专利名称：一种重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株的制作方法
技术领域：
本发明涉及伪狂犬病毒技术领域，具体地讲，涉及一种重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株及其制备方法，以及用含该重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株的基因工程疫苗。
背景技术：
伪狂犬病毒(Psedorabiesvirus,PRV)属于抱疫病毒(Herpesviridac) α 抱疫病毒亚科(Alphaher-pesririnae)水痕病毒属(Varicello virus)的抱疫病毒 I 型(Porcineherpesvirus Typel),能引发猪的严重疾病。同时,猪既是伪狂犬病毒的忙存者，也是伪狂犬病毒的传染源，控制猪伪狂犬病不仅对养猪业本身，而且对其它动物的养殖也有着十分重要的意义。疫苗免疫接种是预防控制与消灭伪狂犬病的根本措施。 早期的猪伪狂犬疫苗主要是弱毒疫苗和灭活疫苗。早期弱毒疫苗都是通过非猪源细胞的反复传代，或鸡胚接种传代，或在某些致突变剂的存在下，在高于通常培养温度的条件下在细胞培养物上反复继代获得。目前常用的猪伪狂犬病弱毒疫苗有匈牙利Bartha-K/61株、罗马尼亚BC株、美国的BUK株和Norden株，其它如MK-21、MK-35、ALF0RT-26、NIA-4等。弱毒疫苗(天然基因缺失疫苗)虽然在伪狂犬病免疫防制方面有一定的效果，但是其毒力返强的可能性很大，并能导致疾病的流行。未经充分致弱或过度致弱的疫苗株不仅不能诱导满意的免疫保护反应，反而可能引起疾病及免疫抑制；弱毒疫苗可建立潜伏感染，并存在散毒的危险，而且部份接种猪虽然血清中存在中和抗体，但带毒期却可持续数年。灭活疫苗是将强毒株在BHK-21、IBRS-2等细胞上培养，用甲醛灭活制得，它克服了弱毒疫苗的缺点。但灭活疫苗用量大，有时导致注射部位肿胀等不良反应。此后，随着对伪狂犬病毒研究的深入，特别随着是分子生物学理论和技术的进步，从上世纪80年代初开始，世界各国相继启动了伪狂犬基因缺失疫苗的研究。伪狂犬病基因缺失疫苗是利用基因工程技术在PRV基因组中插入或缺失一段序列，致使PRV的某些基因(特别是一些毒力基因)不能表达，从而使PRV的毒力减弱，同时又保持其较强的免疫原性。第一代基因缺失疫苗主要是缺失TK基因。TK基因是伪狂犬病毒主要的毒力基因，其编码的胸腺嘧啶核苷激酶是核酸代谢中的重要酶类，催化脱氧胸腺嘧啶核苷的磷酸化反应，合成dTMP。虽然TK是核苷酸代谢的重要酶类，其缺失对病毒的生长有一定的影响，但并非病毒DNA复制所必需的基因。TK缺失不仅不影响病毒的免疫原性，而且还极大地降低了病毒的毒力。此外，TK缺失突变株毒力返强的可能性很低。总之，TK是伪狂犬病毒最重要的毒力基因之一，目前构建的伪狂犬病毒基因工程疫苗大多为TK缺失突变株。第一代基因缺失疫苗的代表毒株有BUK-dl3，NIA-3，ADV_783，Begonia等毒株。其中BUK-dl3是世界上第一个获得批准使用的基因工程缺失疫苗株，它是以PPV BUK株为起始材料，通过缺失TK基因序列的148bp而获得。BUK疫苗株是将其亲本病毒通过鸡胚细胞传代800代以上获得的，其US区的gE基因存在缺失。因此，BUK-dl3除了 TK基因缺失外，还有来自BUK疫苗株的gE缺失。该毒株在细胞培养物上，即使在含有HAT的选择条件下也不能回复为TK+。第二代基因缺失疫苗是在TK缺失疫苗的基础上发展起来的，如TK_/gE_，TKVgr,TK_/gG_等，它们比TK缺失的疫苗更优越。原来的TK缺失疫苗只能采用核酸杂交、限制性内切酶指纹图谱、空斑放射自显影等技术同野毒株区别。第二代基因缺失疫苗除TK缺失夕卜，在编码非必需糖蛋白的基因内引入一个新的缺失，或插入一个报告基因，这样得到的突变株不能产生缺失糖蛋白，免疫动物后不能产生相应抗体，因此可以通过血清学方法将免疫按种猪与自然感染野毒的猪相互区别。Marchioli C C等和Van Zijl M等分别构建了缺失TK和gG基因的PRV疫苗株和缺失TK和gE基因的疫苗株(783株)。Mettenleiter T C等报道，在建立表达PRV gD基因细胞系的基础上，从PRV的BamHI-7片段中缺失了 5. Ikb的片段(含有gG、gD、gE、gI基因的编码序列)，构建出了 PRV的gG_/gD7gE7gI_的四基因缺失株PRV 376株。颜其贵等构建了 PRV Fa gI_/gD_基因缺失株，小鼠试验证实缺失株对小鼠具有一 定的免疫原性。周复春等构建了一系列基因缺失株(PRV Ea TK—、TK7LacZ+、TK7gG7LacZ+
坐')
寸/ οLiu Z等将LacZ基因表达试剂盒插入到PRV Ea株基因组的gE区，通过蓝斑筛选和纯化，得到了 TK_/gE7LacZ+PRV。利用LacZ基因处的EcoRI酶切位点来消化PRV Ea TK7gE7LacZ+基因组DNA，并与质粒pFBBS在PK-15细胞上进行共转染。经过蚀斑纯化得到了TKVgEVgDTRV0通过小鼠试验表明，此TK_/gE_/gD_PRV的毒力明显减弱。目前国内有两种猪伪狂犬基因缺失苗已获新兽药证书并投放市场，即四川农大郭万柱教授主持研发的猪伪狂犬活疫苗(S215株)和华中农业大学陈焕春教授主持研发的的猪伪狂犬活疫苗(HB98株)。第三代基因缺失疫苗是以第一、第二代基因缺失苗作为载体，表达其它病毒抗原性基因，从而可以防治多种疾病。此项研究目前正是该领域的热点问题之一。其首要问题是解决安全性和免疫效果的难关，但其前景受到普遍看好。在欧美等发达国家，得利于PRV基因缺失苗和相应鉴别诊断方法的应用，该病已得到控制或根除；但在发展中国家，该病仍频繁发生，严重制约了这些国家和地区养猪业的健康发展。就我国的实际情况看，PRV在我国的根除显然不是一个短期能实现的目标，PRV基因缺失苗在现在及将来更长一段时间内都会有广阔的市场前景。而且随着我国养殖科技化程度的逐步提高和伪狂犬根除计划的逐步开展，对PRV疫苗的需求也会更加旺盛。目前国内市场上虽然存在数种猪伪狂犬基因缺失苗，但进口疫苗售价高昂，而国产疫苗品质并不尽如人意，市场对于物美价廉的高品质国产疫苗的需求极为迫切。
发明内容
为此，本发明分离了和鉴定了猪伪狂犬病毒株，命名为PRV-GDXX，并以猪伪狂犬病毒⑶XX株为母本，通过分子生物学手段，依次缺失胸腺嘧啶核苷酸激酶(PRV TK)基因和gE基因，获得重组病毒PRV/TK7gE_，以该重组病毒为疫苗毒株研制生产安全高效的猪用伪狂犬活疫苗。本发明的技术方案如下一种重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株，该病毒株的保藏名称为猪伪狂犬病毒GDXX株TK/gE双基因缺失病毒PRV/TK7gE_ ;保藏单位中国典型培养物保藏中心；保藏日期2012年3月I日；保藏号为CCTCC V201212所述的重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株的构建方法，包括如下步骤(I)分离和鉴定猪伪狂犬病毒株，命名为PRV-GDXX ；(2) TK缺失用转移载体的构建以PRV-GDXX基因组为模板，设计PCR引物扩增TK同源重组左臂Ltk ;和右臂Rtk ;用EcoRI酶切pUC19，补平后连接转化，获得消除EcoRI位点的pUC19/E ；同样方法消除HindIII，获得质粒PUC19/HE ；以KpnI/Xbal双酶切Ltk和pUC19/HE，回收相应片段连接，获得质粒pUC19/HE-LTK ;再以Xbal/SphI酶切Rtk和pUC19/HE_LTK，回收相应片段连接，获得质粒PUC19/HE-TK ;消除pUC19/HE-TK中的KpnI位点，即为转移质粒PUC19/HEK-TK ;用 XbaI 酶切 pUC19/HEK_TK，补平；同时依次用 SspI 和 StuI 酶切 pcDNA3/EGFP，补平；将补平后的两片段连接转化，获得TK缺失用转移载体pUC19-TK/EGFP。
·
(3) gE缺失用转移载体构建以PRV-GDXX基因组为模板，设计PCR引物对扩增gE同源重组左臂LgE和右臂RgE ；以KpnI/Xbal双酶切LgE和pUC19/HE，回收相应片段连接，获得质粒pUC19/HE-LgE ;再以Xbal/SphI酶切RgE和pUC19/HE_LgE，回收相应片段连接，获得质粒pUC19/HE-gE ;消除pUC19/HE-gE中的KpnI位点，即为转移质粒pUC19/HEK_gE ;用XbaI酶切pUC19/HEK-gE，补平；同时依次用SspI和StuI酶切pcDNA3/EGFP，补平；将补平后的两片段连接转化，获得gE缺失用转移载体pUC19-gE/EGFP ；(4) TK缺失重组病毒拯救转染在六孔细胞培养板上培养BHK21细胞，待BHK21细胞长满90%时进行转染；取PRV-GDXX病毒基因组约3ug，与约Iug转移质粒pUC19-TK/EGFP混合后转染，同时设仅含转移质粒的对照组；鉴定PRV_GDXX基因组与pUC19_TK/EGFP共转染48小时后，观察细胞病变及荧光蛋白表达情况；转染细胞裂解后盲传两代，仍有细胞病变和绿色荧光，初步判断重组病毒拯救成功；重组病毒经噬斑纯化和PCR鉴定，命名为PRV/TK7EGFP。将PRV/TK_/EGFP基因组与pUC19-TK/HEK共转染，细胞裂解物盲传两代，出现无绿色荧光细胞病变可初步判断重组病毒拯救成功，经同样方法纯化、鉴定，获得重组病毒PRV/TK_ ；(5) TK/gE双基因缺失重组病毒拯救转染在六孔细胞培养板上培养BHK-21细胞，待BHK-21细胞长满90%时进行转染；取PRV/TK-病毒基因组约3ug，与约Iug转移质粒共转染，同时设仅含转移质粒的对照组；鉴定PRV/TK_基因组与pUC19_gE/EGFP共转染48小时后，观察细胞病变及荧光蛋白表达情况。转染细胞裂解后盲传两代，仍有细胞病变和绿色荧光，初步判断重组病毒拯救成功；重组病毒经噬斑纯化和PCR鉴定，命名为PRV/TK_/gE_/EGFP ;将PRV/TK_/gE_/EGFP基因组与pUC19-gE/HEK共转染，细胞裂解物盲传两代，出现无绿色荧光细胞病变可初步判断重组病毒拯救成功,经同样方法纯化、鉴定,获得重组病毒PRV/TK_/gE_。
图I、伪狂犬病毒gE基因CDS序列PCR扩增电泳图，其中M为DL2000 ;1为PCR产物；
图2、TK缺失转移载体构建示意图；图3、gE缺失转移载体构建示意图；图4、左右重组臂PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳，其中A DL-2000 B :左重组臂PCR扩增产物(Ltk) C :右重组臂PCR扩增产物(Rtk)；图5、左右重组臂PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳；A :DL_2000 B :左重组臂PCR扩增产物(LgE) C :右重组臂PCR扩增产物(Rse)；图6、纯化后重组病毒感染ST细胞荧光观察；A :纯化后PRV/TK7EGFP感染ST细胞B :纯化后PRV/TK_感染ST细胞；图7、重组病毒感染ST细胞荧光观察；A PRV/TK7gE7EGFP感染ST细胞B =PRV/TK_/gE_感染ST细胞；图8、重组病毒 PCR 检测；A :DL_2000 Marker B =Regfp 和 Fkfp 引物扩增 PRV/TK7gEVEGFP病毒基因组 C RgE和Fse引物扩增PRV/TK_/gE_/EGFP病毒基因组D RgE和FgE引物扩增PRV/TK_/gE_病毒基因组；图9、PRV-GDXX, PRV/ΤΓ 和 PRV/TK_/gE_ 感染 ST 细胞的增殖曲线；图10、首次免疫后四周免疫猪的全病毒抗体水平；图11、第二次免疫后二周免疫猪的全病毒抗体水平；图12、第二次免疫后四周免疫猪的全病毒抗体水平。
具体实施例方式除另有说明外，本申请中所有的科技术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。下列实施例旨在进一步举例说明实现本发明的具体方式，而不应理解为对本发明的限制。在不违背本发明的精神和原则的前提下，对发明进行改动得到的技术方案都将落入本发明的权利要求范围之内。在本申请中，如无特别说明，本发明的实施都使用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术都是本领域技术人员所掌握的常规技术。这些技术在下了文件中有详细描述Sambrook 等人编著的 Molecular Cloning Alaboratory Mannual,第二版(1989) ；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames 和 S. J. Higgin 编著，1984)；Immnochemical Methods in Cell And Molecular Biology(Academic Press, London)。实施例一猪伪狂犬病毒⑶XX株的分离和鉴定I材料与方法I. I试验材料2007年6月，广东省新兴县某猪场发生疑似伪狂犬感染病例，我们从可疑病料提取病猪脑组织；PRV阳性血清，PRV阴性血清和PRV强毒(⑶XX株)、BHK21细胞由本实验室保存。I. 2病料处理无菌取病猪脑部与PBS (0. 1M，pH7. 2)以I : 5 (V/V)制成匀浆，反复冻融3次，3000rpm离心15min，取上清加双抗，37°C作用18h，经0. 45um滤膜除菌，得到病料滤液，保存备用。I. 3Babl/c小鼠接种试验与结果
取10只6周龄Balb/c小鼠，其中4只腹腔注射病料滤液O. 2ml/只，另4只背部脊柱附近皮下注射病料滤液O. 2ml/只。接种后观察小鼠的采食、饮水、精神状况和临床表现。小鼠接种病料滤液后12小时，表现精神沉郁、扎堆，其中2只出现后肢麻痹，可能是病毒侵入神经所致；48小时后4只小鼠被毛逆立；60小时后6只小鼠死亡,72小鼠后全
部小鼠死亡。I. 4细胞接种试验与细胞病变观察结果接种O. 5ml病毒滤液于长成单层的BHK21细胞，连续观察，直至出现细胞病变为止。病料滤液接种BHK21细胞后18小时后出现明显细胞病变细胞肿胀，变圆，逐步空 泡化，48小时后细胞脱落。I. 5分离毒的毒价测定BHK21细胞在96孔板上长成单层。分离病毒做10倍系列稀释(10-1-10-10)，每个稀释度接种8孔，每孔O. 1ml，同时设两孔空白对照。记录各个梯度的病变数，连续观察5天。Karver法计算出分离毒的TCID50。不同稀释度的病毒在96孔板BHK21细胞单层出现CPE，结果见表3，计算该病毒毒价为 107. 5TCID50/0. 1ml。表3分离毒的毒价测定结果
~Si~~SS~~CPEt~~CPEz~ 累计总数 ~CPEt~稀释度孔数CPE+ CPE 一百分比
______ (%)
10—1__8__8__O__60__O__100
10—2__8__8__O__52__O__100
10—3__8__8__O__44__O__100
10—4__8__8__O__36__O__100
Γ 10—588O38O100-------
10—6__8__8__O__20__O__100
10—7__8__8__O__12__O__100
10—8__8__3__5__4__5__44
10—9__8__I__7__I__12__8
-10-1(1 |8|θ|8|θ|2θ|θI. 6微量中和试验鉴定分离毒(固定病毒稀释血清法)将PRV阴性血清与阳性血清分别进行10倍系列稀释(ΚΓ-ΙΟ,)。加入等量200TCID5(I分离毒，37°C感作I小时。分别接种96孔板单层PK-15细胞，每孔O. 1ml，每个稀释度接种8孔，设I孔空白对照和I孔标准强毒对照(200TCID5(i)。记录各个梯度的细胞病变数，连续观察5天。PRV阳性血清能特异性中和分离毒，抑制细胞病变，说明所分离的病毒为伪狂犬病毒。
I. 7PRV gE基因CDS序列扩增设计PRV gE基因⑶S序列扩增引物及反应条件见表I和表2，扩增产物克隆后测序表I引物序列表
引物571 酶切位大小目的片段---—--—--
Fke GAATTCATGCGGCCCTTTCTGCTGCG EcoRI^
------1734 gE基因CDS序列
RgE GGTACCTTAAGCGGGGCGGGCATTCA KpnI___ 表2 gE基因⑶S扩增PCR反应体系及反应条件
_反应体系__反应条件_
PRV ⑶XX 株基因组 DNA Iul94°C3min I cycle
2XGC Buffer I (5mM Mg2+ plus) 25ul98°CIOsec
FgE 0. 5ul60°C30sec 30 cycles
RgE 0. 5ul72°C2. 5min_
dNTP Mixture (2. 5mM each) 12ul72°C7min I cycleTaKaRa LA Taq (5U/ul) 0. 5ul
dH20_10. 5ulI %琼脂糖电泳鉴定PCR结果如图1，测序结果表明扩增片段长1734bp，与genebank上登录的gE Q)S序列同源性为97_99%。2结果与分析本申请人从广东省新兴县某猪场病猪脑组织提取病科滤液。将该病毒滤液接种Balb/c小鼠出现神经症状，死亡率100% ;接种BHK21细胞，18小时后细胞变圆、空泡化；猪的伪狂犬病毒阳性血清能特异性地中和该分离病毒。PRV gE基因引物能扩增1734bp gE基因CDS序列,测序结果证实该病毒为猪伪狂犬病毒,其与genebank上登录的gE CDS序列同源性为97-99%。本试验结果说明，我们分离到一株野生猪伪狂犬强毒，命名为广东新兴株(GDXX)。该毒株是我们进行下一步基因缺失活疫苗研制的母本毒株。实例二猪伪狂犬病毒⑶XX株TK/gE双基因缺失株PRV/TK_/gE_的构建及其生物学特性研究本申请人以猪伪狂犬病毒⑶XX株(PRV-GDXX)为母本，通过分子生物学手段依次缺失TK、gE基因，构建了一株重组伪狂犬病毒PRV/TK_/gE_，并对该重组病毒的部分生物学特性进行了系统研究。现将试验结果报告如下I、材料与方法I. I、材料I. I. I、病毒和细胞猪伪狂犬病毒⑶XX株(PRV-GDXX)，BHK21细胞、ST细胞由本实验室保存。I. I. 2、质粒和菌株pcDNA3/EGFP由中山大学程家森博士惠赠；pUC19载体与DH5 α菌株由本实验室保存。I. I. 3、工具酶和其它试剂LA Taq DNA 聚合酶、EcoRI、HindIII、BamHI、KpnI、SspI、StuI、XbaI、SphI、AgaroseGEL DNA Purification Kit、DNA Ligation Kit、BKL Kit、Dephospharylation Kit 购置TaKaGDXX 公司。LipofectamineTM 2000 购自 Invitrogen 公司。胎牛血清、DMEM 培养基购自GIBCO公司。I. 2、基因扩增I. 2. I、病毒增殖及病毒基因组提取BHK21细胞按常规方法培养，以5-10PFU/细胞感染病毒，当细胞病变(CPE)达
90%左右收获病毒；病毒基因组提取方法简述如下收集病变细胞后，用裂解缓冲液(含O. 2mg/ml蛋白酶K)重悬细胞，37°C孵育至清亮，裂解物用酚、酚氯仿(I I)、氯仿各抽提一次，取上清加2倍体积无水乙醇，-20°C放置30min，15000rpm离心lOmin，70 %乙醇洗涤DNA沉淀，干燥后将沉淀溶于TE，_20°C保存备用。I. 2. 2、引物及基因扩增参考PRV全基因组序列(BK001744)，合成系列引物，用于扩增TK同源重组的左、右臂，用于鉴定TK基因缺失和EGFP插入的引物。引物序列及预期PCR产物的大小见表3。表3用于扩增TK基因同源臂和检验TK基因缺失及插入的PCR引物
权利要求
1.一种重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株，其特征在于，该病毒株的保藏名称为猪伪狂犬病毒GDXX株TK/gE双基因缺失病毒PRV/TK7gE_ ;保藏单位中国典型培养物保藏中心；保藏日期:2012年3月I H ;保藏号为=CCTCC V201212。
2.如权利要求I所述的重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)分离和鉴定猪伪狂犬病毒株，命名为PRV-GDXX； (2)TK缺失用转移载体的构建以PRV-GDXX基因组为模板，设计PCR引物扩增TK同源重组左臂Ltk ;和右臂Rtk;用EcoRI酶切pUC19，补平后连接转化，获得消除EcoRI位点的pUC19/E ；同样方法消除HindIIl，获得质粒PUC19/HE;以KpnI/Xbal双酶切Ltk和pUC19/HE，回收相应片段连接，获得质粒pUC19/HE-LTK;再以Xbal/SphI酶切Rtk和pUC19/HE_LTK，回收相应片段连接，获得质粒PUC19/HE-TK;消除 pUC19/HE-TK 中的 KpnI 位点，即为转移质粒 pUC19/HEK_TK;用 XbaI 酶切PUC19/HEK-TK，补平；同时依次用SspI和StuI酶切pcDNA3/EGFP，补平；将补平后的两片段连接转化，获得TK缺失用转移载体pUC19-TK/EGFP; (3)gE缺失用转移载体构建以PRV-GDXX基因组为模板，设计PCR引物对扩增gE同源重组左臂LgE和右臂RgE ；以KpnI/Xbal双酶切LgE和pUC19/HE，回收相应片段连接，获得质粒pUC19/HE-LgE ;再以Xbal/SphI酶切RgE和pUC19/HE_LgE，回收相应片段连接，获得质粒pUC19/HE-gE ;消除pUC19/HE-gE中的KpnI位点，即为转移质粒pUC19/HEK_gE ;用XbaI酶切pUC19/HEK-gE，补平；同时依次用SspI和StuI酶切pcDNA3/EGFP，补平；将补平后的两片段连接转化，获得gE缺失用转移载体pUC19-gE/EGFP ； (4)TK缺失重组病毒拯救 转染在六孔细胞培养板上培养BHK21细胞，待BHK21细胞长满90%时进行转染；取PRV-GDXX病毒基因组约3ug，与约Iug转移质粒pUC19_TK/EGFP混合后转染，同时设仅含转移质粒的对照组； 鉴定PRV-GDXX基因组与pUC19-TK/EGFP共转染48小时后，观察细胞病变及荧光蛋白表达情况；转染细胞裂解后盲传两代，仍有细胞病变和绿色荧光，初步判断重组病毒拯救成功；重组病毒经噬斑纯化和PCR鉴定，命名为PRV/TK-/EGFP; 将PRV/TK-/EGFP基因组与pUC19-TK/HEK共转染，细胞裂解物盲传两代，出现无绿色荧光细胞病变可初步判断重组病毒拯救成功，经同样方法纯化、鉴定，获得重组病毒PRV/TK—； (5)TK/gE双基因缺失重组病毒拯救 转染在六孔细胞培养板上培养BHK-21细胞，待BHK-21细胞长满90%时进行转染；取PRV/TK-病毒基因组约3ug，与约Iug转移质粒共转染，同时设仅含转移质粒的对照组； 鉴定PRV/TK-基因组与pUC19-gE/EGFP共转染48小时后，观察细胞病变及荧光蛋白表达情况； 转染细胞裂解后盲传两代，仍有细胞病变和绿色荧光，初步判断重组病毒拯救成功；重组病毒经噬斑纯化和PCR鉴定，命名为PRV/TK-/gE-/EGFP ;将PRV/TK_/gE_/EGFP基因组与pUC19-gE/HEK共转染，细胞裂解物盲传两代，出现无绿色荧光细胞病变可初步判断重组病毒拯救成功，经同样方法纯化、鉴定，获得重组病毒PRV/TK-/gE-。
3.包含如权利要求I或2所述的重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株的基因工程疫苗。
4.如权利要求I或2所述的重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株在制备猪伪狂犬病毒基因工程疫苗上的应用。
全文摘要
本发明分离了一株猪伪狂犬病毒GDXX株，并以该分离株为母本，通过分子生物学手段，依次缺失胸腺嘧啶核苷酸激酶(TK)基因和gE基因，获得重组病毒PRV/TK－/gE－。以该重组病毒为疫苗毒株研制生产安全高效的猪用伪狂犬活疫苗。
文档编号C12R1/93GK102888383SQ20121012887
公开日2013年1月23日 申请日期2012年4月27日 优先权日2012年4月27日
发明者邵定勇, 黄红亮, 陈瑞爱, 韩静芳, 唐兆新, 谢小雨, 任常宝, 梁桂益 申请人:肇庆大华农生物药品有限公司, 广东大华农动物保健品股份有限公司