专利名称：建鲤促性腺激素释放激素基因六聚体原核表达载体及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种高效表达建鲤促性腺激素(&1RH) 的原核表达载体及其在&iRH蛋白的原核表达和制备抗&iRH多克隆抗体中的应用。
背景技术：
促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone, GnRH)前体蛋白由信号肽、GnRH十肽(decap印tide)、促性腺激素释放激素相关肽(GnRHassociated peptide, GAP)构成，经酶切加工后释放出有活性的&iRH十肽。&iRH在调节脊椎动物的生殖发育中起着非常重要的作用，是下丘脑-垂体性腺(hypothalamic-pituitary-gonadal，HPG)轴的关键信息分子，通过刺激垂体前叶释放促性腺激素(Gonadotropin，GtH)，在脊椎动物的性腺发育、繁殖功能的维持中起着重要的作用。关于&iRH的免疫原理，目前还没有确切说法。Meloen和Ook等文章中有所论述，认为是血液中的&iRH抗体特异性地中和了动物体内的&iRH，导致体内&iRH生物活性部分或完全丧失，引起内分泌系统平衡的改变，从而改变了 HPG轴系，减少或杜绝精子(或卵子)的生成与成熟及激素的合成与释放。临床上用免疫接种技术控制&iRH的释放量来控制哺乳动物的性腺发育已经取得了成功，并表现出诱人的前景。Andersen与Riley等研究了抗虹鳟GnRH的免疫接种，提出了一种有望控制鱼类性成熟的方法，认为免疫抑制技术在控制虹鳟生殖方面有一定的应用潜力。建鲤、Cyprinus carpiovar Jian)是鲤亚科鲤属的一种。为长体型，比野鲤背高、 体宽，但比常见的杂交鲤体长，具有生长速度快、适合多种养殖方式饲养、抗病力强等优点。建鲤是以特定的荷包红鲤和沅江鲤为亲本，经6代定向自繁自育而形成的良种，因此对性腺发育具有调节作用的&iRH研究具有一定的生产意义。人源&iRH已经通过基因工程手段获得了体外表达并在动物实验中获得了较好的免疫原性。高效表达&iRH基因的重组载体的制备可以高效获取重组蛋白可以满足其在鱼类人工繁殖中的运用，同时制备的抗体在现有研究中还未见有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种&iRH六聚体的原核表达载体pMAL-GnRH，该载体含有T7启动子和终止子、细菌核糖体结合位点RBS和六聚体&iRH基因、GAP基因及一个麦芽糖结合蛋白标签，利用该载体转化大肠杆菌，可实现&iRH蛋白的高水平表达，表达的重组蛋白质以可溶性形式存在于上清中(占大肠杆菌可溶性总蛋白45. 2%%)，通过亲和层析纯化很容易获得高纯度的重组蛋白质，用于蛋白质的制备。纯化&iRH蛋白的操作相当简单，成本也不高，极易重复使用。为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案
建鲤促性腺激素释放激素基因六聚体原核表达载体，其特征在于所述的原核表达载体由表达载体pMAL-c^^Q建而得，该载体含有T7启动子和终止子、细菌核糖体结合位点PBS、 6个串联多聚体&iRH基因序列与一个GAP基因序列、及一个麦芽糖结合蛋白标签序列。进一步说明所述的建鲤促性腺激素释放激素基因六聚体原核表达载体，其特征在于所述6个串联多聚体&1RH基因的上游依次连接有麦芽糖结合蛋白标签序列、起始密码子、T7启动子ATG、细菌核糖体结合位点RBS、T7启动子；6个串联多聚体&iRH基因的下游依次连接有GAP基因序列、可被IPTG诱导的操作子序列、终止子。所述的建鲤促性腺激素释放激素基因六聚体原核表达载体的构建方法，其特征在于由下述方法构建而得
(1)从GeneBank中查找建鲤GnRH的全长基因序列，并采用I^rimerS.0设计了一对特异性引物
上游引物 1 5' -ACTGAGGGAAACTTGGACTGAT-3 ‘ 下游引物 2 5，-CAAGGCAGAAATAGAAAGGAAG-3 ‘ 反转录随机引物AP;
以提取自建鲤的丘脑总RNA为模板，进行反转录合成第一链cDNA，以反转录产物为模板及上述的上下游引物进行PCR扩增，反应条件为94°C预变性:3min，94°C预变性30s， 55°C退火 45s，72°C延伸 lmin，30 个循环，72°C延伸 7min ；
(2)PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后用凝胶回收试剂盒回收，将回收产物与 PMD18-T载体，16°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌JM109，随机挑取细菌，提取质粒后用I、Λ /7 /ΙΙΙ双酶切初步鉴定后，将阳性克隆进行DNA测序，测序结果用生物软件 DNAstar、CLUSTAL X 等进行分析；
(3)合成六聚体&iRH基因并与GAP基因相连接，并在其两端加上I,Hindlll酶切位点，将其和原核表达质粒PMAL-C2X分别用I ,Hindlll 37°C双酶切，用凝胶回收试剂盒回收&1RH/GAP片段和线性化pMAL质粒，按照T4 DNA连接酶的说明书设计连接反应体系，构建表达质粒pMAL-GnRH/GAP，并转化大肠杆菌JM109，筛选阳性克隆，随机挑取1_2 个克隆进行酶切鉴定，获得建鲤促性腺激素释放激素基因六聚体原核表达载体PMAL-GnRH/ GAP。建鲤促性腺激素释放激素基因六聚体原核表达载体在制备重组&1RH蛋白中的应用。建鲤促性腺激素释放激素基因六聚体原核表达载体在制备&1RH抗体的抗原中的应用。建鲤促性腺激素释放激素基因六聚体原核表达载体制备&1RH重组蛋白的方法， 将pMAL-GnRH/GAP转化大肠杆菌TB1，挑取阳性克隆接种含50 μ g/mL的氨苄青霉素的LB 液体培养基中，37°C摇振培养过夜，取培养菌液以1/10的比例接种于新鲜的LB液体培养基(含氨苄青霉素)中，分别以0. 5、lmol/L浓度的IPTG诱导，37°C摇振培养4h后， 收集菌体，加入溶菌酶至终浓度为lmg/mL，冰浴30min ；最后加入DNA酶和RNA酶至终浓度为5μ g/mL，4°C孵育10 min,9000g离心30 min,将上清转移备用，上清即为表达的融合蛋白；将上清蛋白质上样于平衡缓冲液平衡好的Amylose-sepharose亲和柱中其中所述平衡缓冲液为 20mmol/L Tris-HCL, 200mmol/LNaCl, lmmol/LEDTA, pH7 · 4，用缓冲液平衡至基线后，开始用洗脱缓冲液，所述的洗脱缓冲液为平衡缓冲液+lOmmol/L麦芽糖中洗脱，洗脱液中即为纯化后的融合蛋白，最后SDS-PAGE电泳检测。在纯化好的蛋白中加入 Factor Xa至终浓度为200 μ g/mL，室温作用4h，同上过Amylose- sepharose亲和柱，用平衡缓冲液洗脱下的即为&iRH重组蛋白。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果1、构建的建鲤六聚体&1RH基因的原核表达载体能高效的表达目的蛋白，并满足相关实验的需要。2、用重组蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗血清具有较高的效价，该抗体能特异性的与建鲤&iRH蛋白反应，具有较高的效价，特异性也较好。3、本发明中&iRH蛋白高效价抗体的成功制备表明6聚体&iRH具有较强的免疫原性，能够刺激机体产生免疫应答，为&iRH调控鱼类性生殖的研究提供了一个新的方法。
图IGnRH基因的TA克隆策略； 图2&iRH原核表达载体的构建策略；
图 3 建鲤 GnRH 基因的检测，M: DNAmarker ； 1: Product of RT-PCR ； 图4重组质粒pMD18-T-GnRH的限制性酶切分析M:DNA分子量标记1 :pMD18-T_GnRH 经EcoRI和Hind III双酶切；
图5鉴定大肠杆菌中&1RH/GAP融合蛋白的SDS-PAGE分析M:蛋白质分子量标记；1 TBl/pMAL-GnRH/GAP 分别经 0. 3M IPTG 诱导 4h 后表达的 MBP-GnRH/GAP 蛋白；2 TBl/pMAL 分别经0. 3M IPTG诱导4h后产生的MBP蛋白；3: E. coli TBI。
具体实施例方式
仪器与设备
试剂主要为分子生物学试剂，TaqDNA聚合酶、T4 DNA连接酶、AMV反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、I ,Hind III,大肠杆菌JM109，pMD18_T载体，反转录随机引物AP ；
原核表达质粒pMAL-ch为大连宝生物公司产品，聚丙烯酰胺、RNase抑制剂等购自上海生工生物工程公司，Factor Xa、Amylose-s印harose柱、抗麦芽糖结合蛋白(MBP)单抗均购自纽英伦生物技术(北京)公司，其他生化试剂均为国产分析纯。弗氏完全、不完全佐剂，ELISA反应板等均购自上海申能博彩生物有限公司。仪器PCR仪购自BioRad公司，实验结果记录和蛋白分析使用的是柯达公司的凝胶成像系统，DNA序列分析使用DNAstar软件，全自动测序工作由上海生工生物工程公司完成。酶标测定仪购自TECAN公司。所有引物和DNA序列均在上海生工合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1 :GnRH基因的扩增与TA克隆
GnRH基因的扩增及TA克隆的策略如图1所示，首先从GenBanK中查找&iRH的全长基因序列(GenBanK号AY148223)，采用ft~imer5. O设计了一对特异性引物 引物 1 5，-ACTGAGGGAAACTTGGACTGAT-3 ‘，见 kqNO. 2 ； 引物 2 5，-CAAGGCAGAAATAGAAAGGAAG-3 ‘，见 kqNO. 3 ；
采用RNA抽提试剂盒提取建鲤(取自淡水渔业研究中心实验鱼场)丘脑总RNA进行纯度鉴定后合成第一链cDNA，以反转录产物为模板及合成的上下游引物进行PCR扩增，反应条件为94°C预变性3 min，94°C预变性30s，55°C退火45s，72°C延伸lmin，30个循环，72°C延伸5 min0 PCR产物的克隆与鉴定PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后用凝胶回收试剂盒回收，将回收产物与PMD18-T载体连接过夜，连接产物转化大肠杆菌JM109，随机挑取细菌，提取质粒后用&oR I、历^i/III双酶切初步鉴定后，将阳性克隆送交上海生工进行DNA测序。测序结果用DNAstar、CLUSTAL X等软件进行分析。实验结果表明扩增到了预期大小即约400bp的目的cDNA片段见kqNO. 1 (图3)，将其进行BLAST检索，进行同源性比对，结果表明其同源性为97.6%。实施例2 原核表达载体PMAL-GnRH的构建
在获得正确的&iRH序列后到生物公司合成串联六聚体&iRH与GAP序列，将其和原核表达质粒pMAL-ch分别用I ,Hind III 37°C双酶切，用凝胶回收试剂盒回收GnRH片段(包含串联六聚体&iRH与GAP序列)和线性化pMAL质粒，按照T4 DNA连接酶的说明书设计连接反应体系，构建表达质粒pMAL- GnRH (图2)，并转化大肠杆菌JM109，筛选阳性克隆，随机挑取10个克隆提取质粒，提取的质粒经I和历‘/^ III双酶切鉴定，酶切结果表明pMAL-GnRH酶切后有一条约400 bp的条带(图4)，说明GnRH/GAP成功克隆入T 载体中，将重组质粒PMAL-GnRH送测序公司测序，测序结果表明成功的将&iRH cDNA克隆到表达载体中。实施例3 重组GnRH蛋白的表达与鉴定
将pMAL-GnRH转化大肠杆菌TB1，挑取阳性克隆接种含50 μ g/mL的氨苄青霉素的LB 液体培养基中，37°C摇振培养过夜，取培养菌液以1/10的比例接种于新鲜的含氨苄青霉素的LB液体培养基中，分别以0. 5、1 mol/L浓度的IPTG诱导，37°C摇振培养4h后，收集菌体，重悬于100 μ L SDS-PAGE上样缓冲液中，离心后加上样缓冲液煮沸破碎细胞，参照《分子克隆》及试剂手册进行1 浓度的SDS-PAGE电泳(图5)鉴定蛋白的表达量。由图 5可知，加入IPTG诱导后，转入载体pMAL的细菌总蛋白提取物中出现了分子量约为42kD 的蛋白条带(图5泳道2中)，而转入重组质粒的细菌总蛋白提取物中出现了新的蛋白质， 分子量约为55. 5kD (图5泳道1中)。由于pMAL表达质粒本身可编码42. 5kD的麦芽糖结合蛋白(Maltosebinding protein, MBP),而GnRH及相关肽分子量约为13. 5 kD,理论上融合蛋白的分子量约*^.5kD。这与预期结果相一致，重组表达载体经IPTG诱导后，融合蛋白得到表达，而大肠杆菌TBl没有相应的蛋白表达。目的蛋白表达量经软件分析，约达到了细菌表达蛋白总量的45.2%。以抗MBP蛋白的抗血清进行的Western blot试验表明在大小为55. 5kD和42kD可见两条清楚的蛋白条带。实施例4 重组&iRH蛋白的大量表达与纯化
取过夜培养的10 mL细菌于IL LB (含葡萄糖)中，37°C摇振培养3h，加入IPTG至终浓度为0. 5mmol/L再继续培养浊，4000g离心20min收集菌体，重悬于50mL柱缓冲液中。 加入溶菌酶至终浓度为lmg/mL，冰浴30min。最后加入DNA酶和RNA酶至终浓度为5 μ g/ mL, 4°C孵育10 min。9000g离心30min，将上清转移备用，上清即为表达的融合蛋白。将上清蛋白质上样于平衡缓冲液 OOmmol/LTris-HCL, 200mmol/LNaCl, lmmol/LEDTA, ρΗ7 ·4) 平衡好的Amylose-sepharose亲和柱中，用缓冲液平衡至基线后，开始用洗脱缓冲液(平衡缓冲液+lOmmol/L麦芽糖中)洗脱，洗脱液中即为纯化后的融合蛋白，最后SDS-PAGE 电泳检测。在纯化好的蛋白中加入factor )(a至终浓度为200 μ g/mL，室温作用4h，同上过Amylose-s印harose亲和柱，用平衡缓冲液洗脱下的即为GnRH蛋白。同样作SDS-PAGE电泳检测。检测结果表明纯化蛋白为单一条带，分子量为55. 5kD左右，相对于未融合蛋白MBP的分子量明显偏大。取纯化好的蛋白经lector X酶切4h后，经SDS-PAGE电泳检测，目的蛋白为两个条带即分子量为42kD的为MBP，分子量为13.5kD的&iRH蛋白。再经 Amylose sepharose过柱后，得到纯化的GnRH蛋白。实施例5:对ICR小鼠免疫原性试验结果
(1)疫苗准备与免疫程序取重组菌37°C培养、纯化后，与完全弗氏佐剂以1: 1的比例混合均勻，免疫15只小鼠，每只小鼠腹腔注射SOyg纯化蛋白进行免疫，初免后小鼠每间隔2周以与初免相同的剂量加强免疫4次。每次免疫后1周尾静脉采血，制备血清。 同时以生理盐水腹腔注射10只小鼠为空白对照。最后大量取血制备抗血清。(2)间接ELISA检测GnRH血清抗体通过间接ELISA方法测定GnRH特异的血清抗体效价=ELISA按常规方法进行。将纯化的重组蛋白4°C过夜包被，PBST (含0. 02% Tween-20的PBS)洗涤3次后，用含10%FCS的PBS加满各孔4°C封闭Mh，PBST洗涤3次。 样品血清作倍比稀释(IOOyL/孔)，同时设立阴性对照(1 :100稀释的免疫前小鼠血清) 和空白对照(PBS)，37°C水浴孵育2h，PBST洗涤3次，每孔加入100 μ L 1 25000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG酶标二抗，37°C水浴孵育2h，PBST洗涤3次，每孔加入100 μ L OPD 底物进行，测定0D490值，以Ρ/Ν (待检样品0D490/阴性样品0D490)彡2. 1判为阳性。(3)初免1周后，免疫组小鼠的血清中就能检测到重组蛋白诱导产生的特异抗体，在加强免疫后第6周抗体滴度为1.763士0.015，达到峰值，而空白对照组不能产生特异抗体，且免疫组与空白组抗体效价值差异显著(Ρ<0.05)。通过上述的实验，本发明达到了如下的结果利用本发明的原核表达栽体 pMAL-GnRH。该载体是含有建鲤促性腺激素释放激素的原核表达载体。本发明采用RT-PCR 方法从丘脑中扩增出长约400bp的目的序列&iRH基因，克隆至T载体中，经酶切鉴定和序列测定分析确认序列的正确性后以此片段为模板人工合成六聚体&iRH及GAP，并克隆到表达载体pMAL-c2x中构建重组表达质粒pMAL-GnRH，并在大肠杆菌TBI中获得了高表达，目的蛋白约占菌体总蛋白的45.2%。菌体经溶菌酶裂解，制备无细胞抽提液，Amylose-s印harose柱层析后得到分子量为55.5kD单一条带的目的蛋白。目的蛋白经!^actoriCa酶切裂解，Amylose-s印harose过柱纯化后得到纯化的GnRH前体蛋白。以 80 μ g/只的剂量4次免疫ICR小鼠，免疫小鼠可以检测到特异性针对&iRH前体蛋白的血清抗体应答，免疫组抗体水平显著高于空白组(p<0.(^)，且加强免疫第6周后抗体效价为 1.763士0.015，达到高峰值，说明表达产物具有免疫原性，可以刺激机体产生免疫应答。
权利要求
1.建鲤促性腺激素释放激素基因六聚体原核表达载体，其特征在于所述的原核表达载体由表达载体PMAL-Wx构建而得，该载体含有T7启动子和终止子、细菌核糖体结合位点 PBS、6个串联多聚体&iRH基因序列与一个GAP基因序列、及一个麦芽糖结合蛋白标签序列。
2.如权利要求1所述的建鲤促性腺激素释放激素基因六聚体原核表达载体，其特征在于所述6个串联多聚体&iRH基因的上游依次连接有麦芽糖结合蛋白标签序列、起始密码子、T7启动子ATG、细菌核糖体结合位点RBS、T7启动子；6个串联多聚体&iRH基因的下游依次连接有GAP基因序列、可被IPTG诱导的操作子序列、终止子。
3.如权利要求1所述的建鲤促性腺激素释放激素基因六聚体原核表达载体的构建方法，其特征在于由下述方法构建而得(1)从GeneBank中查找建鲤GnRH的全长基因序列，并采用ft~imer5.0设计了一对特异性引物上游引物 1 5' -ACTGAGGGAAACTTGGACTGAT-3‘下游引物引物 2 5' -CAAGGCAGAAATAGAAAGGAAG-3 ‘以提取自建鲤的丘脑总RNA为模板，进行反转录合成第一链cDNA，以反转录产物为模板及上述的上下游引物进行PCR扩增，反应条件为94°C预变性:3min，94°C预变性30s， 55°C退火 45s，72°C延伸 lmin，30 个循环，72°C延伸 7min ；(2)PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后用凝胶回收试剂盒回收，将回收产物与 PMD18-T载体，16°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌JM109，随机挑取细菌，提取质粒后用I、Λ /7 /ΙΙΙ双酶切初步鉴定后，将阳性克隆进行DNA测序，测序结果用生物软件 DNAstar、CLUSTAL X 等进行分析；(3)合成六聚体&iRH基因并与GAP基因相连接，并在其两端加上I,Hindlll酶切位点，将其和原核表达质粒PMAL-C2X分别用I ,Hindlll 37°C双酶切，用凝胶回收试剂盒回收&1RH/GAP片段和线性化pMAL质粒，按照T4 DNA连接酶的说明书设计连接反应体系，构建表达质粒pMAL-GnRH/GAP，并转化大肠杆菌JM109，筛选阳性克隆，随机挑取1_2 个克隆进行酶切鉴定，获得建鲤促性腺激素释放激素基因六聚体原核表达载体PMAL-GnRH/ GAP。
4.建鲤促性腺激素释放激素基因六聚体原核表达载体在制备重组&iRH蛋白中的应用。
5.建鲤促性腺激素释放激素基因六聚体原核表达载体在制备&iRH抗体的抗原中的应用。
6.根据权利要求4建鲤促性腺激素释放激素基因六聚体原核表达载体制备&iRH重组蛋白的方法，将pMAL-GnRH/GAP转化大肠杆菌TB1，挑取阳性克隆接种含50 μ g/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C摇振培养过夜，取培养菌液以1/10的比例接种于新鲜的 LB液体培养基(含氨苄青霉素)中，分别以0.5、lmol/L浓度的IPTG诱导，37°C摇振培养4h后，收集菌体，加入溶菌酶至终浓度为lmg/mL，冰浴30min ；最后加入DNA酶和RNA 酶至终浓度为5μ g/mL，4°C孵育10 min，9000g离心30 min,将上清转移备用，上清即为表达的融合蛋白；将上清蛋白质上样于平衡缓冲液平衡好的Amylose-s印harose亲和柱中其中所述平衡缓冲液为 20mmol/LTris-HCL, 200mmol/LNaCl, lmmol/LEDTA, ρΗ7 ·4,用缓冲液平衡至基线后，开始用洗脱缓冲液，所述的洗脱缓冲液为平衡缓冲液+lOmmol/L麦芽糖中洗脱，洗脱液中即为纯化后的融合蛋白，最后SDS-PAGE电泳检测；在纯化好的蛋白中加入Factor Xa至终浓度为200 μ g/mL,室温作用4h，同上过Amylose- s印harose亲和柱，用平衡缓冲液洗脱下的即为&iRH重组蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种高效表达多聚体促性腺激素释放激素的原核表达载体pMAL-GnRH。本发明采用RT-PCR方法从建鲤丘脑中扩增出长约400bp的目的序列GnRH基因，克隆至T载体中，经酶切鉴定和序列测定分析确认序列的正确性后通过人工合成GnRH串联六聚体并与GAP蛋白偶联后将此片段克隆到表达载体pMAL-c2x中构建重组表达质粒pMAL-GnRH；表达产物具有免疫原性，可以刺激机体产生免疫应答。
文档编号C12N15/66GK102382854SQ20111035341
公开日2012年3月21日 申请日期2011年11月10日 优先权日2011年11月10日
发明者丁炜东, 曹丽萍, 曹哲明, 邴旭文 申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心