专利名称：一种金黄色葡萄球菌耐甲氧西林菌株pcr检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种金黄色葡萄球菌耐甲氧西林菌株PCR 检测试剂盒。
背景技术：
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA，简称金葡)是医学上重要的致病菌，其分布广泛，感染类型多样，耐药率高，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(meticillin resistant staphylococcus aureus,MRSA)的感染呈多重耐药，病死率较高，已成为临床抗感染治疗的难点。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至严重到败血症、脓毒症等全身感染。目前临床应用的金黄色葡萄球菌的检测方法有常规涂片镜检法、培养法、免疫学测定、仪器自动化分析鉴定系统等方法，但是这些方法都存在一定的缺陷常规涂片镜检是是最基本的细菌学检查方法，但是敏感性低，特异性差；培养法是目前临床上发现传染源的主要途径和手段，是金黄色葡萄球菌诊断和治疗方案的重要依据，目前仍然以培养法为“金标准”，但是非常耗时，不能实现快速的目的；免疫学测定方法对培养基的含盐量有很高的要求，若含盐量比较高，那么蛋白的合成会受到抑制，而出现假阴性；另外，粗糙型的葡萄球菌和酵母菌偶尔也可引起非特异反应，同时某些含有血浆蛋白结合因子的链球菌和其它个别菌类(例如肠杆菌属的部分菌群)可以非特异地使乳胶颗粒凝集，而出现假阳性。仪器自动化分析鉴定系统，近年来，相关的革兰氏阳性球菌快速鉴定系统不断面市，如Biolog微生物自动分析系统、API 20C、ATB 32C、VITEK YBC和API Candid系统等， 但这些快速鉴定系统大多数是应用于临床革兰氏阳性球菌的鉴定。目前临床应用的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测方法有纸片扩散法(K-B 法)、肉汤(琼脂)稀释(MIC)法、浓度梯度(E-test)法、自动化药敏检测等检测方法。纸片扩散法(K-B法)平皿中MH琼脂厚度为4mm，菌液调至0. 5麦氏浊度，涂沫于上述平板，甲氧西林含量5 μ g/片，35°C孵育Μι，抑菌图彡Ilmm为耐药，^ 17mm为敏感，为了提高灵敏度和特异度，美国临床实验室标准化委员会(CLSI)推荐用苯唑西林代替甲氧西林来检测MRSA。K-B 法的最大优点是快速、简便、价格便宜，易被检验人员接受，但易造成漏检的情况。有研究表明，以mecA基因检测法为参考方法时，纸片扩散法的符合率为88. 2%，这可能是与受培养环境中各因素影响，一些菌株的耐药性得不到完全表达有关。肉汤(琼脂)稀释(MIC)法美国疾病控制中心(⑶C)推荐用MH肉汤(或琼脂)培养液加NaCl至20g/L浓度， 同时加入一定量的Ca、Mg离子，将苯唑西林进行倍比稀释，菌浓度为104个/mL，35°C孵育 24h,MIC < 2 μ g/mL为敏感，>4μ g/mL为耐药，该法检出率可达95%，重复性好，但操作较繁琐。浓度梯度(E-test)法E-test法是由AB Biodisk公司于1988年推出，具体操作是在含20g/L NaCl的 MH琼脂平板上，贴上苯唑西林的试条，菌液调至0. 5 1麦氏浊度，35°C孵育Mh，直接读取 MIC值。为敏感，为耐药。E-test法结合了纸片扩散法和肉汤稀释法的优点，在检测低水平或中等程度耐药的MRSA时结果更为准确。E-test法具有精确、 可靠、稳定性好的特点，但价格昂贵。自动化药敏检测目前市场上有Vitek系统、ATB系统、Micrc^can系统、Sensiter ARIS等自动化药敏检测产品。基本原理是将菌液稀释后注入药敏板或孔内，然后通过检测菌液浊度、荧光指示剂的荧光强度或荧光底物的水解反应来判读结果。其优点是较快速，但有时对生长缓慢或延迟表达耐药性的MRSA，在3 4h内难以达到准确的检测水平，容易漏检或误报MRSA。另外，在上世纪80年代末，国外就有人用聚合酶链反应(PCR)来检测PBP2ci的 mecA基因。随着PCR技术尤其是荧光标记技术的发展，MRSA的检测目前也多采用更为精确的荧光PCR方法，检测目的基因主要是mecA基因，常用方法如分子信标、TaqMan探针、染料法等。但值得注意的是，mecA基因在所有耐甲氧西林葡萄球菌属中都存在，且特异和保守， 所以检测mecA基因结果为阳性的菌株和样本未必可确定为MRSA。针对MRSA特异性的ΡΒΡ2α蛋白，制备特异性单克隆抗体，利用抗原抗体反应建立乳胶凝集实验的方法，国外早在20世纪90年代初就有研究报道。目前，临床MRSA检测和确诊的产品除了经典的纸片法，乳胶凝集快速检测产品也是较常用的方法，英国Oxoid公司、 美国生物梅里埃公司和日本Denka kiken公司的MRSA检测产品均属于此类试剂。乳胶凝集试剂使用方便、检测快速，但受到PBP2 α蛋白表达量的影响，可能出现假阴性的结果。
发明内容
本发明目的是采用聚合酶链式反应及分子信标荧光探针技术对金黄色葡萄球菌基因中高保守特异性核酸序列进行扩增检测，同时对耐药核酸序列(mecA基因)进行扩增检测，从而判断是否为金黄色葡萄球菌的耐甲氧西林菌株，适用于可疑金黄色葡萄球菌感染者临床标本中金黄色葡萄球菌及其耐甲氧西林菌株的快速检测。本发明的技术方案为提供一种金黄色葡萄球菌耐甲氧西林菌株PCR检测试剂盒， 包括PCR反应液A和PCR反应液B，所述PCR反应液A包括IOXbuffer缓冲液、dNTP、Mg离子、引物A和荧光探针A ； 所述引物分为上游引物A和下游引物A ；所述上游引物A的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；所述下游引物A的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；所述荧光探针A的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 3 所示；所述PCR反应液B包括IOXbuffer缓冲液、dNTP、Mg离子、引物B和荧光探针B ； 所述引物分为上游引物B和下游引物B;所述上游引物B的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示；所述下游引物B的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示；所述荧光探针B的核苷酸序列如 SEQ ID N0. 6 所示。优选的，所述试剂盒还包括tap酶、UNG酶、阳性对照、阴性对照。
优选的，所述试剂盒入了一个人工构建的neo内参照系统用于避免检测结果假阴性，所述内参照系统包括上游引物核苷酸序列SEQ ID NO. 7 ；下游引物核苷酸序列SEQ ID NO. 8 ；探针核苷酸序列=SEQ ID NO. 9。优选的，所述荧光探针A的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ淬灭基团。优选的，所述荧光探针B的5’端标记TEX荧光基团，3’端标记BHQ淬灭基团。本发明的另一技术方案为提供一种金黄色葡萄球菌耐甲氧西林菌株PCR检测方法，包括以下步骤a、对金黄色葡萄球菌基因中高保守特异性核酸序列nuc基因进行PCR核酸扩增检测；所述nuc基因进行PCR核酸扩增检测的上游引物A的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示； 下游引物A的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；荧光探针A的核苷酸序列如SEQ ID N0. 3 所示；判断不存在nuc基因则菌株不是金黄色葡萄球菌，判断存在nuc基因则进行步骤b检测；b、对金黄色葡萄球菌的耐药核酸序列mecA基因进行PCR核酸扩增检测，从而判断是否为金黄色葡萄球菌的耐甲氧西林菌株；所述mecA基因基因进行PCR核酸扩增检测的上游引物B的核苷酸序列如SEQ ID N0. 4所示；下游引物B的核苷酸序列如SEQ ID N0. 5所示；荧光探针B的核苷酸序列如SEQ ID N0. 6所示。本发明的有益效果为利用金黄色葡萄球菌基因中高保守特异性核酸序列进行PCR 扩增检测，从而判断金黄色葡萄球菌的存在。同时对耐药核酸序列(mecA基因)进行扩增检测，从而判断是否为金黄色葡萄球菌的耐甲氧西林菌株，适用于可疑金黄色葡萄球菌感染者临床标本中金黄色葡萄球菌及其耐甲氧西林菌株的快速检测，具有灵敏度和特异性高、 稳定、及时、操作方便等优点。使用了大肠杆菌新霉素基因作为内参照基因，它在金黄色葡萄球菌基因组和人类基因组中均无同源基因，因此可作为内参照以检测每次PCR反应中是否有PCR抑制物存在，从而确保PCR结果的可信性。
图1 :nUC基因灵敏度检测结果图；图2 :mecA基因灵敏度检测结果图；图3 :mecA基因特异性结果图；图4 :nuc基因特异性结果图。
具体实施例方式本发明采用聚合酶链式反应(PCR)及分子信标荧光探针(MoleculA. r beacon)技术对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus, SA，简称金葡)基因中高保守特异性核酸序列(nuc基因如SEQ ID NO. 10所示)进行扩增检测，从而判断金黄色葡萄球菌的存在。 同时对耐药核酸序列(mecA基因如SEQ ID NO. 11所示)进行扩增检测，从而判断是否为金黄色葡萄球菌的而押氧西林菌株(meticillin resistant staphylococcus aureus,MRSA) 适用于可疑金黄色葡萄球菌感染者临床标本中金黄色葡萄球菌及其耐甲氧西林菌株的快速检测和金黄色葡萄球菌感染的辅助诊断。本发明应用荧光PCR技术检测金黄色葡萄球菌及其耐甲氧西林菌株的试剂盒，即通过检测临床采集的标本中是否存在金黄色葡萄球菌及其耐甲氧西林菌株，从而指导临床医生对金黄色葡萄球菌及其耐甲氧西林菌株感染的病人用药，帮助预后判断。目的基因nuc的检测因为nuc基因是金黄色葡萄球菌特有的耐热核酸酶基因，所以对nuc基因的检测可以区分金黄色葡萄球菌(SA)和凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)的。但由于金葡和凝固酶阴性葡萄球菌均有耐甲氧西林的菌株(MRSA和MRCoNS)存在，因此需在确认为金葡感染的基础之上，才对其耐药性进行检测。耐药基因mecA的检测MRSA的耐药机制非常复杂，目前研究证实，主要机制是其染色体上的mecA基因编码产生一种特殊的青霉素结合蛋白PBP2a，它与β _内酰胺类抗生素的亲和力低，而正常的PBI^s与β -内酰胺类抗生素的亲和力高。当高浓度抗生素存在时， 正常PBI^s因与抗生素结合而失去催化细菌细胞壁粘肽交联的功能。此时，PBPh却可替代正常PBI^s的功能，继续催化细菌细胞壁粘肽交联，从而使细菌表现出对甲氧西林等β -内酰胺类抗生素的耐药性了。由于mecA基因是金葡耐药性的决定性基因结构，因此通过检测它即可对甲氧西林耐药性进行筛查。所述nuc基因序列如SEQ ID NO. 10所示，所述mecA基因序列如SEQ ID NO. 11所不。内参照原理试剂盒设置了内参照neo基因，即大肠杆菌新霉素基因。它在金葡基因组和人类基因组中均无同源基因，因此可作为内参照以检测每次PCR反应中是否有PCR 抑制物存在，从而确保PCR结果的可信性。当内参照结果为阳时，表示PCR反应体系以及操作正常；因此当目的基因nuc结果为阴时，内参照结果为阳就显得十分重要了。但当目的基因nuc结果为阳时，内参照的扩增曲线较目的基因阴性时内参照的扩增曲线要推迟，或是内参照结果为阴都是正常的。但是目的基因nuc和内参照基因neo结果都为阴时，该试验视为无效，需再重复。阳性对照原理每次试验都需同时做阳性对照。阳性对照结果为阳，表明对靶基因的检测系统是正常的；而当结果为阴时，表明该次实验无效，需重复。阴性对照原理为证明有否污染存在，每次试验也需同时做阴性对照。阴性对照结果为阴，表明本次试验无污染；如结果为阳，则表明该次实验无效，需重复。实施例1本发明试剂盒的组成主要原材料来源及制备方法Tris 分析纯，有合格资质的供应厂商的产品，含量99.7%，红外合格，pH(5% 水)10. 3-10. 9，水份0. 3%，熔点167-171°C，吸收系统合格，杂质最高含量合格。MgCl2 分析纯，有合格资质的供应厂商的产品，含量不少于99%，水溶液反应合格，杂质最高含量合格。(MgC12极易吸潮，启用新瓶后放于干燥器下保存)。EDTA 分析纯，有合格资质的供应厂商的产品，为白色结晶状粉末，溶于水，溶液呈酸性，难溶于醇，含量不少于99. 5 %，水溶液反应合格，络合力试验合格，杂质最高含量合格。HCl 分析纯，北京化学试剂厂产品或有合格资质的供应厂商的产品。纯化水购买乐百氏桶装纯净水，然后经Millipore公司的Milli-Q Biocel型纯水机处理，电阻率16 18ΜΩ。引物和探针本发明所应用的引物、探针均委托Sigma和Biosearch公司合成，并经Sigma质检合格(含质谱鉴定)；其中nuc基因最优引物、探针序列组合如下上游引物A(SEQ ID NO. 1) :5，-AAAACACCCCTATCAAATGATAATC-3，；下游引物A (SEQ ID NO. 2) :5，-GAAGAACTCCGCGACGCA-3，；荧光探针A (SEQ ID NO. 3)5， -FAM-CATTATCAATGGATAGGGGCTATTTTAATAAAATTCG-BHQ-3，。其中mecA基因最优引物、探针序列组合如下上游引物B (SEQ ID NO. 4) :5，-ATGAAAAAGATAAAAATTGTTCCAC-3，；下游引物B (SEQ ID NO. 5) :5，-GACGTTCAGTCATTTCTACTTC-3，；荧光探针B (SEQ ID N0. 6)5 ’ -HEX-ACTTATTTTAATAGTTGTAGTTGTCGGGTTTGGTATATA-BHQ-3’。其中neo内参照系统的引物、探针序列组合如下上游引物(SEQID N0. 7) :5，-GACTAAACTGGCTGACGG-3，；下游引物B (SEQ ID N0. 8) :5，-GTATTTCGTCTCGCTCAG-3，；荧光探针B (SEQ ID N0. 9)5， -TEXrd-ATGCCTCTTCCGA-BHQ-S' 用于PCR反应的引物，紫外检测结果A260nm:A280nm彡1.5可视为合格引物。_20°C保存。nuc探针在寡核苷酸5’端标记FAM，3，端标记BHQ，紫外检测结果A260nm A280nm彡1. 5，在FAM荧光素的激发波长4Mnm处有吸收峰。-20°C保存。mecA探针在寡核苷酸5，端标记HEX，3，端标记BHQ，紫外检测结果A260nm A280nm彡1. 5，在HEX荧光素的激发波长555nm处有吸收峰。-20°C保存。neo探针在寡核苷酸5，端标记TE)(rd，3，端标记BHQ，紫外检测结果A260nm A280nm彡1. 5，在TEXrd荧光素的激发波长610nm处有吸收峰。_20°C保存。dNTPs :dATP、dCTP、dGTP、dUTP购自上海宏谊公司，或其他有合格资质的供应商， 并经出厂检测合格；按照本公司相应的质量标准进行检测合格后使用。根据供应商质量标准为HPLC纯，无DNase和RNase污染。_20°C保存。Taq酶本产品在研制开发及生产过程中，所应用的Taq酶购自大连TaKaRa公司， 或其他有合格资质的供应商。浓度5υ/μ 1，含10XPCR Buffer、25mm0l/LMgCl2，根据供应商质量标准本品具有DNA聚合酶活性，无3’ —5’核酸外切酶活性及核酸内切酶活性；具热稳定性，94°C保温1小时后仍保持50%活性。-20°C保存。UNG酶本产品在研制开发及生产过程中，所应用的UNG酶购自Promega公司或其他有合格资质的供应商，按照本公司相应的质量标准进行检测合格后使用。浓度> lU/μ 1， 根据供应商质量标准本品具有尿嘧啶糖基化酶活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性， IUUNG在50°C 2min能降解至少IO3Copies含dU的模板，使其不能产生扩增产物。_20°C保存。基础试剂配制10 X浓缩清洗液A 配制0. 2N NaOH, 5mL/管分装；10 X浓缩清洗液B 配制10 X TE缓冲液(ρΗ8· 0)，IOmL/管分装；
提取固形物取直径为0. 5mm和1. Omm两种玻璃珠，按质量配比约为 0. 5mm 1.0mm = 9 1比例配制出提取固形物，每管约0. 15g分装。IOmmol/L iTris-HCl溶液的配制称取0. 12114g的Tris，加入已含60mL蒸馏水的 IOOmL烧杯中，振摇使之充分溶解，移入IOOmL的容量瓶中，用IOmL蒸馏水洗涤烧杯3次并移入容量瓶中，用HCl调pH值为8. 0，最后用蒸馏水定容到IOOmL,翻转容量瓶使之充分混勻。移入试剂瓶并标记名称、浓度、配置时间。dNTPs的配制如表1 表 权利要求
1.一种金黄色葡萄球菌耐甲氧西林菌株PCR检测试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液 A和PCR反应液B ；所述PCR反应液A包括IOXbufTer缓冲液、dNTP、Mg离子、引物A和荧光探针A ；所述引物分为上游引物A和下游引物A ；所述上游引物A的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；所述下游引物A的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；所述荧光探针A的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示；所述PCR反应液B包括IOXbufTer缓冲液、dNTP、Mg离子、引物B和荧光探针B ；所述引物分为上游引物B和下游引物B;所述上游引物B的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示；所述下游引物B的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示；所述荧光探针B的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
2.按权利要求1所述的金黄色葡萄球菌耐甲氧西林菌株PCR检测试剂盒，其特征在于， 还包括tap酶、UNG酶、阳性对照、阴性对照。
3.按权利要求1所述的金黄色葡萄球菌耐甲氧西林菌株PCR检测试剂盒，其特征在于， 引入了人工构建的neo内参照系统用于避免检测结果假阴性，所述内参照系统包括上游引物核苷酸序列=SEQ ID NO. 7 ；下游引物核苷酸序列=SEQ ID NO. 8 ；探针核苷酸序列=SEQ ID NO. 9。
4.按权利要求1所述的金黄色葡萄球菌耐甲氧西林菌株PCR检测试剂盒，其特征在于， 所述荧光探针A的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ淬灭基团。
5.按权利要求1所述的金黄色葡萄球菌耐甲氧西林菌株PCR检测试剂盒，其特征在于， 所述荧光探针B的5’端标记TEX荧光基团，3’端标记BHQ淬灭基团。
6.一种金黄色葡萄球菌耐甲氧西林菌株PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤a、对金黄色葡萄球菌基因中高保守特异性核酸序列nuc基因进行PCR核酸扩增检测； 所述nuc基因进行PCR核酸扩增检测的上游引物A的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；下游引物A的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；荧光探针A的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示；判断不存在nuc基因则菌株不是金黄色葡萄球菌，判断存在nuc基因则进行步骤b检测；b、对金黄色葡萄球菌的耐药核酸序列mecA基因进行PCR核酸扩增检测，从而判断是否为金黄色葡萄球菌的耐甲氧西林菌株；所述mecA基因基因进行PCR核酸扩增检测的上游引物B的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示；下游引物B的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示；荧光探针B的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
全文摘要
本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种金黄色葡萄球菌耐甲氧西林菌株PCR检测试剂盒。本发明的技术方案是采用聚合酶链式反应及分子信标荧光探针技术对金黄色葡萄球菌基因中高保守特异性核酸序列nuc基因进行扩增检测，同时对耐药核酸序列mecA基因进行扩增检测，从而判断是否为金黄色葡萄球菌的耐甲氧西林菌株，还提供了nuc基因和mecA基因的PCR扩增引物和探针的序列。本试剂盒适用于可疑金黄色葡萄球菌感染者临床标本中金黄色葡萄球菌耐甲氧西林菌株的快速检测，具有灵敏度和特异性高、稳定、及时、操作方便等优点。
文档编号C12R1/445GK102399877SQ20111035354
公开日2012年4月4日 申请日期2011年11月9日 优先权日2011年11月9日
发明者何华东, 姚雪 申请人:泰普生物科学(中国)有限公司