专利名称：：番茄黑环病毒的检测方法
技术领域：
：本发明涉及植物检疫
技术领域：
，尤其涉及一种番茄黑环病毒(Tomatoblackring卿ovirus，TBRV)的检测方法。
背景技术：
：番茄黑环病毒(Tomatoblackringn印ovirus，TBRV)，属于豇豆病毒花叶科(Comoviridae)线虫传多面体病毒属(7Ve/opa>"Sv>，包括很多的株系烟草黑环株系(Tobaccoblackringstrain);莴苣环斑株系(Lettuceringspotstrain)马铃薯花束株系(Potatobouquetstrain);马铃薯伪奥古巴株系(Potatopseudo-aucubastrain);甜菜环斑株系(Beetringspotstrain);齐菜黄脉株系(Celeryyellowveinstrain),这些株系不能通过寄主植物的症状来有效区分，但可以通过血清学和介体关系来区分。TBRV主要发生在欧洲，现分布在全球30多个国家和地区。据报道TBRV的寄主范围很广，能够广泛侵染单子叶和双子叶草本和木本植物，包括许多重要的经济作物，如葡萄和其他果树、甜菜、马铃薯和蔬菜(葱属、甜菜属、芸薹属、莴苣属、番茄属和菜豆属的一些种)以及观赏植物，还能侵染乔木和灌木以及一些杂草品种，可造成这些植物的严重危害。据了解，番茄黑环病毒在美国、土耳其、加拿大、英国、德国、意大利、法国、荷兰等国虽有分布，但因该病毒的危害性较大，这些国家在各自的进境检疫法规中都明确规定为检疫性有害生物。该病毒的传播途径很多，可以接触传毒、种子带毒和线虫传毒。据文献记载超过15个属24种以上的植物可以TBRV种传，许多植物的种传率超过10。％，甚至达到100%。如研究发现甜菜、黄豆、莴苣和番茄的种传效率分别是3-7，83，3和20%。由于病毒在线虫介体中仅保持数周，TBRV的种传在病害流行病学中占有重要地位。可见线虫介体只能短距离传播，被害的植物种子和其它繁殖材料可以进行远距离的传播。因此植物种子和种球苗木是TBRV在国际间进行传播和扩散的重要根源。随着我国加入WTO，国际贸易越来越频繁，尤其是上海作为我国十分重要的口岸城市，每年进口大量的花卉、林木和蔬菜的种子和苗木，且进口的数量和品种有逐年增多的趋势。TBRV为我国进境检疫法规中明确规定的危险性有害生物，寄主范围广、传播途径多、适生性强，进口植物种子苗木携带该病毒的风险性很大，伴随着我国进出境贸易的高速增长，传入我国并危害流行的可能性极大。因而，必须对此病毒引起高度重视，研究准确可靠快速的检测方法，以防止TBRV随种苗的国际贸易传入我国，引起农作物、花卉和蔬菜生产的巨大损失。目前，国内针对TBRV的检测方法研究较少，采用的检测手段主要是血清学方法，因为TBRV具有多个血清型突变株和分离物，常规的血清学方法由于其灵敏度较低和特异性较差,仅靠此单一的方法大大限制了对该病毒的检测，并可能出现漏检的现象。国外学者采用免疫捕获反转录PCR的方法检测到黄瓜上的TBRV，但尚未见到系统的分子生物学方法检测TBRV的报道。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种番茄黑环病毒的检测方法，该方法可以特异性区分番茄黑环病毒，且具有检测时间短，检测的灵敏度高的特点。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现本发明提供一种番茄黑环病毒的检测方法，包括如下步骤(1)设计引物和/或探针；(2)番茄黑环病毒RNA提取和cDNA第一链合成；(3)采用设计的引物和/或探针进行PCR扩增，检测结果。本发明可以采用RT-PCR检测方法或实时荧光PCR检测方法对番茄黑环病毒进行检测。采用RT-PCR检测方法的具体步骤如下(1)根据国际基因库中已公布的TBRV的外壳蛋白基因(GenBank登录号NC04440、X80831和X04062)的保守序列，设计一对特异性引物<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage6</formula>(2)番茄黑环病毒RNA提取和cDNA第一链合成；(3)釆用设计的引物进行PCR扩增，PCR的反应条件为94℃预变性3min后进行94。C变性45s、52。C复性45s、72℃延伸2min的35个循环的扩增，72℃延伸10min后保存于4℃;扩增结束后，取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并用Bio-rad凝胶成像系统记录结果。釆用实时荧光PCR检测方法的具体步骤如下(1)根据国际基因库中已公布的TBRV的外壳蛋白基因(GenBank登录号NC04440、X80831和X04062)的保守序列，设计一对特异性引物和MGB探针。一对引物如下TBRV-CP133-F:5'-TCGTTTCTTGCAGTTTGCGTAT-3，；TBRV-CP133-R:5，-GTGGCAAAGAAGGGAGACTGTATT-3，；MGB探针如下TBRV-CP-MGB-FAM:5,(FAM)-CACAGATACCACATGTGGA-3，(MGB)。(2)番茄黑环病毒RNA提取和cDNA第一链合成；(3)采用设计的引物和/或探针进行实时荧光PCR检测，实时荧光PCR的反应条件为预变性95°ClOmin后，进行95°C15s，60°Clmin的40个循环。上述实时荧光PCR检测方法采用MGB(全称为MinorGrooveBinder)探针。MGB探针一是在探针的3'端标记了自身不发光的淬灭荧光分子，以取代常规可发光的TAMRA荧光标记；二是探针的3'端另结合了Minorgroovebinder结合物，使探针的Tm值提高，大大增加了探针的杂交稳定性。该方法具有如下优点1、更容易设计；2、探针更短3、提高配对与司E配对模板间的Tm值差异；4、实验结果更精确、分辩率更高；5、杂交的稳定性提高；6、低背景；7、重复性更强。该方法适合病原体的检测、SNP和突变体检测，既可以进行基因定量分析，又可以进行基因突变分析。.与现有技术相比，本发明的有益效果在于本发明首次利用实时荧光PCR的方法检测番茄黑环病毒。建立的RT-PCR和实时荧光PCR两种分子检测方法可以特异、灵敏、快速、准确的鉴定番茄黑环病毒。具体有如下三方面有益效果1.检测时间大大縮短，可以在7个小时内完成检测；2.检测的灵敏度大大提高；3.利用引物和探针可以特异性区分番茄黑环病毒。图1是本发明实施例1中TBRV的RT-PCR检测结果示意图，其中，M代表DL2000DNAmaker(DNA2000分子量标准)；l代表TBRV-Pom;2代表TBRV-Bez;3代表TBRV-L10;4代表TBRV-MJ12;5代表TBRV-N1;6代表TBRV-Og;7代表阳性对照；8代表健康昆诺藜；9代表空白对照；图2是本发明实施例2中TBRV的实时荧光RT-PCR检测结果示意图，其中，扩增曲线从上而下依次为阳性对照，TBRV-Pom，TBRV-Bez，TBRV-LIO，TBRV-MJ12，TBRV-N1，TBRV-Og，TRSV，ToRSV，ArMV，健康昆诺藜和空白对照。具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆s实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例l采用RT-PCR检测方法对番茄黑环病毒(TBRV)进行检测1、试验材料本次试验共收集到番茄黑环病毒6个分离物，TBRV的分离物由波兰PospiesznyHenryk教授惠赠。收集到的病毒毒株首先进行接种试验，接种鉴别寄主昆诺藜(Chenopodiumquinoa)、珊西烟(Nicotianetabacumvar.Xanthi-NC)、白肋烟(Nicotianatabacumcv.WhiteBurley)等，显症以后取带毒叶片作为试验材料，以未接种的植株作为阴性对照。试验所用的毒株材料见表l。表1实施例1所使用的TBRV分离物<table>complextableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2、引物设计根据国际基因库中已公布的TBRV的外壳蛋白(GenBank登录号:NC04440、X80831和X04062)的保守序列，设计一对特异性引物:TBRV-CP1218-F:5，-GATCAAGAATACGAACACACG-3'TBRV-CP1218-R:5，-TCCACCAAAATGTTCGGCAACAG-3'片段长度1218bp上述引物由上海invitrogen公司合成。3、RNA提取取0.lgTBRV接种的带毒叶片置于液氮中研磨成粉末，加入1000mlTRLzol，迅速转至1.5ml的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的离心管中，加200U氯仿，振荡2min,4°C11000r/min离心10min。取上清液加入500ml异丙醇，—20。C沉淀10min，4°C12000r/min离心15min，沉淀用75%的乙醇洗一次，4°C7500r/min离心5min，沉淀溶于30，1ddH20(去离子水)中，即为提取的RNA，-7(TC保存备用。4、cDNA第一链合成在2个DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的PCR管中分别加入:2uL模板RNA、2iiLAMV反转录酶(5U/yL，TaKaRa)、1uLRNase抑制剂(40U/uL，TaKaRa)、luL下游引物(20umol/L)(该下游引物是设计的TBRV-CP1218-R引物5，-TCCACCAAAATGTTCGGCMCAG-3，)和5uL5XAMV缓冲液，加ddH20至总体积20uL。室温放置10min，42。C水浴60min，-2(TC保存备用。5、RT-PCR取3uL合成好的cDNA(下游引物为TBRV-CP1218—R:5，-TCCACCAAAATGTTCGGCAACAG-3，)，于25nL体系中采用设计的引物TBRV-CP1218-F:5，-GATCAAGAATACGAACACACG-3'和TBRV-CP1218-R:5，-TCCACCAMATGTTCGGCAACAG-3，，进行PCR扩增。PCR反应条件为94。C预变性3min后进行94"C变性45s、52。C复性45s、72"C延伸2min的35个循环的扩增，72。C延伸10min后保存于4°C。扩增结束后，取10ixLPCR产物进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳，并用凝胶成像系统记录结果。6、试验结果根据已报道的TBRV外壳蛋白基因的保守序列设计了1对特异性引物TBRV-CP1218F/TBRV-CP1218-R，预期扩增大小1218bp。用设计的引物对带毒昆诺藜和健康昆诺藜的叶片进行RT-PCR检测，结果发现设计的引物能从ELISA检测为阳性的叶片中扩增到预期大小为1218bp的DNA条带，所扩增到的DNA条带亮度高且特异性好，而从健康叶片8和空白对照9中未能扩增到任何特异条带(见图l)。结合测序结果，可以准确检疫和鉴定番茄黑环病毒。7、RT-PCR检测方法的特异性试验以TBRV接种的白肋烟、昆诺藜、珊西烟和本氏烟，TRSV(烟草环斑病毒)接种的白肋烟，ToRSV(番茄环斑病毒)接种的番杏、ArMV(南芥菜花叶病毒)接种的白肋烟等发病的叶片为材料分别提取RNA，以TBRV-CP1218-R作为下游引物合成的cDNA，以合成的cDNA分别作为扩增模板，用引物对TBRV-CP1218F/TBRV-CP1218-R进行PCR扩增。结果显示除TBRV能扩增预计的DNA片断外，其余病毒如ToRSV、TRSV、ArMV和健康植物、空白对照均无扩增，可见该对引物的特异性强，表明所设计的针对TBRV的引物具有很好的特异性，植物组织对扩增也没有影响。8、RT-PCR检测方法的灵敏度试验为了研究RT-PCR检测TBRV的灵敏性，将TBRV-Pom、TBRV-0g和TBRV-Bez等3个株系的PCR产物和T载体连接，转化到感受态细胞，然后克隆，筛选，用裂解碱法抽提质粒。经测定，3个分离物的抽提质粒浓度TBRV-Pom为149ug/ml，TBRV-Bez为293ug/ml，TBRV—0g为63.5ug/ml，将质粒按照10—1，10—2……10—9稀释，用上述几个浓度的质粒作为模板分别进行RT-PCR。结果显示当TBRV-Pom和TBRV-Bez的抽提质粒稀释10—8时，RT-PCR方法还能扩增到TBRV，但继续稀释到l(T时则没有扩增。当TBRV-0g稀释到10—7时，RT-PCR方法还能扩增到TBRV，但继续稀释到10—8时则没有扩增。结果表明本试验所建立的克隆检测灵敏度的方法，检测三个分离物的最低病毒量依次为1.49X10—6ug/ml，2.93X10—6ug/ml，6.35X10—6ug/ml。经过计算，检测TBRV-Pom最低拷贝数为1862，检测TBRV-Bez最低拷贝数为3661，检测TBRV-Og最低拷贝数为7935。实施例2采用实时荧光PCR检测方法对番茄黑环病毒进行检测1、试验材料(同实施例1)2、设计引物和探针根据国际基因库中已公布的TBRV的外壳蛋白基因(GenBank登录号:NC04440、X80831和X04062)的保守序列，分别设计特异性引物和MGB探针，引物为TBRV-CP133-F:5'-TCGTTTCTTGCAGTTTGCGTAT-3'TBRV-CP133-R:5，-GTGGCAAAGAAGGGAGACTGTATT-3，MGB探针为TBRV-CP-MGB-FAM:5，(FAM)-CACAGATACCACATGTGGA-3'(MGB)上述引物和探针由上海基康公司合成。3、RNA提取(同实施例1)4、cDNA第一链合成下游引物为TBRV-CP133-R:5，-GTGGCAAAGMGGGAGACTGTATT-3，，其它同实施例1。5、实时荧光PCR实时荧光PCR反应体系25uL，其中3uLcDNA(下游引物为TBRV-CP133—R)，2X反应缓冲液12.5uL，上游引物(TBRV-CP133-F)0.25uL(20umol/L)，下游引物(TBRV—CP133-R)0.25uL(20umol/L)，探针(TBRV-CP-MGB-FAM)1.2uL(20uM)，加水至25uL。实时荧光PCR反应条件预变性95°C10min后，进行95°C15s，60°Clmin的40个循环。6、试验结果利用设计的引物和MGB探针可以特异性的扩增TBRV的6个分离物，如图2所示，扩增曲线从上而下依次为阳性对照，TBRV-Pom，TBRV-Bez，TBRV-L10，TBRV-MJ12，TBRV-N1，TBRV-0g，TRSV,ToRSV，ArMV，健康昆诺藜和空白对照，除番茄黑环病毒(TBRV)出现扩增外，烟草环斑病毒(TRSV)、南芥菜花叶病毒(ArMV)、番茄环斑病毒(ToRSV)、健康昆诺藜和空白对照都没有扩增，说明设计的引物和探针对TBRV特异性强。7、实时荧光PCR检测方法的特异性试验以TBRV接种的白肋烟、昆诺藜、珊西烟和本氏烟，TRSV接种的白肋烟，ToRSV接种的番杏、ArMV接种的白肋烟等发病的叶片为材料分别提取RNA，以TBRV-CP133-R作为下游引物合成的cDNA，以合成的cDNA分别作为扩增模板，用引物对TBRV-CP133-F/TBRV-CP133-R和加入探针进行实时荧光PCR扩增。结果显示(图2)除TBRV能扩增预计的DNA片断外，其余病毒如ToRSV、TRSV、ArMV和健康昆诺藜、空白对照均无扩增，可见该对引物的特异性强，表明所设计的针对TBRV的引物和探针具有很好的特异性，植物组织对扩增也没有影响。8、实时荧光PCR检测的灵敏度为了研究实时荧光RT-PCR检测TBRV的灵敏性，将TBRV-0g和TBRV-Pom2个株系的PCR产物和T载体连接，转化到感受态细胞，然后克隆，筛选，用裂解碱法抽提质粒。经测定，2个分离物的抽提质粒浓度TBRV-Pom为111.8ug/ml，TBRV-0g为78.5ug/ml，将质粒按照10—、10—2……10—11稀释，用上述几个浓度的质粒作为模板分别进行实时荧光PCR。结果显示当TBRV-Pom的抽提质粒稀释10—"时，实时荧光PCR方法还能扩增到TBRV，但继续稀释到KT"时则没有扩增。但当TBRV-0g稀释到10—9时，实时荧光PCR方法还能扩增到TBRV，但继续稀释到10—1()时则没有扩增。结果表明本试验所建立的克隆检测灵敏度的方法，检测2个分离物的最低病毒量依次为:1.118X10—8ug/ml，7.85X10—8ug/ml。经过计算，检测TBRV-Pom最低拷贝数为77，检测TBRV-0g最低拷贝数为538。权利要求1、一种番茄黑环病毒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤(1)设计引物和/或探针；(2)番茄黑环病毒RNA提取和cDNA第一链合成；(3)采用设计的引物和/或探针进行PCR扩增，检测结果。2、如权利要求1所述的番茄黑环病毒的检测方法，其特征在于，采用RT-PCR检测方法，步骤(1)中所述设计的引物为TBRV-CP1218-F:5，-GATCAAGAATACGAACACACG-3';TBRV-CP1218-R:5'-TCCACCAMATGTTCGGCAACAG-3'。3、如权利要求1所述的番茄黑环病毒的检测方法，其特征在于，采用RT-PCR检测方法，步骤(3)中PCR的反应条件为94'C预变性3min后进行94'C变性45s、52'C复性45s、72'C延伸2min的35个循环的扩增，72'C延伸10min后保存于4"C;扩增结束后，取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并用Bio-rad凝胶成像系统记录结果。4、如权利要求1所述的番茄黑环病毒的检测方法，其特征在于，采用实时荧光PCR检测方法，步骤(1)中所述设计的引物为TBRV-CP133-F:5，-TCGTTTCTTGCAGTTTGCGTAT-3';TBRV-CP133-R:5，-GTGGCAAAGAAGGGAGACTGTATT-3，；步骤(1)中所述设计的探针为TBRV-CP-艦B-FAM:5，(FAM)-CACAGATACCACATGTGGA-3，(MGB)。5、如权利要求1所述的番茄黑环病毒的检测方法，其特征在于，采用实时荧光PCR检测方法，步骤(3)中实时荧光PCR的反应条件为预变性95。C10min后，进行95°C15s，60°Clmin的40个循环。全文摘要本发明公开了一种番茄黑环病毒(TBRV)的检测方法，本发明针对TBRV不同分离物外壳蛋白基因的保守序列设计特异性引物和MGB探针，利用TBRV的不同分离物，建立了TBRV的反转录PCR(RT-PCR)和实时荧光PCR的检测方法。本发明利用引物和探针可以特异性区分番茄黑环病毒，且大大缩短了检测时间，检测的灵敏度也大大提高。文档编号C12Q1/70GK101200770SQ20061011955公开日2008年6月18日申请日期2006年12月13日优先权日2006年12月13日发明者翠于,杨翠云申请人:中华人民共和国上海出入境检验检疫局