专利名称：一种降血压菜籽活性肽及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及降血压菜籽活性肽、其制备方法及应用。
背景技术：
我国是世界上油菜籽产量最大的国家，年产量已近1200万吨，菜籽柏是菜籽油加エ的主要副产物，占菜籽总量的65%，其中含蛋白35% 42%。菜籽蛋白氨基酸组成合理，赖氨酸、胱氨酸和蛋氨酸的含量较高，是ー种优良的植物蛋白。开发利用菜籽蛋白质资源对有效利用我国的植物蛋白资源，提高我国人民的营养水平，具有重大的社会意义和良好的经济效益。目前，我国约有2亿高血压患者，每年仍然新增1000万人，现有的降血压药物存在以下问题一方面，现有降血压药物长期服用会对身体造成很多的副反应，尤其是对消化道系统有很大的伤害；另外一方面，目前大多数降血压肽研究的靶标都是血管紧张素转移酶(ACE)，但是，长期服用降血压药物ACE抑制剂，会激活血管紧张素系统(RAS)的旁路途径，从而影响高血压的临床治疗。而肾素抑制剂可以从源头阻断RAS系统，具有比ACE抑制剂更多的潜在获益、更少的不良反应和更好的耐受性，并且在大型中间终点事件的研究中显示出具有靶器官保护的作用。但是，基于肾素抑制剂的降血压药物较少。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种酶法制备降血压菜籽活性肽的方法，原料来源广泛，生产エ艺简单、成本低，而且变废为宝，有利于环境保护，是ー种低成本、适合エ业化大批量制备菜籽降血压的方法。本发明的另一目在于提供降血压菜籽活性肽，该菜籽活性肽胃肠反应小，能够抵抗人体消化道酶的水解，以其活性形式作用于靶器官，具有较好的降血压作用。本发明的另一目的在干提供降血压菜籽活性肽在制备治疗降血压药物中的应用。本发明提供一种制备降血压菜籽活性肽的方法，包括如下步骤
(O以粉碎后的菜籽柏为原料，将该原料与水混合，调节PH值至I. 5 2. 5，温度36. 5°C 37. 5で，搅拌分散O. 5 2 h，获得菜籽蛋白液；
(2)向步骤(I)所述菜籽蛋白液中，加入胃蛋白酶，在36.5°C 37. 5で下水解I 3h,获得菜籽蛋白胃蛋白酶水解液；将菜籽蛋白胃蛋白酶水解液的PH值调节至6. 5广8.0，加入胰酶，在36.5°C 37.5で下水解3-5小时，灭活其中的胃蛋白酶和胰酶，离心取上清液，得降血压菜籽活性肽粗提液；
(3)将步骤(2)所述降血压菜籽活性肽粗提液精制后获得降血压菜籽活性肽。步骤(I)所述菜籽柏的来源是普通油菜籽或双低油菜籽，粉碎后的菜籽柏的粒径为 10 200 μ m。
步骤(I)所述菜籽蛋白液的原料也可以是从菜籽柏中分离的蛋白质。
步骤(3)所述精制方法为降血压菜籽活性肽粗提液经截留分子量为3kDa的超滤膜超滤，取透过液透析脱盐，冷冻干燥得降血压菜籽活性肽。步骤(3)所述精制方法为将降血压菜籽活性肽粗提液经反相高效液相色谱分离，分别取有机溶剂体积浓度为30°/Γ35%和45°/Γ50%的两部分洗脱液，将该两部分洗脱液分别冷冻干燥，即得降血压菜籽活性肽；所述反相高效液相色谱分离的条件为色谱柱为碳12或碳18硅胶柱；流动相为水和有机溶剂，所述有机溶剂为甲醇或こ腈，所述水和有机溶剂中均含有质量浓度为O. 05 O. 10%三氟こ酸，洗脱条件为线性洗脱，流动相中的有机溶剂体积浓度从5%变化到80%。步骤(2)所述加入的胃蛋白酶与菜籽蛋白液中蛋白质的质量比为I 10:100，加入的胰酶与菜籽蛋白液中蛋白质的质量比为I 10:100。优选，所述加入的胃蛋白酶与菜籽蛋白液中蛋白质的质量比为5:100，加入的胰酶与菜籽蛋白液中蛋白质的质量比为5:100。本发明还提供一种采用上述方法制备的降血压菜籽活性肽。本发明还提供所述降血压菜籽活性肽在制备降血压药物中的应用。本发明的有益效果
(I)本发明制备降血压菜籽活性肽的方法中使用的菜子柏来源广泛，生产エ艺简单、成本低，而且变废为宝，有利于环境保护，是ー种低成本、适合エ业化大批量制备菜籽降血压的方法。(2)本发明直接以菜籽柏为原料，模拟胃肠道消化，将胃蛋白酶和胰酶联合使用来水解菜籽柏制备的降血压菜籽活性肽，胃肠反应小，能够抵抗人体消化道酶的水解，以其活性形式作用于靶器官，具有较好的降血压作用。原因在干胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等胃肠道蛋白酶，水解食物蛋白质可以释放出具有抗消化道酶水解能力的降血压肽；胰酶(pancreatin)，又叫胰液素，是胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶的混合物，具有较强的蛋白质水解能力，可以用于制备菜籽降血压肽。(3)另外，采用两种精制方法获得的降血压菜籽活性肽，不仅能够抑制血管紧张素转移酶(ACE)，而且能够抑制肾素，可以避免由于长期服用降血压药物ACE抑制剂激活的血管紧张素系统(RAS)的旁路途径，从而大大提高降压效果。
图I是采用反相高效液相色谱分离降血压菜籽活性肽粗提液的色谱图。
具体实施例方式本发明中使用的胃蛋白酶(P印sin)购于Sigma公司，货号是232_629_3，产品编号P7000 ;胰酶(Pancreatin)购于Sigma公司，货号是232-468-9，产品编号P1750。实施例I模拟胃肠道消化、水解菜籽柏制备降血压菜籽活性肽粗提液 方法(一) (I)将菜籽柏粉碎，通过100目筛，以粉碎后的菜籽柏为原料，按固液比1:20，将该原料与水混合，调节pH值至2. 0，温度36. 5°C 37. 5°C，搅拌分散lh，获得菜籽蛋白液。所述菜籽柏的来源是普通油菜籽或双低油菜籽，粉碎后的菜籽柏的粒径为10 200 μ m。也可以用从菜籽柏中分离的 蛋白质代替粉碎后的菜子柏制备菜籽蛋白液。(2)按加入的胃蛋白酶与菜籽蛋白液中蛋白质的质量比为I 10:100，向菜籽蛋白液中加入胃蛋白酶，控制温度和PH值不变，水解2 h，获得菜籽蛋白胃蛋白酶水解液；将菜籽蛋白胃蛋白酶水解液调节PH值至7. (Γ7. 5，按照加入的胰酶与菜籽蛋白液中蛋白质的质量比为I 10:100，加入胰酶，在36. 5°C 37. 5で下继续水解4 h。反应结束后，将混合液加热至90 100で，保持10 min，灭活其中的蛋白酶和胰酶，冷却至室温，10000 g离心カ离心I h取上清液，得降血压菜籽活性肽粗提液。方法(ニ)
(I)将菜籽柏粉碎，通过100目筛，以粉碎后的菜籽柏为原料，按固液比1:20，将该原料与水混合，调节PH值至2. 5，温度36. 50C -37. 5°C，搅拌分散2 h,获得菜籽蛋白液。所述菜籽柏的来源是普通油菜籽或双低油菜籽，粉碎后的菜籽柏的粒径为10 200 μ m。也可以用从菜籽柏中分离的蛋白质代替粉碎后的菜子柏制备菜籽蛋白液。(2)按加入的胃蛋白酶与菜籽蛋白液中蛋白质的质量比为5:100，向菜籽蛋白液中加入胃蛋白酶，控制温度和PH值不变，水解2 h，获得菜籽蛋白胃蛋白酶水解液；将菜籽蛋白胃蛋白酶水解液调节PH值至7. (Γ7. 5，按照加入的胰酶与菜籽蛋白液中蛋白质的质量比为5:100加入胰酶，在37で下继续水解4 h。反应结束后，将混合液加热至95で，保持10min，灭活其中的蛋白酶和胰酶，冷却至室温，10000 g离心カ离心I h取上清液，得降血压菜籽活性肽粗提液。实施例2将降血压菜籽活性肽粗提液进行精制制备降血压菜籽活性肽 将降血压菜籽活性肽粗提液精制后获得降血压菜籽活性肽。精制方法I :将降血压菜籽活性肽粗提液采用截留分子量为3kDa的超滤膜超滤，透过液(分子量小于3KDa的所有多肽)经透析脱盐，冷冻干燥得降血压菜籽活性肽，该降血压菜籽活性肽同时具有肾素抑制活性和ACE抑制活性。ACE抑制活性检测方法如下在比色杯中加入I mL 0.5 mM FAPGG (全称N-[3-(2-Furyl) acryloyl]-L-phenylalanyl-glycyl-glycine)(溶解在 50 mM Tris-HCl缓冲液，含 0.3 M NaCl, pH 7.5) ,20 μ L ACE (lU/mL,最终活力 20 mU) ,200 μ L 降血压菜籽活性肽溶液(蛋白浓度为lmg/mL;溶剂为50 mM Tris-HCl缓冲液，含0.3 M NaCl,pH 7. 5)，混匀室温下，2 min内测定345 nm下吸光值的降低速率.空白以Tris-HCl缓冲液代替样品.根据以下公式计算ACE抑制活性
ACE 抑制活性(％) =1-[ Δ A. miiT1 (样品)/ Δ A. mirT1 (空白)]X 100%，
其中，Λ A.和Λ A. Inin^1iδθ)分别是表示样品和空白的ACE活性抑制速率。肾素抑制活性的检测方法如下降血压菜籽活性肽抑制血管紧张素活性的体外测定根据肾素活性试剂盒(购买于Cayman Chemical，编号10006270)提供方法，按以下步骤测定96-孔板中依次加入(I)空白20 μ L底物，160 μ L测试用缓冲液，10 μ L纯水；(2)空白对照20 μ L底物，150 μ L测试用缓冲液，和10 μ L纯水；(3)样品20 μ L底物，150 UL测试用缓冲液，和10 μ L样品。之后分别在每个孔(除空白外)中加入10 μ L肾素启动反应。96-孔板室温下震荡10 S，在37 ciC下预热15 min，在IOmin内测定样品的荧光强度，激发波长340nm，发射波长490nm，根据以下公式计算样品的肾素抑制活性
織[跳活性勢;删%廳_(空白_ト糖逮寒(—> _ ,,其中，100%抑制速率(空白对照). WKliS 15=351}」
和抑制速率(样品)分别是表示空白对照和样品在IOmin内的肾素活性抑制速率。其中测试用缓冲液的制备(1)配制缓冲液50 mM Tris-HCl缓冲液，含O. I M NaCl, pH 8.0 ；(2)将降血压菜籽活性肽溶解于该缓冲液中，制成蛋白浓度为lmg/mL的溶液，即为测试用缓冲液。采用上述方法制备的降血压菜籽活性肽的ACE抑制活性50. 84 %、肾素抑制活性75.31 %，在降血压方面具有很好的应用前景。
精制方法2 :将降血压菜籽活性肽粗提液经反相高效液相色谱分离，分别取有机溶剂体积浓度为309Γ35%和459Γ50%的两部分洗脱液，将该两部分洗脱液分别冷冻干燥，即得降血压菜籽活性肽；所述反相高效液相色谱分离的条件为色谱柱为碳12或碳18硅胶柱；流动相为水和有机溶剂，所述有机溶剂为甲醇或こ腈，所述水和有机溶剂中均含有质量浓度为O. 05 O. 10%三氟こ酸，洗脱条件为线性洗脱，流动相中的有机溶剂体积浓度从5%变化到80%。反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离时，采用紫外检测器(检测波长215 nm)。其中，组分4 (有机溶剂洗脱浓度为45°/Γ50%) ACE抑制活性达到85. 91%，肾素抑制活性达到51. 28% ;组分6 (有机溶剂洗脱浓度为45°/Γ50%) ACE抑制活性达到89. 93%，肾素抑制活性达到61. 28%，可以看出采用该方法分离到的组分4和组分5均具有很高的ACE抑制活性和肾素抑制活性，在降血压方面有着很好的应用前景。
权利要求
1.一种制备降血压菜籽活性肽的方法，包括如下步骤 (O以粉碎后的菜籽柏为原料，将该原料与水混合，调节PH值至I. 5 2. 5，温度36. 5°C 37. 5で，搅拌分散O. 5 2 h，获得菜籽蛋白液； (2)向步骤(I)所述菜籽蛋白液中，加入胃蛋白酶，在36.5°C 37. 5で下水解I 3h，获得菜籽蛋白胃蛋白酶水解液；将菜籽蛋白胃蛋白酶水解液的PH值调节至6. 5^8. O，加入胰酶，在36. 5°C 37. 5で下水解3-5小时，灭活其中的胃蛋白酶和胰酶，离心取上清液，得降血压菜籽活性肽粗提液； (3)将步骤(2)所述降血压菜籽活性肽粗提液精制后获得降血压菜籽活性肽。
2.根据权利要求I所述制备降血压菜籽活性肽的方法，其特征在于步骤(I)所述菜籽柏的来源是普通油菜籽或双低油菜籽，粉碎后的菜籽柏的粒径为10 200 μ m。
3.根据权利要求2所述制备降血压菜籽活性肽的方法，其特征在于步骤(I)所述菜籽蛋白液的原料是从菜籽柏中分离的蛋白质。
4.根据权利要求2所述制备降血压菜籽活性肽的方法，其特征在于步骤(3)所述精制方法为降血压菜籽活性肽粗提液经截留分子量为3kDa的超滤膜超滤，取透过液透析脱盐，冷冻干燥得降血压菜籽活性肽。
5.根据权利要求2所述制备降血压菜籽活性肽的方法，其特征在于步骤(3)所述精制方法为将降血压菜籽活性肽粗提液经反相高效液相色谱分离，分别取有机溶剂体积浓度为309Γ35%和459Γ50%的两部分洗脱液，将该两部分洗脱液分别冷冻干燥，即得降血压菜籽活性肽；所述反相高效液相色谱分离的条件为色谱柱为碳12或碳18硅胶柱；流动相为水和有机溶剤，所述有机溶剂为甲醇或こ腈，所述水和有机溶剂中均含有质量浓度为O.05 O. 10%三氟こ酸，洗脱条件为线性洗脱，流动相中的有机溶剂体积浓度从5%变化到 80%ο
6.根据权利要求1-5之一所述制备降血压菜籽活性肽的方法，其特征在于步骤(2)所述加入的胃蛋白酶与菜籽蛋白液中蛋白质的质量比为I 10:100，加入的胰酶与菜籽蛋白液中蛋白质的质量比为I 10:100。
7.根据权利要求6所述制备降血压菜籽活性肽的方法，其特征在于步骤(2)所述加入的胃蛋白酶与菜籽蛋白液中蛋白质的质量比为5:100，加入的胰酶与菜籽蛋白液中蛋白质的质量比为5:100。
8.ー种采用权利要求1-5之一方法制备的降血压菜籽活性肽。
9.一种权利要求8所述降血压菜籽活性肽在制备降血压药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种降血压菜籽活性肽及其制备方法和应用。所述制备降血压菜籽活性肽的方法为用胃蛋白酶及胰酶水解菜籽蛋白液获得降血压菜籽活性肽粗提液，精制后获得降血压菜籽活性肽。本发明还提供一种采用该方法制备的降血压菜籽活性肽及其应用。本发明制备降血压菜籽活性肽的菜子粕来源广泛，生产工艺简单、成本低、环保，是适合工业化的方法。所述降血压菜籽活性肽，胃肠反应小，能够抵抗人体消化道酶的水解，以其活性形式作用于靶器官，具有较好的降血压作用。该降血压菜籽活性肽，不仅能够抑制ACE，而且能够抑制肾素活性，可以避免长期服用降血压药物ACE抑制剂激活的RAS的旁路途径，在降血压方面有很好的应用前景。
文档编号C12P21/06GK102643889SQ201210130099
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月28日 优先权日2012年4月28日
发明者何荣, 周建新, 王立峰, 石嘉怿, 袁建, 都立辉, 陈银基, 鞠兴荣, 高瑀珑 申请人:南京财经大学