专利名称：一种微生物固态发酵制备菜籽活性肽的方法
技术领域：
本发明涉及菜籽活性肽的制备方法，具体涉及一种利用具有产蛋白酶能力的微生物固态 发酵、水解菜籽粕制备菜籽活性肽的方法。
背景技术：
菜籽饼粕是生产菜籽油的副产物,其中含有丰富的蛋白质，是重要的植物蛋白质资源，因 菜籽粕中含有硫甙、植酸等抗营养成分，使菜籽饼粕作为植物蛋白资源在食品工业中的应用 受到限制。菜籽蛋白主要由12S球蛋白和2S或1.7S清蛋白组成，赖氨酸、胱氨酸和蛋氨酸 的含量较高，氨基酸平衡优于大豆蛋白，是一种优质蛋白质，菜籽蛋白水解成多肽后，具有 更好的生物活性和加工特性。
目前以菜籽粕或菜籽蛋白为原料获得菜籽活性肽的方法主要有化学法和酶法。化学法采 用酸或碱水解植物蛋白时会产生氯丙醇类致癌物质，且反应条件剧烈，破坏了氨基酸原有构 型，同时水解废液的排放也会造成一定的环境污染。酶水解法是目前菜籽肽的制备主要方法， 但是由于菜籽粕或菜籽分离蛋白中抗营养因子不能完全脱除，影响了蛋白酶的活性，水解程 度不高，菜籽蛋白水解物的风味尤其是苦味问题还未根本解决，同时用于菜籽蛋白水解的酶 类来源有限，且成本居高不下，酶法制备菜籽活性肽受到了限制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微生物固态发酵制备菜籽活性肽的方法，该方法对环境友 好，反应条件温和，能充分发挥微生物的水解蛋白质作用和降解硫甙作用，是一种低成本、 适合工业化大批量制备菜籽活性肽的方法。
本发明提供一种微生物固态发酵制备菜籽活性肽的方法，包括以下步骤
(1) 将通过压榨或浸出制油工艺得到的菜籽粕粉碎，获得粉碎的菜籽粕。
(2) 以具有产蛋白酶能力的单一菌种，制备发酵剂。
(3) 将发酵剂接入粉碎的菜籽粕进行固态发酵。
(4) 加水提取固态发酵后的培养基，分离去除残渣，得到菜籽活性肽的粗提液。
(5) 将粗提液经过脱色、脱盐和干燥获得菜籽活性肽。
该微生物固态发酵制备菜籽活性肽的方法中，可以选用枯草芽孢杆菌、乳酸菌、雅致放 射毛霉、宇佐美曲霉或产朊假丝酵母作为发酵菌种。
菜籽粕的菜籽原料可以是普通油菜籽也可以是双低油菜籽，其粉碎粒径为200~800pm。 粉碎后的菜籽粕可以直接用于发酵或灭菌后用于发酵。 发酵剂的制备过程为
3(2-1)配制无菌营养液，其成分为葡萄糖0.1% 5% (w/v)， KH2PO40.1% 2.0%， pH 为4.0~10.0。
(2-2)将活化、扩大培养后的微生物菌种，用无菌营养液配制成菌含量或孢子含量为 lxlO" lxl()S个/mL的悬浊液，即为发酵剂。
步骤(3)中发酵条件为发酵剂的加入量为粉碎的菜籽粕质量的0.7 4倍，发酵温度 20°C~40°C，发酵时间2 5天，环境湿度40%~100%，发酵容器为发酵罐、发酵缸或发酵池。
按照固液比为1:5 1:30 (质量比)加入去离子水、蒸馏水或自来水，对固态发酵后的培 养基进行提取。提取温度为15~80°C，提取时间为10 180min，提取1~3次。该提取液采用 真空过滤器或压力过滤器去除残渣，也可以釆用离心法，离心力为1000 15000g，以获得菜 籽活性肽的粗提液。该粗提液采用活性炭脱色，离子交换树脂或反渗透脱盐，采用减压浓縮 或热风干燥或冷冻干燥或喷雾干燥方式干燥提取液得菜籽肽粉。
本发明与现有的技术相比，直接以菜籽粕为原料固态发酵生产菜籽肽，原料来源广泛， 价格低廉，不需要对其进行酸、碱的处理，更不需要分离出菜籽蛋白，生产工艺简单、成本 低，而且变废为宝，有利于环境保护，以微生物发酵取代纯酶制剂水解菜籽蛋白制备多肽， 可以节省大量昂贵的生物酶制剂。同时微生物发酵时产生多种酶类，能有效降解菜籽粕种的 有毒物质，达到人和动物的食用标准，用食品级的微生物发酵生产的多肽除具有多肽本身的 营养价值外，还含有多种对人体有益的功能因子。
具体实施例方式
实施例1固态发酵菜籽粕生产菜籽活性肽菌种的筛选
发酵菌种黑曲霉、黑根霉、白地霉、米曲霉、宇佐美曲霉、雅致放射毛霉、乳酸菌、 产朊假丝酵母、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。
发酵剂的制备活化后的各菌种按照常规方法扩大培养后，用无菌蒸馏水稀释发酵种子
使菌体浓度达到3Xl(^个/mL，即为发酵剂。
将双低菜籽粕粉碎至粒径为500nm左右，12rC下30min湿热灭菌。于发酵罐内，按固 液比1:1-1: 2 (质量比)的比例加入发酵剂，发酵温度为28'C 35'C，环境湿度为80%~90%， 搅拌通风。发酵3天后，按固液比1:15 (质量比)加蒸馏水溶解发酵培养基，离心力2500g 低速离心分离去除粕渣，再用12000g离心力高速离心去杂，得菜籽活性肽粗提液。
通过比较不同菌种发酵后菜籽粕的氮溶解指数、氨基酸态氮、肽得率、微生物产生的蛋 白酶的活力、粗提液中菜籽蛋白肽的分子量分布、粗提液的抗氧化性和降血压生物活性，得 出黑曲霉，白地霉、黑根霉和地衣芽孢杆菌发酵产物的氮溶解指数、氨基酸态氮、肽得率 都比较低，而米曲霉固态发酵后产生了较多的可溶性氮，蛋白酶酶活力也很高，但多肽得率却较低，色谱分析结果表明产生了较多的游离氨基酸，可以推断其发酵后产生蛋白酶可能是 外切酶，作用于菜籽粕后将蛋白质水解成了氨基酸，不能作为固态发酵生产菜籽肽的出发菌 株。乳酸菌、产朊假丝酵母、宇佐美曲霉、雅致放射毛霉和枯草芽孢杆菌发酵效果较好。
实施例2枯草芽孢杆菌固态发酵菜籽粕生产菜籽活性肽 斜面培养基牛肉膏3g，蛋白胨10g， NaC15，琼脂20g，自来水1000mL， pH 7.2-7.4。 种子培养基牛肉膏3g,蛋白胨IO， NaC15g，自来水1000mL， pH 7.2-7.4。 无菌营养液成分葡萄糖2.6g， KH2P042.6g，自来水1000mL， pH为7.0。
发酵培养基菜籽粕、营养液。
发酵剂的制备从活化后的菌种培养斜面中，挑取两环枯草芽孢杆菌接种于种子培养基
中，8层纱布封口， 35°C， 120r/min，摇床培养24h，发酵液中菌体浓度达到1()S个/mL。用无
菌营养液稀释发酵液，使菌体浓度为3Xl(^个/mL，即为发酵剂。
将双低菜籽粕粉碎至粒径为500pm左右，灭菌。于发酵罐内，按固液比1:2.5 (质量比)
的比例加入发酵剂，发酵温度为32'C，环境湿度为90%，搅拌通风。发酵4天后，按固液比
1:15(质量比)加蒸馏水溶解发酵培养基，离心力2500g低速离心分离去除粕渣，再用12000g
离心力高速离心去杂，得菜籽活性肽粗提液。
菜籽肽粗提液经过活性炭柱、脱盐柱(HiPrep 26/10，流速30 mL/min)脱色、脱苦、
脱盐后，喷雾干燥菜籽活性肽粗提液得菜籽活性肽，其中蛋白质含量87% (干基，NX6.25)，
可溶性氮含量80%,分子量在1000Da 5000 Da的肽含量50%，均为质量百分比，硫甙含量
11微摩尔/克菜籽活性肽。
实施例3雅致放射毛霉固态发酵菜籽粕生产菜籽活性肽 斜面培养基马铃薯300g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000mL。 平板扩大培养基马铃薯300g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000mL。 营养液成分葡萄糖50g， KH2P042g，自来水1000mL， pH为6.5。
发酵培养基菜籽粕，营养液。
发酵剂的制备雅致放射毛霉接种到斜面培养基上于28'C恒温培养4天，然后接种于 平板于28'C进行扩大培养，4天后用无菌营养液洗下孢子，并将其浓度调整为1(^个/mL。
将普通菜籽粕粉碎至粒径为50(Him左右，灭菌，于发酵罐内，按固液比l:l (质量比) 加入发酵剂，调发酵温度为3(TC，环境湿度为90%，搅拌通风。发酵4天后，按固液比1:15 (质量比)加蒸馏水溶解发酵培养基，经压力过滤装置过滤去除粕渣，即得菜籽活性肽粗提 液。
调节菜籽活性肽粗提液pH至6.5，加入10g/L的活性炭，于5(TC脱色、脱苦lh，然后高速离心G2000g)去杂，经反渗透柱脱盐后，喷雾干燥提取液得菜籽活性肽，其中蛋白质含 量85% (干基，NX6.25)，可溶性氮含量76%，分子量在1000Da 5000 Da的肽含量41%， 均为质量百分比，硫甙含量ll微摩尔/克菜籽活性肽。
实施例4宇佐美曲霉固态发酵菜籽粕生产菜籽活性肽 斜面培养基马铃薯300g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000mL。 平板扩大培养基马铃薯300g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000mL。 营养液成分葡萄糖50g， KH2P042g，自来水1000mL， pH为6.0。
发酵培养基菜籽粕，营养液。
发酵剂的制备宇佐美曲霉接种到斜面培养基上于28'C恒温培养4天，然后接种于平 板于28。C进行扩大培养，4天后用无菌营养液洗下孢子，并将其浓度调整为1(^个/mL。
将普通菜籽粕粉碎至粒径为400pm左右，灭菌，于发酵罐内，按固液比l:l (质量比) 加入发酵剂，调发酵温度为3(TC，环境湿度为90%，搅拌通风。发酵5天后，按固液比1:15 (质量比)加蒸馏水溶解发酵培养基，经压力过滤装置过滤去除粕渣，即得菜籽活性肽粗提 液。
调节菜籽活性肽粗提液pH至6.0，加入10g/L的活性炭，于5(TC脱色、脱苦lh，然后高 速离心(12000g)去杂，经反渗透柱脱盐后，喷雾干燥提取液得菜籽活性肽，其中蛋白质含 量84% (干基，NX6.25)，可溶性氮含量71%，分子量在1000Da 5000 Da的肽含量34%, 均为质量百分比，硫甙含量9微摩尔/克菜籽活性肽。
实施例5产朊假丝酵母固态发酵菜籽粕生产菜籽活性肽
斜面培养基麦芽浸膏3g，葡萄糖10g，酵母浸膏3g，蛋白胨5g，琼脂20g，自来水 1000mL。
种子培养基麦芽浸膏3g，葡萄糖10g，酵母浸膏3g，蛋白胨5g，自来水1000mL。 营养液葡萄糖3g， KH2P043 g，自来水1000mL， pH为7.0。 发酵培养基菜籽粕，营养液。
发酵剂的制备从活化后的菌种保藏斜面中，挑取两环产朊假丝酵母接种于种子培养基
中，8层纱布封口， 35°C， 120r/min，摇床培养24h，菌体浓度达到1()S个/mL。用无菌营养液 将其浓度调整为1(^个/mL
将菜籽粕粉碎至粒径为30(^m左右，121。C下灭菌30min。于发酵罐内，按固液比1:2.5 (质量比)加入发酵剂，发酵温度为30。C，环境湿度为90%，搅拌通风，发酵4天后，按固 液比1:15 (质量比)加蒸馏水溶解发酵培养基，低速离心(2500g)分离去除粕渣，即得菜籽活性肽粗提液。
调节菜籽活性肽粗提液pH至7.0，加入1% (w/v)活性炭，于5(TC脱色、脱苦1.5h，再 高速离心(10000g)去杂，上清液经脱盐柱(HiPrep 26/10，流速30 ml/min)脱盐后，经 喷雾干燥获得菜籽活性肽，其中蛋白质含量(干基，NX6.25) 83%，可溶性氮含量65%，分 子量在1000Da 5000 Da的肽含量32%，均为质量百分比，硫甙含量4微摩尔/克菜籽活性肽。
实施例6乳酸菌固态发酵菜籽粕生产菜籽活性肽
斜面培养基配比酵母膏5 g，碳酸钙6 g，琼脂15 20 g， 5° B6麦芽汁1000mL， pH 6.0。 种子培养基配比酵母膏5g，碳酸钙6g， 5° B6麦芽汁1000mL， pH6.0。 营养液成分配比葡萄糖4g， KH2P04 lg、自来水1000mL， pH为6.0。 发酵培养基菜籽粕，营养液。
发酵剂的制备从活化后的菌种培养斜面中，挑取两环乳酸接种于种子培养基中，8层
纱布封口， 37°C， 120r/min，摇床培养24h，发酵液中的菌体浓度达到1()S个/mL。用无菌营 养液调节发酵液菌体浓度至3 X 107个/mL。
将菜籽粕粉碎至粒径为400pm左右，于发酵罐内，按固液比1:1.5 (质量比)加入发酵剂， 发酵温度为37i:，环境湿度为90%，搅拌通风。发酵4.5天后，按固液比1:15 (质量比)加 蒸馏水溶解发酵培养基，低速离心(2500g)去除粕渣，再高速离心(12000g)去杂，得菜籽 活性肽粗提液。
菜籽肽粗提液经过活性炭柱、离子交换柱(HiPMp26/10，流速30 ml/min)脱色、 脱苦、脱盐后，再经喷雾干燥获得菜籽活性肽，其中蛋白质含量(干基，NX6.25) 81%，可 溶性氮含量68%，分子量在1000Da 5000 Da的肽含量35%,均为质量百分比，硫甙含量8 微摩尔/克菜籽活性肽。
权利要求
1. 一种微生物固态发酵制备菜籽活性肽的方法，其特征在于(1)将通过压榨或浸出制油工艺得到的菜籽粕粉碎，获得粉碎的菜籽粕；(2)以具有产蛋白酶能力的单一菌种，制备发酵剂；(3)将步骤(2)所述发酵剂接入步骤(1)所述粉碎的菜籽粕，进行固态发酵；(4)加水提取(3)所述固态发酵后的培养基，分离去除残渣，得到菜籽活性肽的粗提液；(5)将步骤(4)所述粗提液经过脱色、脱盐和干燥获得菜籽活性肽。
2. 根据权利要求1所述微生物固态发酵制备菜籽活性肽的方法，其特征在于步骤(2)中 所述具有产蛋白酶能力的单一菌种为枯草芽孢杆菌、乳酸菌、雅致放射毛霉、宇佐美曲霉或产朊假丝酵母。
3. 根据权利要求1或2所述微生物固态发酵制备菜籽活性肽的方法，其特征在于步骤 (1)中所述粉碎后的菜籽粕的粒径为200 80(Vm。
4. 根据权利要求1所述微生物固态发酵制备菜籽活性肽的方法，其特征在于制备菜籽粕 的菜籽原料是普通油菜籽或双低油菜籽。
5. 根据权利要求1所述微生物固态发酵制备菜籽活性肽的方法，其特征在于步骤(2)中 制备发酵剂的过程为(2-1 )配制无菌营养液，其成分为葡萄糖0.1。/o 5。/o，KH2P040.1。/o 2.0。/o，pH为4.0-10.0; (2-2)将活化、扩大培养后的微生物菌种，用(2-1)所述无菌营养液配制成菌含量或 孢子含量为lxl(^ lxl()S个/mL的悬浊液，即为发酵剂。
6. 根据权利要求1所述微生物固态发酵制备菜籽活性肽的方法，其特征在于步骤(3)中 的发酵条件为发酵剂的接种量为粉碎的菜籽粕质量的0.7 4倍，发酵温度2(TC 4(TC，发 酵时间2 5天，环境湿度40%~100%，发酵容器为发酵罐、发酵缸或发酵池。
7. 根据权利要求1所述微生物固态发酵制备菜籽活性肽的方法，其特征在于歩骤(4) 所述提取条件为采用去离子水、蒸馏水或自来水，固液比为1:5 1:30,提取温度为15~80 。C，提取时间10 180min，提取1~3次。
8. 根据权利要求1所述微生物固态发酵制备菜籽活性肽的方法，其特征在于步骤(4) 所述分离去除残渣的方法为过滤法或离心法，过滤法采用真空过滤器或压力过滤器，离心法 采用的离心力为1000 15000g。
9. 根据权利要求1所述微生物固态发酵制备菜籽活性肽的方法，其特征在于步骤(4)中采用活性炭脱色，离子交换树脂或反渗透脱盐，采用减压浓缩或热风干燥或冷冻干燥或喷 雾干燥方式干燥得到菜籽活性肽。
全文摘要
本发明提供一种微生物固态发酵制备菜籽活性肽的方法，将通过压榨或浸出制油工艺得到的菜籽粕粉碎，获得粉碎的菜籽粕；以具有产蛋白酶能力的单一菌种如枯草芽孢杆菌、乳酸菌、雅致放射毛霉、宇佐美曲霉或产朊假丝酵母，制备发酵剂；将发酵剂接入粉碎的菜籽粕进行固态发酵；加水提取固态发酵后的培养基，分离去除残渣，得到菜籽活性肽的粗提液；将粗提液经过脱色、脱盐和干燥获得菜籽活性肽。该方法对环境友好，反应条件温和，能充分发挥微生物的水解蛋白质作用和降解硫甙作用，是一种低成本、适合工业化大批量制备菜籽活性肽的方法。
文档编号C12R1/785GK101434982SQ20081024346
公开日2009年5月20日 申请日期2008年12月25日 优先权日2008年12月25日
发明者荣 何, 王立峰, 建 袁, 鞠兴荣 申请人:南京财经大学