专利名称：沙门氏菌内标逆转录荧光定量快速检测的方法和试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于食品安全领域的核酸检测方法。具体而言，本发明涉及沙门氏菌SigD/SigE基因带内标逆转录荧光定量快速检测的方法和试剂盒以及应用。
背景技术：
沙门氏菌(Salmonella spp.)是重要的食源性致病菌之一，主要通过肉类、奶类、蛋类等食品传播、感染人体，引发伤寒、败血症、急性胃肠炎等病症。在世界各国细菌性食物中毒病例中，沙门氏菌引起的食物中毒案例常列榜首或第二位。建立一种行之有效的食源性沙门氏菌的定量检测方法，以提高对该菌的检测速度和准确性，使受污染的食品得到及时处理，在公共卫生、食品卫生和口岸检疫等中都有重要意义。
然而，传统的检测方法耗时、操作繁琐，而基于免疫学原理的产品存在检测限高、特异性不强等问题。尤其是常规的分子生物学检测方法大多以细菌的DNA为模板，无法区分死菌和活菌。而很多研究又表明，细菌中的rRNA和tRNA分子是相当稳定的，与细菌的活性没有直接关系。只有mRNA是微生物在存活状态下产生的一类核酸大分子物质，其表达量的多少和质量的高低(完整性)与细胞的状态密切相关，从mRNA的检测结果中就可以直接获得食品中存活微生物的信息。且mRNA的丰度和活性又与所选择的基因及其在基因内扩增的位置及检测的难易度相关。传统生化检测方法可以区分死菌和活菌，但其耗费时间长；而运用实时荧光定量PCR(real-time PCR，简称RT-PCR)方法，目前还没有有效的方法能消除抑制剂引起的假阴性问题，因此开发有效监测假阴性现象以避免漏检的产品显得十分必要。为此，本发明人经过长期研究，令人意外地研究出了一种沙门氏菌pipC/sigD/E内标逆转录快速检测的方法，不但能避免假阴性漏检的现象以有效监控PCR扩增，而且沙门氏菌属的检测特异性强，可有效区分死细菌和活细菌，快速，检测灵敏度高，并可以应用于食品中沙门氏菌的高通量筛检。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一在于提供一种沙门氏菌内标逆转录荧光定量快速检测的方法。本发明要解决的技术问题之二在于提供一种沙门氏菌内标逆转录荧光定量快速检测试剂盒。本发明要解决的技术问题之三在于提供上述试剂盒在制备用于检测样品中活的沙门氏菌的检测试剂产品中的应用。具体而言，在第一方面，本发明提供了一种沙门氏菌内标逆转录荧光定量快速检测的方法，其包括如下步骤(I)提取样品中的RNA ；
(2)制备内标，包括如下步骤A.以原壳小球藻的cDNA或GenBank登录号⑶269622. I所示的核酸为模板，用引物 zds-F :5’ -GTTGGTGGGCGTGCCTGTGA-3’ (SEQ ID NO. I)和 zds_R :5’ -AAGTACGGGTCGGCGGGTGT-3’ (SEQ ID NO. 2)进行第一次 PCR 扩增，得到初始 PCR 产物；B.以初始 PCR 产物为模板，用引物 s45-F/zds-F :5’ -TGGCATAAAGGGACAGCACGTTGGTGGGCG TGCCTGTGA-3’ (SEQ ID NO. 3)和 s45-R/zds_R :5’-AGCGGCAAAGATCGTACAGAAGTACGGGTCGGC GGGTGT-3’ (SEQ ID NO. 4)进行第二次PCR扩增，得到第二次PCR产物；C.以第二次PCR产物为模板，用引物T7/s45-F :5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGATGGC ATAAAGGGACAGCAC-3’ (SEQ ID NO. 5)和 S45-R :5’-AGCGGCAAAGATCGTACAG-3’ (SEQ ID NO. 6)，进行第三次PCR扩增，得到第三次PCR产物；D.将第三次PCR产物转录成RNA，作为内标，该内标RNA序列如SEQ ID NO. 9所示；(3)将步骤(I)获得的RNA与步骤(2)获得的内标RNA混合，进行逆转录实时荧光定量 PCR(reverse-transcriptase real-time PCR)检测。在本发明中，步骤(I)所述的样品是潜在含有活的沙门氏菌的离体样品，如食品、血液、血液制品、唾液、医疗用品或药品等。由于沙门氏菌是食源性致病菌，因此优选样品来自于食品，如样品是食品，或者样品是食品的细菌平板培养物等。需要指出的是，检测来自于食品的样品，属于食品安全检测领域。提取RNA以及实时荧光定量PCR(即RT-PCR)检测中所用的试剂和仪器已经为本领域技术人员所掌握，而且目前有大量商品化的试剂和仪器可供选用。例如，在本发明的具体实施方式
中，可以使用RNAprep pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒来提取RNA，可以使用Premix Ex Taq 试剂以及ABI7500荧光定量PCR仪来进行RT-PCR检测。但是，这些试剂不提供RT-PCR的引物。优选在本发明中，RT-PCR的引物为S45-F和S45-R，S45-F 的序列为 5’ -TGGCATAAAGGGACAGCAC-3’(SEQ ID NO. 7)，S45-R 的序列为5’ -AGCGGCAAAGATCGTACAG-3’ (SEQ ID NO. 8)。PCR和RT-PCR的反应过程是本领域技术人员所能掌握的，每个循环一般包括在92-96°C的变性、低温退火和72°C左右的延伸过程，其中最多变的是退火的温度。根据本发明人研究，最优选的RT-PCR的过程为40个循环，其中每个循环为95°C /45s, 58°C /45s，72°C /45s。另外，根据本发明人研究，在步骤(2)制备内标中，最优选的第一次、第二次和第三次PCR的退火温度均为60°C，如也可以进行40个循环，其中每个循环为95°C /45s，60°C /45s, 72°C /45s。内标在RT-PCR的反应体系中的含量对RT-PCR检测的结果有一定的影响。根据本发明人研究，最优选的内标在RT-PCR的反应体系中的含量为3fg/l·! I。在第二方面，本发明提供了检测试剂盒，其包括由如下方法制成的内标序列及制成该内标的引物序列 以原壳小球藻的cDNA或GenBank登录号⑶269622. I所示的核酸为模板，用引物zds-F5’-GTTGGTGGGCGTGCCTGTGA-3’ (SEQ ID NO. I)和 zds_R 5’-MGTACGGGTCGGCGGGTGT-3’ (SEQID NO. 2)进行第一次PCR扩增，得到初始PCR产物；以初始 PCR 产物为模板，用引物 s45-F/zds-F 5’-TGGCATAAAGGGACAGCACGTTGGTGGGCG TGCCTGTGA-3’ (SEQ ID NO. 3)和 s45-R/zds_R 5’-AGCGGCAAAGATCGTACAGAAGTACGGGTCGGCGGGTGT-3’ (SEQ ID NO. 4)进行第二次PCR扩增，得到第二次PCR产物。以第二次PCR 产物为模板，用引物 T7/s45-F 5，-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGATGGC ATAAAGGGACAGCAC-3’ (SEQ ID NO. 5)和 S45-R 5’-AGCGGCAAAGATCGTACAG-3’ (SEQ IDNO. 6)，进行第三次PCR扩增，得到第三次PCR产物，以及将第三次PCR产物转录成RNA，作为内标，该内标RNA序列如SEQ ID NO. 9所示。然而，RNA不容易保存，因此优选检测试剂盒包括制成上述内标的原料，即包括原壳小球藻的cDNA或GenBank登录号⑶269622 . I所示的核酸，引物zds_F(SEQ ID NO. I)和 zds-R(SEQ ID NO. 2)，引物 s45-F/zds_F (SEQ ID NO. 3)和 s45-R/zds_R(SEQ ID NO. 4),引物T7/s45-F(SEQ ID NO. 5)和S45_R(SEQ ID NO. 6)。另外，优选检测试剂盒还进一步包括PCR试剂和/或体外转录试剂。例如，在本发明的具体实施方式
中，体外转录试剂来自T7体外转录试剂盒。检测试剂盒还可以包括提取RNA和/或RT-PCR检测中所用的试剂。这些试剂可以通过市场渠道购买，如可以将现有的提取RNA和/或RT-PCR检测试剂盒中的试剂进行分装。优选检测试剂盒还包括引物S45-F和S45-R，S45-F 的序列为 5’-TGGCATAAAGGGACAGCAC-3’ (SEQ ID NO. 7), S45-R 的序列为5’ -AGCGGCAAAGATCGTACAG-3’ (SEQ ID NO. 8)。在第三方面，本发明提供了本发明第二方面的检测试剂盒在制备用于检测样品中活的沙门氏菌的方法的检测试剂产品中的应用。检测试剂产品包括检测试剂盒、检测试剂等，进一步地，还可以包括记载检测样品中活的沙门氏菌的方法的说明书。优选该应用用于本发明第一方面的方法，即本发明提供了本发明第二方面的检测试剂盒在制备用于本发明第一方面的方法的检测试剂产品中的应用。本发明取得的有益效果在于有效避免了沙门氏菌属检测中的假阴性漏检，有效监控RT-PCR扩增过程；沙门氏菌属的检测特异性强，对沙门氏菌属各菌种的检测适应性广；可有效区分死和活的沙门氏菌，使得检测结果更能满足实际食品安全检测的需求；检测方法快速、灵敏度高，适用于高通量筛选。为了便于理解，以下将通过具体的附图、实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
图I显示了实施例I. 3内标制备过程中各步骤的PCR产物的电泳图谱；其中，图I(A)显示了第一次PCT产物的电泳图谱；图I(B)显示了第二次PCT产物的电泳图谱；图I(C)显示了第三次PCT产物的电泳图谱。图2显示了实施例I. 5未加以及加入不同内标量的RT-PCR图谱及其融解曲线分析图谱。
具体实施例方式以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子可隆实验指南》(第三版)(Cold Spring Harbor laboratoryPress)、《细胞实验指南》(科学出版社,北京，中国，2001年)、《RNA实验技术手册》(科学出版社，北京，中国，2004年)、《免疫检测技术》(科学出版社，北京，中国，1991)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列方法来实施。I. I主要试剂和仪器β -巯基乙醇，2. 46mol/l，异硫氰酸胍抽提缓冲液，购自上海柏汇申生物科技有限公司；蛋白酶K,20mg/ml,天根生物科技(北京)有限公司；异丙醇(Cat. No. 80109218)、乙醇(Cat. No. 10009218)、三氯甲烷(Cat. No. 10006818)购自上海国药集团；RNAprep pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒，购自天根生物公司；胶回收试剂盒Wizard SV Gel andPCR Clean-Up System(Promega Cat. No. A9281) ；SYBR PrimeScript RT-PCR Kit (PerfectReal Time) (TAKARA 公司)琼脂糖试剂盒反转录试剂盒,TaKaRa PrimeScript RT reagentKit (Cat. No. DRR037S)及实时荧光 PCR 试剂盒 Premix Ex Taq (Cat. No. DRR039S)，购自·大连宝生物工程有限公司；DNA凝胶回收试剂盒，购自美国Axygen公司；紫外核酸与蛋白质分析仪，购自美国Beckman公司；T7体外转录试剂盒(北京天恩泽基因科技有限公司，Cat.No. 91106A-50) ；ABI7500 荧光定量 PCR 仪，购自 ABI 公司。I. 2菌株以及RNA的抽提菌株均可以购自于中国科学院微生物研究所和中国医学微生物菌种保藏中心以及美国典型微生物保藏中心，菌株编号如表I所示。培养方法可以按照上述菌株提供单位推荐的方法进行，参照厂商说明，用RNAprep pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，Cat. No. DP430)来提取。表I沙门氏菌及非沙门氏菌标准菌株菌株以及用本发明的PCR方法检测的结果
菌种菌株编号血清型PCR检测
____结果*
鸡沙门氏菌CMCC50770 鸡沙门氏菌 +
伤寒沙门菌TyphiCMCC50180 伤寒+
鼠伤寒沙门菌Typhimurium ATCC 14028 鼠伤寒+
权利要求
1.一种沙门氏菌内标逆转录荧光定量快速检测的方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)提取样品中的RNA； (2)制备内标，包括如下步骤 A.以原壳小球藻的cDNA或GenBank登录号⑶269622.I所示的核酸为模板，用引物 zds-F :5’ -GTTGGTGGGCGTGCCTGTGA-3’ (SEQ ID NO. I)和 zds_R :5’ -AAGTACGGGTCGGCGGGTGT-3’ (SEQ ID NO. 2)进行第一次 PCR 扩增，得到初始 PCR 产物； B.以初始PCR 产物为模板，用引物 s45-F/zds-F :5’ -TGGCATAAAGGGACAGCACGTTGGTGGGCGTGCCTGTGA-3’ (SEQ ID NO. 3)和 s45-R/zds_R :5’ -AGCGGCAAAGATCGTACAGAAGTACGGGTCGGCGGG TGT-3’ (SEQ ID NO. 4)进行第二次PCR扩增，得到第二次PCR产物； C.以第二次PCR 产物为模板，用引物 T7/s45-F :5’ -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGATGGCATAAAGGGACAGCAC-3’ (SEQ ID NO. 5)和 S45-R :5’-AGCGGCAAAGATCGTACAG-3’ (SEQ IDNO. 6)，进行第三次PCR扩增，得到第三次PCR产物； D.将第三次PCR产物转录成RNA，作为内标，该内标RNA序列如SEQID NO. 9所示； (3)将步骤(I)获得的RNA与步骤(2)获得的内标RNA混合，进行逆转录实时荧光定量PCR检测。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，所述样品来自于食品。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，实时荧光定量PCR的引物为S45-F 和 S45-R，S45-F 的序列为 5’ -TGGCATAAAGGGACAGCAC-3’ (SEQ ID NO. 7)，S45-R 的序列为 5’ -AGCGGCAAAGATCGTACAG-3’ (SEQ ID NO. 8)。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，实时荧光定量PCR的条件为950C /45s, 580C /45s, 72°C /45s, 40 个循环。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述内标在实时荧光定量PCR的反应体系中的含量为3fg/y I。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，第一次、第二次和第三次PCR扩增的退火温度均为60°C。
7.一种含内标的沙门氏菌实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括由如下方法制成的内标序列及制成该内标的引物序列 以原壳小球藻的cDNA或GenBank登录号⑶269622. I所示的核酸为模板，用引物 zds-F :5’ -GTTGGTGGGCGTGCCTGTGA-3’ (SEQ ID NO. I)和 zds_R :5’ -AAGTACGGGTCGGCGGGTGT-3’ (SEQ ID NO. 2)进行第一次 PCR 扩增，得到初始 PCR 产物； 以初始 PCR 产物为模板，用引物 s45-F/zds-F :5’ -TGGCATAAAGGGACAGCACGTTGGTGGGCGTGCCTGTGA-3’ (SEQ ID NO. 3)和 s45-R/zds_R :5’-AGCGGCAAAGATCGTACAGAAGTACGGGTCGGCGGG TGT-3’ (SEQ ID NO. 4)进行第二次PCR扩增，得到第二次PCR产物； 以第二次 PCR 产物为模板，用引物 T7/s45-F 5，-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGATGGCAT AAAGGGACAGCAC-3’ (SEQ ID NO. 5)和 S45-R :5’ -AGCGGCAAAGATCGTACAG-3’ (SEQ IDNO. 6)，进行第三次PCR扩增，得到第三次PCR产物，以及 将第三次PCR产物转录成RNA，作为内标，该内标RNA序列如SEQ ID NO. 9所示。
8.如权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括实时荧光定量PCR的引物S45-F 和 S45-R，S45-F 的序列为 5’ -TGGCATAAAGGGACAGCAC-3’ (SEQ ID NO. 7)，S45-R 的序列为 5’ -AGCGGCAAAGATCGTACAG-3’ (SEQ ID NO. 8)。
9.如权利要求7或8所述的检测试剂盒在制备用于检测样品中活的沙门氏菌的检测试剂产品中的应用。
10.如权利要求9所述的应用,其用于权利要求1-6任一项所述的方法。
全文摘要
本发明公开了一种带有内标的，以沙门氏菌sigD/sigE基因为靶标的逆转录荧光定量PCR快速检测方法，其中包括经三次PCR扩增得到的RNA内标。另外，本发明还提供了相应试剂盒以及应用。本发明可广泛用于实验室研究、食品安全、医药卫生等众多领域，不但能避免假阴性漏检的现象以有效监控PCR扩增，而且沙门氏菌属的检测特异性强，可有效区分死细菌和活细菌，快速，检测灵敏度高，并可以应用于食品中沙门氏菌的高通量筛检。
文档编号C12R1/42GK102676662SQ20121012938
公开日2012年9月19日 申请日期2012年4月27日 优先权日2012年4月27日
发明者史贤明, 周敏, 杨捷琳, 杨柳, 潘良文 申请人:上海交通大学, 中华人民共和国上海出入境检验检疫局