专利名称：一种病毒通用pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及病毒检测方法，具体涉及一种病毒通用的PCR检测方法
背景技术：
近年来，传染病日益严重，且传染途径复杂，病原变异性大，这些毫无疑问都给临床检测带来了巨大挑战。传统的病原检测方法如通过临床症状、病理变化、病毒分离、人工致病试验等试验诊断病原，血清分离、电镜观察等，工作量大，技术复杂，耗时长，不适宜现在传染病的有效监测和防控。这就需要一种快速灵活的方法来检测病原核酸，以严格控制传染病的发生。1990年，美国学者WeI sh与Wi 11 iams等分别同时建立了一种能够应用于不同的病原微生物的临床诊断技术。Welsh等将随机引物与PCR技术相结合、建立了用于杂交基因组DNA指纹分析的任一引物PCR方法(arbitrary primer, AP PCR), Williams等创造了名为随机扩增DNA的多态性PCR的方法(random amplified poly morph DNA, RAPD),两种方法区别在于前者的引物较长，多为20个左右碱基的单条或双条引物，而后者多选用9 10个碱基的单条引物。后国际上统称其为随机PCR技术。随机PCR技术因其独特的检测DNA多态性的方式以及简便快速等特点而迅速渗透到分子生物学研究领域的各个方面，在建立后的短短几年内，它已在微生物、植物、动物及人类研究等领域显示出广泛的应用前景。随机PCR技术是指在实验室检测中不知样本病原序列的情况下，利用一系列的随机引物，在PCR反应体系中，首先在不严格条件下使引物与模板DNA中许多序列通过错配而复性。理论上，不一定要求整个引物都与模板复性，而只要引物的一部分特别是3’端有3-4个以上碱基与模板互补复性，既可使引物延伸，一旦在两条单链上相距一定距离且有反向复性引物存在，则可在Taq DNA聚合酶的作用下进行DNA片段的扩增，经一至数轮不严格条件下的PCR循环后，再于严格条件下进行扩增。经对PCR扩增产物回收克隆后测序已检测病原的一种检测技术。随机引物是指使用非特异序列的寡聚核苷酸(长度为5 10个碱基)作DNA合成过程中的引物，它与一般常用引物的区别在于其随机性或是与特异性相对的概念，包括两方面的含义⑴核苷酸的排列顺序是随机的；⑵所有引物的的序列无直接相关性；(3)随机引物可用于所有物种。而后，由于国际各类传染病以病毒性传染疾病最为严重，为更快、更好的检测病毒感染样品，国内外研究者对随机PCR技术进行了大量改进，建立了多种病毒检测PCR方法。1991年，Reyes G R和Kim J P于建立了非依赖性基因扩大法(SISPA)，该方法在DNA模板钝末端连接一非对称引物，经过若干循环的变性、退火和延伸后，模板的数量得到扩增，后经克隆、测序、分析得到基因序列。Allander T、Zhang T等人采用SISPA技术测定了未知DNA及RNA病毒的序列，研究证实应用这一方法对于不同类型和来源的病毒均有效果，所获得的病毒全基因序列大小从3000bp-15kb不等，但该方法所得产物杂质较多，容易扩增到宿主染色体序列。随后 Allander T、Breitbart M、Jones M S、v an derHoek L 等人在SISPA基础上，应用DNase处理样品后再进行SISPA(DNase SISPA)，从临床样品中鉴定出牛和人的新病毒。Djikeng A等人(2008)在DNase SISPA基础上进行了新的改进，将RNase酶处理加入到SISPA技术的程序中，以清除外源RNA的污染如核糖体RNAs。2007年，Clem AL等建立了多重随机PCR，对快速监测和鉴定病毒有很强的实用性。研究证明，目前所采用的病毒通用PCR方法可快速有效的检测临床上未知病原感染样品，对生产、传染病监测具有重大意义；但该方法存在一定的局限性，因为来自宿主的染色体DNA相对含量较高，对病毒样品的质量要求高，且由于该方法的可重复性不高，应用该技术直接发现或鉴定新病毒方面还没有得到很好的推广。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种病毒通用的PCR检测方法，避免宿主基因组、细菌或外源病毒感染，较好的特异性和重复性。为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下一种病毒通用的PCR检测方法，其包括以下步骤I)样品处理将样品用0. 2-0. 25um滤器过滤,滤液经30-30K超滤管5000rpm离心20-30分钟，浓缩至l_2ml，余液洗涤滤管内滤膜几次后收集浓缩液，合并后得到浓缩病毒液，浓缩病毒液中分别加入 2-5 ii I 的 DNase 2-5 U I 的 RNase 及 5-10 y I lOXBufier，37°C消化 I. 5 小时后，80°C 5min终止消化；2)提取核酸消化好的病毒液，用总核酸试剂盒分别提取病毒DNA和RNA ；3)扩增处理取DNA或RNA提取液5-10 iil，2-52ul 5-10 y M的随机引物，加入到反应体系中，离心混匀后，进行扩增处理；4)电泳观测取上述扩增处理后的样品5-10 U 1，用含有0. 5-1. 0 u g/ml溴化锭的0. 8-1 % w/v琼脂糖凝胶，经过10-20min电泳和显色，5)扩增产物克隆将电泳观测结果为阳性的扩增产物纯化回收，回收产物连接于T载体，加入到连接体系中，于10_16°C过夜连接；连接产物加入到50-100 ill的DH5a感受态中，(TC冰浴30min后，于40-42 °C水浴热激80_90s，置冰上3 5min后，加入300-500 的LB培养基，37°C振荡培养lh，将培养液于2000-3000rpm离心3min，弃去培养基，剩余培养基重新与样品处理中过滤后沉淀混合，混合液涂布于AIX+LB固体培基，充分吸收后，于37°C倒置培养12 16h ;取5-10个克隆，分别于AMP+LB培养基培养3 6小时，试剂盒提取质粒后，于37°C对质粒进行双酶切l_2h ；6)基因组测序分析取上述克双酶切后的样品5-10 Ul，与2-6 ill的0. 25% w/v溴酚蓝上缓冲液混合，在含有0. 5-1. 0 V- g/ml溴化锭的0. 8-1% w/v琼脂糖凝胶,经过10_20min电泳和显色，在投射紫外灯下观察酶切结果阳性的样品进行进行测序。本发明所述的病毒通用的PCR检测方法还包括样品前处理步骤，所述样品来源于细胞，前处理步骤为取细胞5-10X IO6个，液氮中或-80°C温度下反复冻融三次于10000-12000rpm离心5_10min,取上清为样品，开始I)样品处理步骤；或者，所述前处理步骤为将细胞进行单层培养，细胞长满培养瓶后，用胰蛋白酶消化细胞，细胞从培养瓶表面脱落后，收集细胞液，液氮或-80°C中反复冻融三次，12000rpm离心lOmin，取上清为样品，开始I)样品处理步骤。本发明所述的病毒通用的PCR检测方法还包括样品前处理步骤，所述样品来源于动植物组织，前处理步骤为取组织样品100-200mg在液氮中研磨至匀浆，匀浆液在液氮中或_80°C温度下反复冻融三次，10000-12000rpm离心lOmin，取上清为样，品开始I)样品处
理步骤。本发明所述的病毒通用的PCR检测方法还包括样品前处理步骤，所述样品来源于全血，前处理步骤为将全血于37 °C溶解，加入3-5倍全血体积于红细胞裂解液，10000-12000rpm离心IOmin,吸取中间白膜层为样品，开始I)样品处理步骤。本发明所述的病毒通用的PCR检测方法还包括样品前处理步骤，所述样品来源于血清或血浆，前处理步骤为直接将血清或血浆与37°C溶解得样品，开始I)样品处理步骤。上述方法中，所述3)步骤中，取DNA提取液时，采用一次PCR扩增，即将5-10iilDNA提取液，2-52ul5-10iiM的随机引物，加入PCR反应体系中，ddH20补足50yl，离心混匀后，通过94-95°C解链2min ;然后94_95°C变性30_40s ;退火复性30°C 2min ；33°C,20s ；36°C, 20s ；39°C, 20s ；42°C,20s ；45°C,20s ；48°C,20s ；51°C,20s ;54°C，20s，72°C延伸2min，经过30-35个循环，最后72°C延伸5_10min ;4°C，lOmin，得到扩增样品。其中所述PCR反应体系成分为PCR Master Mix (2X) 25 U I0上述方法中，所述3)步骤中，取RNA提取液时，采用一次RT-PCR扩增，即将5-lOiUDNA提取液，2-52ul5-10iiM的随机引物，加入RT-PCR反应体系中，RNase freedH20补足50iU，离心混匀后，通过94-95°C解链2min ;然后94_95°C变性30_40s ;退火复性 300C 2min ；33°C,20s ；36°C,20s ；39°C,20s ；42°C,20s ；45°C,20s ；48°C,20s ；51°C,20s ；54°C，20s，再 72°C延伸 2min，经过 30-35 个循环，最后 72°C延伸 5-lOmin ;4°C保存 lOmin,得到扩增样品。其中所述RT-PCR 反应体系成分为 PrimeScript I step Enzyme Mix 2 U I,2Xlstep Buffer 25u I。本发明所述的病毒通用的PCR检测方法中，所述的随机引物的DNA碱基序列为VVVVVVVVAA，其中V为T、G、C中的任一种。本发明中，I)步骤中所用的DNase (脱氧核糖核酸酶)和RNase (核糖核酸酶)购自TaKaRa公司；2)步骤中所用的总核酸试剂盒为购自TaKaRa公司的Mini BEST Viral RM/DNA Extraction Ver.4.0o本发明的有益效果在于本发明所述的病毒通用的PCR检测方法，避免宿主基因组、细菌或外源病毒感染，具有较好的特异性和重复性。本发明的方法用于快速鉴别诊断不 同病毒，解决了特异性PCR逐个筛选鉴别病原的繁琐性，并可用于生产中快速检测临床未知病毒感染样品和快速有效检测新病毒或基因变异大的病毒毒株。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细说明。
图I、九份病料PCR检测结果，泳道I :分子量标准，泳道2 :H9N1，泳道3 =PRRSV,泳道4 PRV,泳道5 IBV,泳道6 NDV,泳道7 EDS,泳道8 PRRSV&PRV,泳道9 :正常细胞，泳道10 :正常鸡胚尿囊液；图2、九份病料RT-PCR检测结果，泳道I :分子量标准，泳道2 :H9N1，泳道3 =PRRSV,泳道4 PRV,泳道5 IBV,泳道6 NDV,泳道7 EDS,泳道8 PRRSV&PRV,泳道9 :正常细胞，泳道10 :正常鸡胚尿囊液；图3、敏感性试验电泳图，泳道I :病毒浓度为107. 0，泳道2 :病毒浓度为106. 0，泳道3 :病毒浓度为105. 0,泳道4 :病毒浓度为104. 0,泳道5 :病毒浓度为103. 0,泳道6 :病毒浓度为102. 0，泳道7 :病毒浓度为101. 0 ；图4、未知病毒感染CEF切片电镜观察，图A箭头处为IOOnm左右病毒样颗粒，颗粒表面有较明显囊膜结构。图B箭头处为20nm左右二十面体病毒颗粒。图C箭头处为丝状不明物；图5、尿囊液接种CEF细胞病变观察；A为病变细胞，梭状CEF细胞在中心部位或两端出现一个或数个空泡，随后细胞逐步萎缩、变圆，最后形成一个大的空泡。B为正常细胞对照。
具体实施例方式在本发明中中，如无特别说明，本发明的都使用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术都是本领域技术人员所掌握的常规技术。这些技术在下了文件中有详细描述Sambrook 等人编著的 Molecular Cloning Alaboratory Mannual,第二版(1989) ；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames 和 S. J. Higgin 编著，1984)；Immnochemical Methods in Cell And Molecular Biology(Academic Press, London)。本发明中所出现的T载体选自PMD 18-T Vector，所述连接体系为PMD 18-TVector*l In I、insert DNA 0. 3pmol, Solution I 5 u I, ddH20 (经过两次蒸懼的蒸馏水)补足lOiil。其中PMD 18-T Vector, PMD 18_Tvector*l均购自宝生物工程有限责任公司(TaKaRa BI0TECHN0L0GYC0.，LTD)。本发明中出现的PrimeScript One StepRT-PCR Kit Ver. 2. DNA Fragment Purification Kit Ver. 2. 0、DnaseI、Rnase、Kpn I、HindIII均购自宝生物工程有限责任公司(TaKaRa BI0TECHN0L0GYC0.，LTD)，一步法质粒DNA抽提试剂盒购自生工生物工程(上海)有限公司；胎牛血清、MEM培养基购自GIBCO公司。实施例I :病毒通用PCR方法特异性试验5.材料毒株、细胞特异性试验检测病毒(如下表所示)毒株由广东大华农动物保健品股份有限公司生药研发中心并保存。
权利要求
1.一种病毒通用的PCR检测方法，其特征在于其包括以下步骤 1)样品处理 将样品用0. 2-0. 25um滤器过滤，滤液经30-30K超滤管5000rpm离心20-30分钟，浓缩至l_2ml，余液洗涤滤管内滤膜几次后收集浓缩液，合并后得到浓缩病毒液，浓缩病毒液中分别加入 2-5 u I 的 DNase 2-5 U I 的 RNase 及 5-10 u IlOX Buffer, 37°C消化 I. 5 小时后，80 0C 5min终止消化； 2)提取核酸 消化好的病毒液，用总核酸试剂盒分别提取病毒DNA和RNA ； 3)扩增处理 取病毒DNA或RNA提取液5-10 u l，2_52ul 5-10 u M的随机引物，加入到反应体系中，离心混匀后，进行扩增处理； 4)电泳观测 取上述扩增处理后的样品5-10 u 1，用含有0. 5-1. 0 u g/ml溴化锭的0. 8-l%w/v琼脂糖凝胶，经过10-20min电泳和显色， 5)扩增产物克隆 将电泳观测结果为阳性的扩增产物纯化回收，回收产物连接于T载体，加入到连接体系中，于10-16°C过夜连接；连接产物加入至50-100 ill的DH5a感受态中，冰浴30min后，于40-42 °C水浴热激80-90s，置冰上3 5min后，加入300-500 的LB培养基，37°C振荡培养lh，将培养液于2000-3000rpm离心3min，弃去培养基，剩余培养基重新与样品处理中过滤后沉淀混合，混合液涂布于AMP+ LB固体培基，充分吸收后，于37°C倒置培养12 16h ；取5-10个克隆，分别于AMP+LB培养基培养3 6小时，试剂盒提取质粒后，于37°C对质粒进行双酶切l_2h ； 6)基因组测序分析 取上述克双酶切后的样品5-10 yl，与2-6 ill的0. 25%w/v溴酚蓝上缓冲液混合，在含有0. 5-1. 0 u g/ml溴化锭的0. 8-l%w/v琼脂糖凝胶，经过10_20min电泳和显色，在投射紫外灯下观察酶切结果阳性的样品进行进行测序。
2.根据权利要求I所述的病毒通用的PCR检测方法，其特征在于其还包括样品前处理步骤，所述样品来源于细胞，前处理步骤为取细胞5-10X IO6个，液氮中或-80°C温度下反复冻融三次于10000-12000rpm离心5_10min，取上清为样品，开始I)样品处理步骤；或者，所述前处理步骤为将细胞进行单层培养，细胞长满培养瓶后，用胰蛋白酶消化细胞，细胞从培养瓶表面脱落后，收集细胞液，液氮或_80°C中反复冻融三次，12000rpm离心lOmin，取上清为样品，开始I)样品处理步骤。
3.根据权利要求I所述的病毒通用的PCR检测方法，其特征在于其还包括样品前处理步骤，所述样品来源于动植物组织，前处理步骤为取组织样品100-200mg在液氮中研磨至匀浆，匀浆液在液氮中或_80°C温度下反复冻融三次，10000-12000rpm离心lOmin，取上清为样，品开始I)样品处理步骤。
4.根据权利要求I所述的病毒通用的PCR检测方法，其特征在于其还包括样品前处理步骤，所述样品来源于全血，前处理步骤为将全血于37°C溶解，加入3-5倍全血体积于红细胞裂解液，10000-12000rpm离心lOmin，吸取中间白膜层为样品，开始I)样品处理步骤。
5.根据权利要求I所述的病毒通用的PCR检测方法，其特征在于其还包括样品前处理步骤，所述样品来源于血清或血浆，前处理步骤为直接将血清或血浆于37°C溶解得样品，开始I)样品处理步骤。
6.根据权利要求1-5所述的病毒通用的PCR检测方法，其特征在于所述3)步骤中，取DNA提取液时，采用一次PCR扩增，即将5-10 u IDNA提取液，2-52ul5_10 u M的随机引物，加入PCR反应体系中，ddH20补足50 u 1，离心混匀后，通过94-95°C解链2min ;然后94-95°C变性 30-40s ;退火复性 300C 2min，33。。，20s ；36°C，20s ；39°C, 20s ；42°C，20s ；45°C，20s ；48°C, 20s ；51°C,20s ；54°C,20s,再 72°C 延伸 2min，经过 30-35 个循环，最后 72 °C 延伸5-10min ;4°C冷却保存lOmin,得到扩增样品。
7.根据权利要求6所述的病毒通用的PCR检测方法，其特征在于所述PCR反应体系成分为 PCR Master Mix (2X ) 25 u I0
8.根据权利要求I所述的病毒通用的PCR检测方法，其特征在于所述3)步骤中，取RNA提取液时，采用一次RT-PCR扩增，即将5-lOiUDNA提取液，2-52ul5-10iiM的随机引物，加入RT-PCR反应体系中，RNase free dH20补足50 yl，离心混匀后进行通过94_95°C解链 2min ;然后 94_95°C变性 30_40s ;退火复性 30°C 2min ；33°C, 20s ；36°C, 20s ；39°C, 20s ；42°C, 20s ；45°C,20s ；48°C,20s ；51°C,20s ;54°C，20s，再 72°C延伸 2min，经过 30-35 个循环，最后72°C延伸5-10min ;4°C冷却保存lOmin，得到扩增样品。
9.根据权利要求I所述的病毒通用的PCR检测方法，其特征在于所述RT-PCR反应体系成分为 Prime Scriptl step Enzyme Mix 2 u 1,2X1 step Buffer 25iil0
10.根据权利要求I所述的病毒通用的PCR检测方法，其特征在于所述随机引物的DNA碱基序列为VVVVVVVVAA，其中V为T、G、C中的任一种。
全文摘要
本发明涉及病毒检测方法，具体涉及一种病毒通用的PCR检测方法。其包括样品处理、提取核酸、扩增处理、电泳观测、扩增产物克隆、基因组测序分析等步骤。本发明所述的病毒通用的PCR检测方法，避免宿主基因组、细菌或外源病毒感染，具有较好的特异性和重复性。本发明的方法用于快速鉴别诊断不同病毒，解决了特异性PCR逐个筛选鉴别病原的繁琐性，并可用于生产中快速检测临床未知病毒感染样品和快速有效检测新病毒或基因变异大的病毒毒株。
文档编号C12Q1/68GK102628088SQ201210128889
公开日2012年8月8日 申请日期2012年4月27日 优先权日2012年4月27日
发明者任常宝, 唐兆新, 谢小雨, 邵定勇, 陈瑞爱, 黄红亮 申请人:广东大华农动物保健品股份有限公司, 肇庆大华农生物药品有限公司