专利名称：一种金黄色葡萄球菌菌株pcr检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种金黄色葡萄球菌菌株PCR检测试剂
品.O
背景技术：
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA，简称金葡)是医学上重要的致病菌，其分布广泛，感染类型多样，耐药率高，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(meticillin resistant staphylococcus aureus,MRSA)的感染呈多重耐药，病死率较高，已成为临床抗感染治疗的难点。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至严重到败血症、脓毒症等全身感染。目前临床应用的金黄色葡萄球菌的检测方法有常规涂片镜检法、培养法、免疫学测定、仪器自动化分析鉴定系统等方法，但是这些方法都存在一定的缺陷常规涂片镜检是是最基本的细菌学检查方法，但是敏感性低，特异性差；培养法是目前临床上发现传染源的主要途径和手段，是金黄色葡萄球菌诊断和治疗方案的重要依据，目前仍然以培养法为“金标准”，但是非常耗时，不能实现快速的目的；免疫学测定方法对培养基的含盐量有很高的要求，若含盐量比较高，那么蛋白的合成会受到抑制，而出现假阴性；另外，粗糙型的葡萄球菌和酵母菌偶尔也可引起非特异反应，同时某些含有血浆蛋白结合因子的链球菌和其它个别菌类(例如肠杆菌属的部分菌群)可以非特异地使乳胶颗粒凝集，而出现假阳性。仪器自动化分析鉴定系统，近年来，相关的革兰氏阳性球菌快速鉴定系统不断面市，如Biolog微生物自动分析系统、API 20C、ATB 32C、VITEK YBC和API Candid系统等， 但这些快速鉴定系统大多数是应用于临床革兰氏阳性球菌的鉴定。常规PCR法虽然有简便、快速、灵敏，的优势，但是又不能精确定量和PCR后处理产生污染导致的假阳性等问题。
发明内容
本发明目的是采用聚合酶链式反应及分子信标荧光探针技术对金黄色葡萄球菌基因中高保守特异性核酸序列进行扩增检测，从而判断金黄色葡萄球菌的存在，对金黄色葡萄球菌感染的辅助诊断。本发明的技术方案为提供一种金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒，包括PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包括引物和荧光探针，所述引物分为上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述下游引物的核苷酸序列如 SEQ ID N0. 2所示，所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示。优选的，所述试剂盒还包括tap酶、UNG酶、阳性对照、阴性对照。
优选的，所述试剂盒引入了一个人工构建的neo内参照系统用于避免检测结果假阴性，所述内参照系统包括上游引物核苷酸序列SEQ ID NO. 4;下游引物核苷酸序列SEQ ID NO. 5 ；探针核苷酸序列:SEQ ID NO. 6。优选的，所述荧光探针的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ淬灭基团。本发明的有益效果为利用金黄色葡萄球菌基因中高保守特异性核酸序列进行扩增检测，从而判断金黄色葡萄球菌的存在。本试剂盒具有灵敏度和特异性高、稳定、及时、操作方便等优点。使用了大肠杆菌新霉素基因作为内参照基因，它在金黄色葡萄球菌基因组和人类基因组中均无同源基因，因此可作为内参照以检测每次PCR反应中是否有PCR抑制物存在，从而确保PCR结果的可信性。
图1 金黄色葡萄球菌nuc基因灵敏度检测结果图；图2 金黄色葡萄球菌nuc基因特异性结果图。
具体实施例方式本发明采用聚合酶链式反应(PCR)及分子信标荧光探针(MoleculA. r beacon)技术对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus, SA，简称金葡)基因中高保守特异性核酸序列(nuc基因)进行扩增检测，从而判断金黄色葡萄球菌的存在。从而指导临床医生对金黄色葡萄球菌感染的病人用药，帮助预后判断。 目的基因nuc的检测因为nuc基因是金黄色葡萄球菌特有的耐热核酸酶基因，所以对nuc基因的检测可以区分金黄色葡萄球菌(SA)和凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)的。所述nuc基因序列如SEQ ID N0. 7所示。内参照原理试剂盒设置了内参照neo基因，即大肠杆菌新霉素基因。它在金葡基因组和人类基因组中均无同源基因，因此可作为内参照以检测每次PCR反应中是否有PCR 抑制物存在，从而确保PCR结果的可信性。当内参照结果为阳时，表示PCR反应体系以及操作正常；因此当目的基因nuc结果为阴时，内参照结果为阳就显得十分重要了。但当目的基因nuc结果为阳时，内参照的扩增曲线较目的基因阴性时内参照的扩增曲线要推迟，或是内参照结果为阴都是正常的。但是目的基因nuc和内参照基因neo结果都为阴时，该试验视为无效，需再重复。阳性对照原理每次试验都需同时做阳性对照。阳性对照结果为阳，表明对靶基因的检测系统是正常的；而当结果为阴时，表明该次实验无效，需重复。阴性对照原理为证明有否污染存在，每次试验也需同时做阴性对照。阴性对照结果为阴，表明本次试验无污染；如结果为阳，则表明该次实验无效，需重复。实施例1本发明试剂盒的组成主要原材料来源及制备方法Tris 分析纯，有合格资质的供应厂商的产品，含量99.7%，红外合格，pH(5% 水)10. 3-10. 9，水份0. 3%，熔点167-171°c，吸收系统合格，杂质最高含量合格。MgCl2 分析纯，有合格资质的供应厂商的产品，含量不少于99%，水溶液反应合格，杂质最高含量合格。(MgC12极易吸潮，启用新瓶后放于干燥器下保存)。
EDTA 分析纯，有合格资质的供应厂商的产品，为白色结晶状粉末，溶于水，溶液呈酸性，难溶于醇，含量不少于99. 5 %，水溶液反应合格，络合力试验合格，杂质最高含量合格。HCl 分析纯，北京化学试剂厂产品或有合格资质的供应厂商的产品。纯化水购买乐百氏桶装纯净水，然后经Mi 11 ipore公司的Mi 1 Ii-QBiocel型纯水机处理，电阻率16-18ΜΩ。引物和探针本发明所应用的引物、探针均委托Sigma和Biosearch公司合成，并经Sigma质检合格(含质谱鉴定)；其中nuc基因最优引物、探针序列组合如下上游引物A(SEQ ID NO. 1) :5，-AAAACACCCCTATCAAATGATAATC-3，；下游引物A(SEQ ID NO. 2) :5，-GAAGAACTCCGCGACGCA-3，；荧光探针A (SEQ ID NO. 3)5， -FAM-CATTATCAATGGATAGGGGCTATTTTAATAAAATTCG-BHQ-3，。其中neo内参照系统的引物、探针序列组合如下上游引物(SEQID NO. 4) :5，-GACTAAACTGGCTGACGG-3，；下游引物B (SEQ ID N0. 5) :5，-GTATTTCGTCTCGCTCAG-3，；荧光探针B (SEQ ID N0. 6)5， -TEXrd-ATGCCTCTTCCGA-BHQ-S' 用于PCR反应的引物，紫外检测结果A260nm:A280nm彡1.5可视为合格引物。_20°C保存。nuc探针在寡核苷酸5’端标记FAM，3，端标记BHQ，紫外检测结果A260nm A280nm彡1. 5，在FAM荧光素的激发波长494nm处有吸收峰，-20°C保存。neo探针在寡核苷酸5，端标记TE)(rd，3，端标记BHQ，紫外检测结果A260nm A280nm彡1. 5，在TEXrd荧光素的激发波长610nm处有吸收峰。_20°C保存。dNTPs :dATP、dCTP、dGTP、dUTP购自上海宏谊公司，或其他有合格资质的供应商， 并经出厂检测合格；按照本公司相应的质量标准进行检测合格后使用。根据供应商质量标准为HPLC纯，无DNase和RNase污染。_20°C保存。Taq酶本产品在研制开发及生产过程中，所应用的Taq酶购自大连TaKaRa公司， 或其他有合格资质的供应商。浓度5U/y 1，含10XPCRBuffer、25mmOl/LMgC12，根据供应商质量标准本品具有DNA聚合酶活性，无3’ 一5’核酸外切酶活性及核酸内切酶活性；具热稳定性，94V保温1小时后仍保持50 %活性。-20 V保存。UNG酶本产品在研制开发及生产过程中，所应用的UNG酶购自Promega公司或其他有合格资质的供应商，按照本公司相应的质量标准进行检测合格后使用。浓度> lU/μ 1， 根据供应商质量标准本品具有尿嘧啶糖基化酶活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性， IUUNG在50°C 2min能降解至少IO3Copies含dU的模板，使其不能产生扩增产物。_20°C保存。基础试剂配制10X浓缩清洗液A 配制0. 2N NaOH, 5mL/管分装；10 X浓缩清洗液B 配制10 X TE缓冲液(ρΗ8· 0)，IOmL/管分装；
提取固形物取直径为0. 5mm和1. Omm两种玻璃珠，按质量配比约为 0. 5mm 1.0mm = 9 1比例配制出提取固形物，每管约0. 15g分装。IOmmol/L iTris-HCl溶液的配制称取0. 12114g的Tris，加入已含60mL蒸馏水的 IOOmL烧杯中，振摇使之充分溶解，移入IOOmL的容量瓶中，用IOmL蒸馏水洗涤烧杯3次并移入容量瓶中，用HCl调pH值为8. 0，最后用蒸馏水定容到IOOmL,翻转容量瓶使之充分混勻。移入试剂瓶并标记名称、浓度、配置时间。dNTPs的配制如表1 表 权利要求
1.一种金黄色葡萄球菌PCR检测试剂盒，包括PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包括IOXbuffer缓冲液、dNTP、Mg离子、引物和荧光探针，所述引物分为上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
2.按权利要求1所述的金黄色葡萄球菌PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括tap酶、 UNG酶、阳性对照、阴性对照。
3.按权利要求1所述的金黄色葡萄球菌PCR检测试剂盒，其特征在于，引入了一个人工构建的neo内参照系统用于避免检测结果假阴性，所述内参照系统包括上游引物核苷酸序列=SEQ ID NO. 4 ；下游引物核苷酸序列=SEQ ID NO. 5 ；探针核苷酸序列=SEQ ID NO. 6。
4.按权利要求1所述的金黄色葡萄球菌PCR检测试剂盒，其特征在于，所述荧光探针的 5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ淬灭基团。
全文摘要
本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种金黄色葡萄球菌菌株PCR检测试剂盒。本发明的技术方案为提供一种金黄色葡萄球菌PCR检测试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括引物和荧光探针，所述引物分为上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。本试剂盒具有灵敏度和特异性高、稳定、及时、操作方便等优点。
文档编号C12Q1/14GK102399876SQ201110353530
公开日2012年4月4日 申请日期2011年11月9日 优先权日2011年11月9日
发明者何华东, 姚雪 申请人:泰普生物科学(中国)有限公司