专利名称：混菌固态发酵制备菜籽活性肽的方法
技术领域：
本发明涉及菜籽活性肽的制备方法，具体涉及两种微生物混合培养，固态发酵菜籽粕制 备菜籽活性肽的方法。
背景技术：
菜籽粕是生产菜籽油的副产物,其中含有35%~50%的粗蛋白质，是重要的植物蛋白质资 源，因菜籽粕中含有硫甙、芥子酸等抗营养成分，使菜籽饼粕作为植物蛋白资源在食品工业 中的应用受到限制。菜籽蛋白主要由12S球蛋白和2S或1.7S清蛋白组成，赖氨酸、胱氨酸 和蛋氨酸的含量较高，氨基酸平衡优于大豆蛋白，是一种优质蛋白质，菜籽蛋白水解成多肽 后，具有更好的生物活性和加工特性。
目前以菜籽粕或菜籽蛋白为原料获得菜籽活性肽的方法主要有化学法和酶法。化学法即 酸或碱水解植物蛋白时会产生氯丙醇类致癌物质，且反应条件剧烈，破坏了氨基酸原有构型， 同时水解废液的排放也会造成一定的环境污染。酶水解法是我国目前菜籽肽的制备主要方法， 但是由于菜籽粕或菜籽分离蛋白中抗营养因子不能完全脱除，影响了蛋白酶的活性，水解程 度不高，菜籽蛋白水解物的风味尤其是苦味问题还未根本解决，同时用于菜籽蛋白水解的酶 类来源有限，且成本居高不下，酶法制备菜籽肽受到了限制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种混菌固态发酵制备菜籽活性肽的方法，该方法对环境友好， 反应条件温和，能充分发挥微生物的水解蛋白质作用和降解硫甙作用，是一种低成本、适合 工业化大批量制备菜籽活性肽的方法。
本发明提供的一种混菌固态发酵制备菜籽活性肽的方法，包括以下步骤 U)将通过压榨或浸出制油工艺得到的菜籽粕粉碎，获得粉碎的菜籽粕；
(2) 将枯草芽孢杆菌、乳酸菌或产朊假丝酵母之一与雅致放射毛霉或宇佐美曲霉复配， 制备发酵剂；
(3) 将步骤(2)所述发酵剂接入步骤(1)所述粉碎的菜籽粕，进行固态发酵；
(4) 加水提取步骤(3)所述固态发酵后的培养基，分离去除残渣，得到菜籽活性肽的 粗提液；
(5) 将步骤(4)所述粗提液经过脱色、脱盐和干燥获得菜籽活性肽。
步骤(1)所说菜籽粕的原料是普通油菜籽或双低油菜籽，粉碎后的菜籽粕的粒径为 200 80(Hun。所述粉碎后的菜籽粕直接用于发酵或灭菌后用于发酵。
步骤(2)中采用两种菌复配可以达到产生多种蛋白酶系的目的，如枯草芽孢杆菌、乳酸菌和产朊假丝酵母产丝氨酸蛋白酶，雅致放射毛霉和宇佐美曲霉产羧基酸性蛋白酶，酶切位 点不同，能够满足生产不同活性肽的需要，同时两种菌复配也避免了多菌种之间的竞争抑制 性。
步骤(2)所述制备发酵剂的过程为
(2-1 )配制无菌营养液，其成分为葡萄糖0.1% 5%， KH2PO40.1% 2.0%， pH为4.0 10.0;
(2-2)将活化、扩大培养后的各微生物菌种，分别用(2-1)所述无菌营养液配制成菌 含量或孢子含量为lxl(f lxl08个/mL的悬浊液，混合后即为发酵剂。
步骤(3)所述发酵条件为发酵剂的加入量为粉碎的菜籽粕质量的0.7 4倍，发酵温 度15'C 4(TC，发酵时间2 5天，环境湿度40% 100%，发酵容器为发酵罐、发酵缸或发酵 池。
按照固液比为1:5 1:30 (质量比)加入去离子水、蒸馏水或自来水，对固态发酵后的培 养基进行提取。提取温度为15~80°C，提取时间为10 180min，提取1 3次。该提取液采用 真空过滤器或压力过滤器去除残渣，也可以采用离心法，离心力为1000 15000g，以获得 菜籽活性肽的粗提液。该粗提液采用活性炭脱色、脱苦，离子交换树脂或反渗透脱盐，采用 减压浓縮或热风干燥或冷冻干燥或喷雾干燥方式干燥提取液得菜籽肽粉。
本发明与现有的技术相比，直接以菜籽粕为原料混菌固态发酵生产菜籽肽，原料来源广 泛，价格低廉，不需要对其进行酸、碱的处理，更不需要分离出菜籽蛋白，生产工艺简单、 成本低，而且变废为宝，有利于环境保护，以微生物发酵取代纯酶制剂水解菜籽蛋白制备多 肽，可以节省大量昂贵的生物酶制剂。同时不同微生物混合发酵时产生多种代谢产物和酶类， 能有效降解菜籽粕种的有毒物质，水解蛋白质，达到人和动物的食用标准，用食品级的微生 物发酵生产的多肽除具有多肽本身的营养价值外，还含有多种对人体有益的功能因子。
具体实施例方式
实施例1固态发酵菜籽粕生产菜籽活性肽的菌种的筛选
筛选对象黑曲霉、白地霉、米曲霉、宇佐美曲霉、雅致放射毛霉、乳酸菌、产朊假丝 酵母、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。
发酵剂的制备活化后的菌种扩大培养后(按常规方法培养)，用无菌水稀释发酵种子 使菌体或者孢子浓度达到3X 10 个/mL，即为发酵剂。
将双低菜籽粕粉碎至粒径为500pm左右，121°〇下30min湿热灭菌。于发酵罐内，按固 液比1:1 1:2 (质量比)的比例加入发酵剂，发酵温度为28。C 35。C，环境湿度为80% 90%， 搅拌通风。发酵3天后，按固液比1:15(质量比)加蒸馏水溶解发酵培养基，低速离心(2500g) 分离去除粕渣，再用12000g离心力高速离心去杂，得菜籽活性肽粗提液。通过比较不同菌种发酵后菜籽粕的氮溶解指数、氨基酸态氮、肽得率和微生物产生的蛋 白酶的活力和粗体液中菜籽蛋白肽的分子量分布和粗提液的抗氧化性和降血压生物得出黑曲 霉，白地霉、黑根霉和地衣芽孢杆菌发酵产物的氮溶解指数、氨基酸态氮、肽得率都比较低， 而米曲霉固态发酵后产生了较多的可溶性氮，蛋白酶酶活力也很高，但多肽得率却较低，色 谱分析结果表明产生了较多的游离氨基酸，可以推断其发酵后产生蛋白酶可能是外切酶，作 用于菜籽粕后将蛋白质水解成了氨基酸，不能作为固态发酵生产菜籽活性肽的出发菌株。乳 酸菌、产朊假丝酵母、宇佐美曲霉、雅致放射毛霉和枯草芽孢杆菌发酵效果较好。
实施例2枯草芽孢杆菌与雅致放射毛霉同步混菌固态发酵菜籽粕生产菜籽肽
枯草芽孢杆菌菌悬液的制备
斜面培养基牛肉膏3g，蛋白胨10g， NaC15，琼脂20g，自来水1000mL， pH 7.2-7.4。 种子培养基牛肉膏3g，蛋白胨IO， NaC15g，自来水1000mL， pH7.2-7.4。 营养液成分葡萄糖2.6g， KH2P042.6g，无菌水1000mL， pH为7.0。
从活化后的菌种保藏斜面中,挑取两环枯草芽孢杆菌接种于种子培养基中，8层纱布封口， 35°C， 120r/min，摇床培养24h，菌体浓度达到1()S个/mL。
用无菌营养液稀释发酵液，配制成菌体浓度为3X 1(^个/mL的枯草芽孢杆菌菌悬液。 雅致放射毛霉菌悬液的制备
斜面培养基马铃薯300g，葡萄糖20g，琼脂2g0，自来水1000mL。 平板扩大培养基马铃薯300g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000mL。 无菌营养液葡萄糖5g， KH2P043 g， 1000mL无菌水，pH为7.0。 雅致放射毛霉接种到斜面培养基上于28'C恒温培养4天，然后接种于平板进行扩大培
养，4天后用无菌营养液洗下孢子，并将其浓度调整为3Xl(^个/mL。
将枯草芽孢杆菌和雅致放射毛霉的菌悬液按2:1的比例混合即得发酵剂。 将菜籽粕粉碎至粒径为50(Vm左右，灭菌，于发酵罐内，按固液比1丄5 (质量比)的比
例加入发酵剂，发酵温度为32'C，环境湿度为90%，搅拌通风，发酵4天后，按固液比1:15 (质量比)的比例加蒸馏水溶解发酵培养基，低速离心(2500g)分离去除粕渣，再高速离心 (10000g)除菌，即得菜籽活性肽粗提液。
将菜籽活性肽粗提液经过活性炭柱、脱盐柱(HiPrep 26/10，流速30 mL/min)脱色、
脱苦、脱盐后，喷雾干燥菜籽活性肽粗提液得菜籽活性肽，蛋白质含量(干基，NX6.25)为
86%,可溶性氮含量为82%，分子量在1000Da 5000 Da的肽含量58%,均为质量百分比，
硫甙含量9微摩尔/克菜籽活性肽。
实施例3雅致放射毛霉和产朊假丝酵母同步混菌固态发酵菜籽粕生产菜籽肽雅致放射毛霉菌悬液的制备-
斜面培养基马铃薯300g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000mL。 平板扩大培养基马铃薯300g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000mL。 无菌营养液葡萄糖5g， KH2P042g， lOOOmL无菌水，pH为6.5。
雅致放射毛霉接种到斜面培养基上于28'C恒温培养4天，然后接种于平板进行扩大培 养，4天后用无菌营养液洗下孢子，并将其浓度调整为3Xl(^个/mL。 产朊假丝酵母菌悬液的制备
斜面培养基麦芽浸膏3g，葡萄糖10g，酵母浸膏3g，蛋白胨5g，琼脂20g，自来水 lOOOmL。
种子培养基麦芽浸膏3g，葡萄糖10g，酵母浸膏3g，蛋白胨5g，自来水1000mL。 营养液葡萄糖5g， KH2P042g,无菌水1000mL， pH为6.5。
从活化后的菌种保藏斜面中，挑取两环产朊假丝酵母接种于种子培养基中，8层纱布封 口， 35°C， 120r/min，摇床培养24h，菌体浓度达到1()S个/mL。用无菌营养液将其浓度调整 为1()7个/mL。
将雅致放射毛霉和产朊假丝酵母的菌悬液按2: 1的比例混合即得发酵剂。 将菜籽粕粉碎至粒径为500pm左右，灭菌。于发酵罐内，按固液比l:l (质量比)的比 例加入发酵剂，调发酵温度为3(TC，环境湿度为90%，搅拌通风，发酵3天。按固液比1:15 (质量比)的比例加蒸馏水溶解发酵培养基，低速离心(2500g)分离去除粕渣，再高速离心 (10000g)去杂，即得菜籽活性肽粗提液。
将菜籽活性肽粗提液经过活性炭柱、脱盐柱(HiPrep 26/10，流速30 mL/min)脱色、 脱苦、脱盐后，喷雾干燥菜籽活性肽粗提液得菜籽活性肽，蛋白质含量(干基，NX6.25)为 88%，可溶性氮含量为82.7%，分子量在1000Da 5000Da的肽含量为53%，均为质量百分比， 硫甙含量8微摩尔/克菜籽活性肽。
实施例4枯草芽孢杆菌与宇佐美曲霉同步混菌固态发酵菜籽粕生产菜籽肽
枯草芽孢杆菌菌悬液的制备
斜面培养基牛肉膏3g，蛋白胨10g， NaC15，琼脂20g，自来水1000mL， pH 7.2-7.4。 种子培养基牛肉膏3g，蛋白胨IO， NaC15g，自来水1000mL, pH 7.2-7.4。 营养液成分葡萄糖3g， KH2P042g，无菌水1000mL， pH为6.5。 从活化后的菌种保藏斜面中,挑取两环枯草芽孢杆菌接种于种子培养基中，8层纱布封口，
35°C, 120r/min，摇床培养24h，菌体浓度达到1()S个/mL。用无菌营养液稀释发酵液，配制
成菌体浓度为3Xl(^个/mL的菌悬液。宇佐美曲霉菌悬液的制备-
斜面培养基马铃薯300g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000mL。 平板扩大培养基马铃薯300g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000mL。 无菌营养液葡萄糖3g， KH2P042g， 1000mL无菌水，pH为6.5。
宇佐美曲霉接种到斜面培养基上于28'C恒温培养4天，然后接种于平板进行扩大培养， 4天后用无菌营养液菌水洗下孢子，并将其浓度调整为3Xl(^个/mL。
将枯草芽孢杆菌和宇佐美曲霉的菌悬液按1:2的比例混合即得发酵剂。
将菜籽粕粉碎至颗径大小为500pm，灭菌，于发酵罐内，按固液比1:1.5 (质量比)的比 例加入发酵剂，发酵温度为32°C，环境湿度为90%，搅拌通风，发酵4天。按固液比1:15 (质 量比)的比例加蒸馏水溶解发酵培养基，低速离心(2500g)分离去除粕渣，再高速离心(10000g) 去杂，即得菜籽活性肽粗提液。
将菜籽活性肽粗提液经过活性炭柱、脱盐柱(HiPrep 26/10，流速30 mL/min)脱色、 脱苦、脱盐后，喷雾干燥菜籽活性肽粗提液得菜籽活性肽，蛋白质含量(干基，NX6.25)为 85% (质量比)，可溶性氮含量为76.5%，分子量在1000Da 5000 Da的肽含量为42%，均 为质量百分比，硫甙含量10微摩尔/克菜籽活性肽。
实施例5乳酸菌和宇佐美曲霉同步混菌固态发酵菜籽粕生产菜籽肽
乳酸菌菌悬液的制备
斜面培养基酵母膏5g，碳酸钙6g，琼脂15 20g， 5° B6麦芽汁1000mL， pH6.0。 种子培养基酵母膏5g，碳酸钙6g， 5° B6麦芽汁1000mL， pH6.0。 营养液成分葡萄糖5g， KH2P04 lg，无菌水1000mL， pH为5.5。 从活化后的菌种培养斜面中，挑取两环乳酸接种于种子培养基中，8层纱布封口， 37°C，
120r/min，摇床培养24h，发酵液中的菌体浓度达到10^个/mL。用无菌营养液调节发酵液菌
体浓度至3XlC^个/mL。
宇佐美曲霉菌悬液的制备
斜面培养基马铃薯300g,葡萄糖20g，琼脂2g0，自来水1000mL。 平板扩大培养基马铃薯300g，葡萄糖20g，琼脂2g0，自来水1000mL。 无菌营养液葡萄糖5g， KH2P04lg， 1000mL无菌水，pH为5.5。 宇佐美曲霉接种到斜面培养基上于28'C恒温培养4天，然后接种于平板进行扩大培养， 4天后用无菌营养液菌水洗下孢子，并将其浓度调整为3 X 107个/mL。 将乳酸菌和宇佐美曲霉的菌悬液按1:1的比例混合即得发酵剂。
将菜籽粕粉碎至颗径大小为500pm，灭菌。于发酵罐内，按固液比1:5 (质量比)的比例加入发酵剂，发酵温度为3(TC，环境湿度为90%，搅拌通风，发酵3天。按固液比1:15 (质 量比)的比例加蒸馏水溶解发酵培养基，低速离心(2500g)分离去除粕渣，再高速离心(10000g) 去杂，即得菜籽活性肽粗提液。
将菜籽活性肽粗提液经过活性炭柱、脱盐柱(HiPrcp 26/10，流速30mL/min)脱色、 脱苦、脱盐后，喷雾干燥菜籽活性肽粗提液得菜籽活性肽，蛋白质含量(干基，NX6.25)为 83% (质量比)，可溶性氮含量为71%，分子量在1000Da 5000Da的肽含量为35%，均为 质量百分比，硫甙含量3微摩尔/克菜籽活性肽。
权利要求
1、一种混菌固态发酵制备菜籽活性肽的方法，其特征在于(1)将通过压榨或浸出制油工艺得到的菜籽粕粉碎，获得粉碎的菜籽粕；(2)将枯草芽孢杆菌、乳酸菌或产朊假丝酵母之一与雅致放射毛霉或宇佐美曲霉复配，制备发酵剂；(3)将步骤(2)所述发酵剂接入步骤(1)所述粉碎的菜籽粕，进行固态发酵；(4)加水提取(3)所述固态发酵后的培养基，分离去除残渣，得到菜籽活性肽的粗提液；(5)将步骤(4)所述粗提液经过脱色、脱盐和干燥获得菜籽活性肽。
2、 根据权利要求1所述微生物固态发酵制备菜籽活性肽的方法，其特征在于步骤(1) 中所述粉碎后的菜籽粕的粒径为200~800nm。
3、 根据权利要求1所述微生物固态发酵制备菜籽活性肽的方法，其特征在于制备菜籽 粕的菜籽原料是普通油菜籽或双低油菜籽。
4、 根据权利要求1所述微生物固态发酵制备菜籽活性肽的方法，其特征在于步骤(2)中制备发酵剂的过程为(2-l)配制无菌营养液，其成分为葡萄糖0.1。/。 5。/。，KH2PO40.P/。 2.0。/。，pH为4.0 10.0; (2-2)将活化、扩大培养后的各微生物菌种，分别用(2-1)所述无菌营养液配制成菌 含量或孢子含量为lxl(^ lxl()S个/mL的悬浊液，混合后即为发酵剂。
5、 根据权利要求1所述微生物固态发酵制备菜籽活性肽的方法，其特征在于步骤(3) 所述发酵条件为发酵剂的接入量为粉碎的菜籽粕质量的0.7 4倍，发酵温度15°C 40°C， 发酵时间2 5天，环境湿度40% 100%，发酵容器为发酵罐、发酵缸或发酵池。
6、 根据权利要求1所述微生物固态发酵制备菜籽活性肽的方法，其特征在于步骤(4) 所述提取条件为采用去离子水、蒸馏水或自来水，固液比为1:5 1:30,提取温度为15~80 °C，提取时间10 180min，提取1~3次。
7、 根据权利要求1所述微生物固态发酵制备菜籽活性肽的方法，其特征在于步骤(4) 所述分离去除残渣的方法为过滤法或离心法，过滤法采用真空过滤器或压力过滤器，离心法 采用的离心力为1000 15000g。
8、 根据权利要求1所述微生物固态发酵制备菜籽活性肽的方法，其特征在于步骤(4)中采用活性炭脱色、脱苦，离子交换树脂或反渗透脱盐，采用减压浓缩或热风干燥或冷冻干 燥或喷雾干燥方式干燥提取液得菜籽肽粉。
全文摘要
本发明提供一种混菌固态发酵制备菜籽活性肽的方法，将通过压榨或浸出制油工艺得到的菜籽粕粉碎，获得粉碎的菜籽粕；将枯草芽孢杆菌、乳酸菌或产朊假丝酵母之一与雅致放射毛霉或宇佐美曲霉复配，制备发酵剂；将所述发酵剂接入所述粉碎的菜籽粕，进行固态发酵；加水提取所述固态发酵后的培养基，分离去除残渣，得到菜籽活性肽的粗提液；将所述粗提液经过脱色、脱盐和干燥获得菜籽活性肽。该方法对环境友好，反应条件温和，能充分发挥微生物的蛋白酶水解作用和降解硫甙作用，是一种低成本、适合工业化大批量制备菜籽活性肽的方法。
文档编号C12R1/785GK101440390SQ200810243460
公开日2009年5月27日 申请日期2008年12月25日 优先权日2008年12月25日
发明者荣 何, 王立峰, 建 袁, 鞠兴荣 申请人:南京财经大学