至沸腾，灭酶lOmin，冷却后离心取上清液冷冻干燥即得降血压菜籽肽粉末。上述方法制备的一种降血压菜籽肽。上述一种降血压菜籽肽在制备降血压保健品中的应用。本发明的优点在于利用二次等电点进行蛋白提取，可以提高提取率；同时通过复合酶分步水解，Alcalase能够有效地水解菜籽清蛋白，Flavourzyme能有效的将疏水性氨基酸从菜籽肽端基切除，有效提高水解度，并降低菜籽肽的苦味，同时获得低分子量肽较丰富的具有降血压活性的菜籽肽。而且具有分离条件温和、流程简单及能耗较低等优点，易于实现工业化生产。
图1为Alcalase水解度的响应面分析图。图2分步水解中加入Flavourzyme后水解度变化。图3Alcalase和Flavourzyme双酶水解物的苦味变化。
具体实施例方式本发明的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，并不能对本发明作任何限制。下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例1一种降血压菜籽肽的制备方法，包括下述步骤(1)将脱脂后的菜籽饼粕与水按质量比为1 10的比例混合，用NaOH水溶液调 pH = 8. 3，搅拌提取lh，4000r/min离心20min，沉淀再按固液质量比为1 5的比例提取2 次，合并上清液，以HCl水溶液调pH = 5. 0沉淀蛋白，分离出上清液，将上清液再次用HCl水溶液调pH = 3. 7进行二次沉淀蛋白，弃上清液，合并两次沉淀，用去离子水洗涤沉淀3次， 以NaOH水溶液调pH = 7. 0，搅拌使沉淀复溶，冷冻干燥24h即为菜籽清蛋白；(2)将所述菜籽清蛋白溶解于蒸馏水中制成质量浓度为4. 87%的菜籽清蛋白水溶液；按Alcalase酶与菜籽清蛋白的比例为0. 38AU/g，将Alcalase酶放入所述菜籽清蛋白水溶液中，在PH = 8. 0，反应温度50°C的条件下，水解70分钟；将酶解液分为2份，将第一份酶解液加热至沸腾，灭酶lOmin，冷却后离心取上清液冷冻干燥获得菜籽肽粉末，此时测得的菜籽清蛋白的水解度为14. 72%，苦味值为3，对ACE抑制作用为42. 68%。将第二份酶解液按Flavourzyme酶与菜籽清蛋白的比例为50LAPU/g，加入Flavourzyme酶，在pH = 7. 0，反应温度50°C，的条件下，水解100分钟；将酶解液加热至沸腾，灭酶lOmin，冷却后离心取上清液冷冻干燥即得降血压菜籽肽粉末，此时测得的菜籽清蛋白的水解度为观％，苦味值为1，对ACE抑制作用为69. 13%。降血压菜籽肽对ACE抑制作用
通过对ACE (血管紧张素转换酶)活性抑制来评价降血压菜籽肽的降血压生物活性将7周龄雄性SHR(自发性高血压大鼠)用乙醚麻醉后，心脏采血，4°C 3000r/min离心 IOmin,取上清即为ACE粗提液。取150 μ L ACE粗提液和100 μ L菜籽肽溶液添加到100 μ L 基质溶液(基质Hip-Gly-Gly)中，充分振荡混合，37°C培养Ih后，用0. 25mL IN的HCl终止反应，加入1. 5mL醋酸乙酯，用力混合15s，1750r/min离心5min后取出1. 5mL酯层转入另一个试管中，真空蒸发干固，加3mL lmol/LNaCl溶解，测吸光值S。按上述方法用蒸馏水代替菜籽肽测得的吸光值为A，用蒸馏水代替ACE粗提液测得的吸光值为B。则ACE抑制作用(％) = [(S-B)/A]X100o实施例2一种降血压菜籽肽的制备方法，包括下述步骤(1)将脱脂后的菜籽饼粕与水按质量比为1 8的比例混合，用NaOH水溶液调pH =8. 3，搅拌提取1. 5h,5000r/min离心15min，沉淀再按固液质量比为1 3的比例提取3 次，合并上清液，以HCl水溶液调pH = 5. 0沉淀蛋白，分离出上清液，将上清液再次用HCl水溶液调pH = 3. 7进行二次沉淀蛋白，弃上清液，合并两次沉淀，用去离子水洗涤沉淀2次， 以NaOH水溶液调pH = 7. 0，搅拌使沉淀复溶，冷冻干燥Mh即为菜籽清蛋白；(2)将所述菜籽清蛋白溶解于蒸馏水中制成质量浓度为3%的菜籽清蛋白水溶液；按Alcalase酶与菜籽清蛋白的比例为0. 4AU/gdfAlcalase酶放入所述菜籽清蛋白水溶液中，在pH = 8. 0，反应温度45°C的条件下，水解60分钟；按Flavourzyme酶与菜籽清蛋白的比例为50LAPU/g,加入Flavourzyme酶，在pH = 7. 0，反应温度50°C，的条件下，水解 100分钟；将酶解液加热至沸腾，灭酶lOmin，冷却后离心取上清液冷冻干燥即得降血压菜籽肽粉末。此时测得菜籽清蛋白的水解度为27. 2%，苦味值为1，对ACE抑制作用为67. 52%。实施例3一种降血压菜籽肽的制备方法，包括下述步骤(1)将脱脂后的菜籽饼粕与水按质量比为1 15的比例混合，用NaOH水溶液调 pH = 8. 3，搅拌提取0. 5h,3500r/min离心25min，沉淀再按固液质量比为1 7的比例提取2次，合并上清液，以HCl水溶液调pH = 5. 0沉淀蛋白，分离出上清液，将上清液再次用 HCl水溶液调pH = 3. 7进行二次沉淀蛋白，弃上清液，合并两次沉淀，用去离子水洗涤沉淀 3次，以NaOH水溶液调pH = 7. 0，搅拌使沉淀复溶，冷冻干燥24h即为菜籽清蛋白；(2)将所述菜籽清蛋白溶解于蒸馏水中制成质量浓度为5%的菜籽清蛋白水溶液；按Alcalase酶与菜籽清蛋白的比例为0. 3AU/gdfAlcalase酶放入所述菜籽清蛋白水溶液中，在pH = 8. 0，反应温度55°C的条件下，水解50分钟；按Flavourzyme酶与菜籽清蛋白的比例为50LAPU/g,加入Flavourzyme酶，在pH = 7. 0，反应温度50°C，的条件下，水解 90分钟；将酶解液加热至沸腾，灭酶lOmin，冷却后离心取上清液冷冻干燥即得降血压菜籽肽粉末。此时测得菜籽清蛋白的水解度为27. 8%，苦味值为1，对ACE抑制作用为68. 65%。Alcalase酶酶解条件的确定以温度、Alcalase酶用量和底物浓度三个因素为自变量，以水解度为响应值， 设计三因素三水平的响应面分析实验。建立回归模型，得出在菜籽清蛋白溶液浓度为4. 87%, Alcalase酶与菜籽清蛋白的比例为0. 38AU/g，反应温度为50°C的条件下，水解度为14. 72%。见图1。分步水解中加入Flavourzyme后水解度变化酶解蛋白质的水解度测定采用pH-stat法。结果显示，加入Flavourzyme后水解度有明显提高，在加入Flavourzyme反应60 分钟时，水解度达到27. 2%，之后，水解度增幅减缓。见图2。Alcalase和Flavourzyme双酶水解物的苦味变化Alcalase单酶水解进行60分钟是，酶解液的苦味值达到最大值3，此时加入 Flavourzyme继续酶解，在Flavourzyme加入后水解至90-120分钟(即双酶解150-180分钟时)的时间内，水解物苦味值降低为1，此时苦味很淡，其后随着水解度增加，苦味不再有所变化。见图3。
权利要求
1.一种降血压菜籽肽的制备方法，其特征包括下述步骤(1)将脱脂后的菜籽饼粕与水按质量比为1 8-15的比例混合，用NaOH水溶液调PH =8. 3，搅拌提取0. 5-1. 5h，3500r/min-5000r/min离心15min_25min，沉淀再按固液质量比为1 3-7的比例提取2-3次，合并上清液，以HCl水溶液调pH = 5.0沉淀蛋白，分离出上清液，将上清液再次用HCl水溶液调pH = 3. 7进行二次沉淀蛋白，弃上清液，合并两次沉淀，用去离子水洗涤沉淀2-3次，以NaOH水溶液调pH = 7. 0，搅拌使沉淀复溶，冷冻干燥即为菜籽清蛋白；(2)将所述菜籽清蛋白溶解于蒸馏水中制成质量浓度为3-5%的菜籽清蛋白水溶液； 按Alcalase酶与菜籽清蛋白的比例为0. 3-0. 4AU/g，将Alcalase酶放入所述菜籽清蛋白水溶液中，在PH = 8. 0，反应温度为45-55°C的条件下，水解50_70min ；按Flavourzyme酶与菜籽清蛋白的比例为50LAPU/g，再加入Flavourzyme酶，在pH = 7. 0，反应温度为50°C的条件下，水解90-120min ；将酶解液加热至沸腾，灭酶lOmin，冷却后离心取上清液冷冻干燥即得降血压菜籽肽粉末。
2.权利要求1的方法制备的一种降血压菜籽肽。
3.权利要求2的一种降血压菜籽肽在制备降血压保健品中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种降血压菜籽肽及制备方法及用途，制备方法为(1)将脱脂后的菜籽饼粕与水混合，调pH，提取，离心，沉淀，再提取，合并上清液，调pH沉淀蛋白，分离出上清液，将上清液再次调pH进行二次沉淀蛋白，弃上清，合并沉淀，用去离子水洗涤沉淀，调pH，搅拌使沉淀复溶，冷冻干燥即为菜籽清蛋白；(2)将菜籽清蛋白溶解于蒸馏水中；加入Alcalase酶水解，再加入Flavourzyme酶水解，灭酶，冷却后离心取上清液冷冻干燥即得降血压菜籽肽粉末。本发明优点利用双酶水解，有效提高水解度，并降低菜籽肽的苦味，同时获得低分子量肽较丰富的具有降血压活性的菜籽肽。而且条件温和、流程简单、能耗低，易于工业化生产。
文档编号A23J3/34GK102389020SQ201110353998
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月9日 优先权日2011年11月9日
发明者周凤娟, 寇晓虹, 汪一帆, 薛照辉, 高捷 申请人:天津大学