专利名称：：一种百合种球病毒的检测方法
技术领域：
：本发明涉及一种百合种球病毒的检测方法，特别涉及一种百合种球病毒CMV、LSV及LMoV的检测方法。
背景技术：
：多元RT-PCR技术(RT-MPCR)在百合方面的应用王继华等(王继华.应用多重PCR方法检测百合无症病毒和斑驳病毒[J].园艺学报，2005,32(2):254~287)应用二重PCR技术检测了LSV和LMoV病毒，黎昊雁等(黎昊雁，吴姗，张晓峰，方莹，施伟良.复合RT-PCR方法同步检测百合X病毒、百合无症病毒及百合斑驳病毒.植物保护,32(6),2006,42~45)釆用复合RT-PCR检测了LXV、LSV及LMoV，但是二者都没有检测CMV，而CMV病毒是侵染百合的三大主要病毒之一，危害严重，发病广泛，有待检测。徐榕雪(徐榕雷.百合主要病毒的分子检测及脱毒技术研究.南京林业大学，2007)检测了栽培品种及野生种叶片，花的病毒，其叶、花、鳞片采用了一种试剂盒提取，其鳞茎总RNA的提取质量不高，没有针对百合种球建立RNA提取方法，而百合鳞茎组织中富含多糖，多酚等次生代谢物，这些组织的许多理化性质与RNA相似，从而在沉淀RNA时，往往产生富含多糖的凝胶状沉淀，这种含有多糖的RNA沉淀难溶于水，或溶解后产生粘稠状的溶液，在去除多糖的同时RNA也容易被带走，造成RNA得率的减少，因此从种球中提取高质量的RNA有相当的难度。
发明内容本发明的目的是提供一种稳定快速，可重复性好，成本低廉，可用于百合种球CMV、LSV及LMoV的病毒检测方法。本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的一种百合种球病毒的多重检测引物，包括CMV上游引物GAAACCAGATGGACAATCT,CMV下游引物ATCATACAACCATAAGCGCCGA;LMoV上游引物CAAGACATGCAATCAGCACA，LMoV下游引物CCCTATCTCATCCATTATTT;以及LSV上游引物CACCTCACCAAAAAATGGTGT,LSV下游引物TAGTTCCAAGTAAGGAGA。本发明还提供含有前述所述检测引物的检测试剂盒。本发明还提供含有前述检测引物或检测试剂盒在检测百合种球病毒中的应用。本发明还提供一种百合种球病毒的检测方法，其包括如下步骤1)提取百合种球鳞片RNA;2)RT-MPCR:将步骤1)中得到的RNA反转录后，用前述引物扩增反转录产物，并进行电泳检测。前述的检测方法，其中所述步骤l)提取RNA的方法是釆用改进的Trizol和CTAB法提取百合种球鳞片RNA，其中改进的Trizol法包括步骤(1)取-70。C保存的鳞茎内侧鳞片0.10.5g，在经0.1。/。DEPC的无菌水处理、干热灭菌后的研钵中加液氮充分研磨;(2)加入1mLTrizol提取液，室温放置5min,使其充分裂解,磨至匀浆，12，000rpm离心15min，弃沉淀，收集提取液于离心管;(3)加入0.2mL三氯甲垸并上下倒置混匀，12，000rpm，4°C离心20min;(4)小心收集上清，转移至新离心管中，加入与上清等体积的异丙醇，充分混匀，室温静置10min;(5)4。C，12,000rpm，离心10min，弃上清，RNA沉于管底；(6)重复步骤(3)-步骤(5)3次；(7)加入lmL乃。/。乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀，4°C,7500rpm，离心10min，弃上清;(8)沉淀干燥后，溶于20mlLRNA溶解液或DEPC水中，置于-7(TC冰箱备用；或改进的CTAB法包括步骤:(l)将-70。C保存的鳞片样品0.1g,在经0.1。/。DEPC的无菌水处理、干热灭菌后的研钵中加液氮充分研磨至粉末；(2)迅速转入1.5mL离心管中，加入600)iL65'C预热的CTAB提取液，其含有2。/。CTAB,2%PVP，100mMTrisCl(pH8.0),10mMNaCl，25mMEDTA(pH8.0),使用前加入2%P-巯基乙醇，盖紧盖子，立即剧烈涡旋振荡30s,使粉末完全分散在溶液中;(3)65^温洛25~30min,期间剧烈涡旋振荡3-5次，然后冷却至室温；(4)向上述混合液中加入等体积的氯仿/异戊醇抽提三次，每次涡旋振荡5min后，室温或18。C下12,000rpm离心15min,转移上清至新的离心管中；(5)加入l/4体积10MLiCl，混勾，4。C过夜沉淀；(6)4°C，10,000rpm离心20min收集沉淀，用500juLSSTE，其含有1.0MNaCl，0.5%SDS，10mMTrisCl，lmMEDTA,缓冲液溶解沉淀，加入等体积的氯仿/异戊醇再抽提12次；(7)转移上清后加入2倍体积无水乙醇，-20°C放置2h或-7(TC放置30min;(8)4°C,12,000rpm离心20min,沉淀RNA，先后用500juL75。/。乙醇、500mL无水乙醇漂洗沉淀，超静台上吹干后，用30juLRNase-freeddH2O溶解，置于-7(TC冰箱备用。前述的检测方法，其中所述步骤2)RT-MPCR体系包括RT反应和PCR反应，其中RT反应操作步骤如下(l)在冰浴的试管中加入如下反应混合物模板总RNAlpg/VL5pg;Oligo(dT)lS0.5Mg/jnl1mL;RNase-freeddH206pL;(2)轻轻混勻后，在70。C水洛5min后,冰洛5min;(3)向冰浴的试管中加入如下组分5xReactionBuffer4pL;RNaseInhibitor40U/|illpL;dNTPMix10mmol/LlpL;(4)轻轻混勾后离心35sec,加入2nlM-MLVRT200U/nL,终体积为20jiL;(5)反应混合物先在25。C温育10min,然后37。C水洛60min;(6)在70。C加热10min结東反应，合成cDNA第一链，置冰上进行后续实验或冷冻保存；PCR反应体系为cDNA5juL,10xpCRbuffer5pL,dNTPmix10mmol/Ll|iL，引物CMV1/CMV25pmol/ul5|iL，引物LSV1/LSV25pmol/ul5^L,引物LMoVl/LMoV25pmol/ul5pL,TaqDNA聚合酶50U/|il0.2|iL,MgCl225mmol/L4pL，ddH2019.8pL，总体积50pL;PCR反应程序95"预变性4min,然后94"变性20sec,52。C退火30sec，72。C延伸3min，35个循环,72。C延伸5min，最后于4。C结束。借由上述技术方案，本发明百合种球病毒的检测方法至少具有下列优点及有益效果(1)本发明所设计的三对特异病毒引物兼容性好，能同时在一个反应体系中得到较强的扩增，且片断长度相差适当，能够在保证正常扩增的同时，达到谱带清晰、容易区分的目的。(2)本发明釆用改进的Trizol法，通过多次洗脱除去鳞片中的多糖，多酚等次生代谢物，以获得高纯度、高质量以及完整度好的RNA。(3)本发明釆用改进的CTAB法，即65'C温浴时间由常规的10min延长至2530min，使试剂与材料充分反应，并加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1),抽提次数由一次增多至三次，多次洗脱除去鳞片中的多糖，多酚等次生代谢物，以获得高纯度、高质量以及完整度好的RNA。(4)所述的PCR反应体系由常规的25pL加倍至50pL,使得各自的目标产物可以充分扩增。(5)所述的病毒检测方法，稳定快速，7~8小时即可完成。(6)所述的病毒检测方法，经过多次验证，均可进行，其可重复性好。(7)所述的病毒检测方法，优化体系中各反应物成分取最佳低端数值，总成本低廉。图l为本发明百合种球病毒的检测方法较佳实施例通过改进的Trizol法提取的百合种球鳞片RNA凝胶电泳图。图2为本发明百合种球病毒的检测方法较佳实施例通过改进的CTAB法提取的百合种球鳞片RNA凝胶电泳图。图3为本发明百合种球病毒的检测方法较佳实施例三重复合RT-MPCR产物凝胶电泳图，M:DNAMarker1丄SV;2.CMV;3丄moV;4丄SV+LmoV;5.CMV+LmoV;6丄SV+CMV;7丄SV+CMV+LmoV;8.健康叶片。具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1三重复合RT-MPCR技术检测百合种球病毒CMV、LSV及LMoVl)使用Premier引物5软件设计三对兼容性好的特异病毒引物,并采用Oligo6软件进行引物的评价分才;^__<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2)请参阅图l所示，为本发明釆用改进的Invitrogen公司Trizol试剂法提取百合种球内层鳞片总RNA的凝胶电泳图，操作步骤如下(1)取-70。C保存的鳞茎内侧鳞片0.1~0.5g，在经0.1。/。DEPC的无菌水处理、干热灭菌后的研钵中加液氮充分研磨；(2)加入lmLTrizol提取液，室温放置5min，使其充分裂解，磨至句浆，12，000rpm离心15min，弃沉淀，收集提取液于离心管；(3)加入0.2mL三氯甲烷并上下倒置混匀,12,000rpm，4。C离心20min;(4)小心收集上清，转移至新离心管中，加入与上清等体积的异丙醇，充分混匀，室温静置10min;(5)4°C,12,000rpm,离心10min,弃上清，RNA沉于管底；(6)重复步骤(3)-步骤(5)3次；(7)加入lmL75。/。乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀，4°C,7500rpm，离心10min，弃上清；(8)沉淀干燥后，溶于20mlLRNA溶解液或DEPC水中，置于刁0。C冰箱备用；或请参阅图2所示，为本发明采用改进的CTAB法提取百合种球中层、外层鳞片RNA的凝胶电泳图，操作步骤如下(1)将-70。C保存的鳞片样品0.1g,在经0.1。/。DEPC的无菌水处理、干热灭菌后的研钵中加液氮充分研磨至粉末；(2)迅速转入1.5mL离心管中，加入600juL65。C预热的CTAB提取液(2%CTAB，2%PVP，100mMTrisCl(pH8.0),lOmMNaCl,25mMEDTA(pH8.0)),使用前加入2%P-巯基乙醇，盖紧盖子，立即剧烈涡旋振荡30s，使粉末完全分散在溶液中；(3)65。C温洛2530min,期间剧烈涡旋振荡3~5次，然后冷却至室温；(4)向上述混合液中加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)抽提三次，每次涡旋振荡5min后，室温或18。C下12,000rpm离心15min,转移上清至新的离心管中；(5)加入l/4体积lOMLiCl,混匀，4。C过夜沉淀；(6)4°C，10，000rpm离心20min收集沉淀，用500LSSTE(l.OMNaCl，0.5%SDS，10mMTrisCl，1mMEDTA)缓冲液溶解沉淀，加入等体积的氯仿/异戊醇再抽提l~2次；(7)转移上清后加入2倍体积无水乙醇，-20。C放置2h或-7(TC放置30min;(8)4°C，12，000rpm离心20min,沉淀RNA，先后用500juL75%乙醇、500juL无水乙醇漂洗沉淀，超静台上吹干后，用30jaLRNase-freeddH20溶解，置于-7(TC冰箱备用；以及3)RT-MPCR优化体系，包括RT反应和PCR反应。三重复合RT-MPCR产物凝胶电泳图请参阅图3所示，其中RT反应操作步骤如下(1)在冰洛的试管中加入如下反应混合物模板总RNA(1(ig/^iL)5^ig;01igo(dT)18(0.5赫1)1RNase-freeddH206)li1L;(2)轻轻混匀后，在7(TC水洛5min后，冰洛5min;(3)向冰洛的试管中加入如下组分5xReactionBuffer4jaL;RNaseInhibitor(40U/pl)1dNTPMix(10mmol/L)1(4)轻轻混匀后离心35sec,加入2plM-MLVRT(200U4iL),终体积为20pL;(5)反应混合物先在25X:温育10min,然后37"C水洛60min;(6)在70。C加热10min结東反应，合成cDNA第一链，置冰上进行后续实验或冷冻保存；PCR反应体系为cDNA5|iL,10xpCRbuffer5pL,dNTPmix(10mmol/L)l|aL，引物CMVl/CMV2(5pmol/ul)5pL,引物LSVl/LSV2(5pmol/ul)5pL，引物LMoVl/LMoV2(5pmol/ul)5pL,TaqDNA聚合酶(50U/pl)0.2|aL，MgCl2(25匪ol/L)4jaL,ddH2019.8|aL，总体积50pL;PCR反应程序95匸预变性4min，然后94匸变性20sec，52。C退火30sec，72。C延伸3min，35个循环，72。C延伸5min，最后于4'C结東。实施例2三重复合RT-PCR有效体系的优化为了优化本发明的RT-MPCR体系，以上述建立的RT-MPCR体系为基础，对其RT体系中的成份及浓度、PCR体系中的成份及浓度进行了研究。优化PCR体系的基本原则是:获得清晰、稳定的目标特异产物；成本较低；反应时间较短等。对RT主要成分dNTPs、三对引物，RNasin，M-MLV,以及病毒RNA浓度各设6组梯度处理。对PCR主要反应成分dNTPs,Mg2+，三对引物，TaqDNA聚合酶，模板cDNA浓度以及扩增时间各设6组梯度处理。阴性对照釆用建立起来的有效体系中的相应浓度。(1)M-MLV反转录酶浓度对RT-PCR的影响M-MLV反转录酶是RT反应体系中的关键因子之一，本实施例在RT有效体系的基础上设定了10UL，15UL,20U/pL,25U/pL，30U/nL,35U/nL等6个梯度分别进行RT反应。(2)TagDNA聚合酶浓度对PCR扩增的影响酶量与PCR产物量密切相关，而且价格昂贵。本实施例在有效PCR反应体系的基础上对TagDNA聚合酶浓度设了如下处理:0.1UL,0.2U/|iL，0.3UL,0.4U"L，0.5U/|iL，0.6U/(aL,以期筛选其最佳低端用量。(3)引物浓度对RT的影响PCR体系中引物浓度通常为O.lnmol/L~1.Onmol/L,更高浓度可能导致异位引导，出现非靶序列扩增。本实施例对引物浓度设了如下处理0.2pmol/uL，0.3pmol/uL，0.4pmol/uL,0.5pmol/uL,0.6pmol/uL，0.7pmol/uL等6个梯度。(4)dNTPs浓度对RT-PCR的影响对RT中dNTPs的最佳浓度进行了研究，设定了0.5mmol/L，0.6mmol/L，0.7mmol/L，0.8mmol/L，0.9mmol/L,l.Ommol/L等6个梯度，对PCR体系设定dNTPs为O.lmmol/L,0.2mmol/L，120.3mmol/L,0.4mmol/L,0.5mmol/L，0.6mmol/L等6个梯度。(5)RNasin浓度对RT的影响本实施例对RNasin浓度设定了0.5U/pL,l.OU/pL,2.0U/|uL，2.5U4iL,3.0U/nL等6个梯度。(6)病毒RNA模板的浓度对RT-PCR的影响为验证三重复合RT-PCR的灵敏度，本实施例对模板浓度设了如下6个梯度处理:0.05ng/^iL,0.1pg/|iL，0.15ngL,0.2pg4iL,0.25pg4iL,0.3一L。(7)退火温度对RT-PCR的影响根据所设计的三对引物的特性，对退火温度设计了如下6个梯度处理:50。C,52。C，54。C,56。C，58。C,6(TC。(8)Mg、农度对RT-PCR的影响试验说明书指出其有效范围为1~4mmol/L。因此，本实施例中参考上述浓度，对Mg^的最佳浓度进行了研究，设定了1.25mmol/L，1.50mmol/L,1.75mmol/L，2.0mmol/L，2.5mmol/L,3.0mmol/L等6个梯度。RT-MPCR优化梯度试验结果表明，进行此三种病毒LSV、CMV、LMoV三重复合RT-MPCR检测，RT反应中，M-MLV，dNTPs，引物浓度，RNasin,RNA模板浓度分别要达到20U/pl，0.5mmol/L,0.5pmol/L,2.0UL,0.25|ig/|aL有最佳的反转录结果；PCR反应中，TaqDNA聚合酶,dNTPs，引物浓度，Mg"浓度分别要分别达到0.2U/^iL，0.2mmol/L，0.5nmol/L,2mmol/L有最佳扩增结果。所需试剂全都商品化，根据梯度优化试验结果，优化体系中取值均为最优低端值，所以每个样品的直接检测费用是单一RT-PCR的30%，总成本低廉。本发明所建立的三重复合RT-MPCR体系，可以从稀释109倍的RNA粗提液中得到特异的扩增产物，体系稳定，灵敏快速，整个过程78h即可完成。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>北京林业大学<120>—种百合种球病毒的检测方法<130>KHP09112728.0<160>6<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>1gaaaccagatggacaatct19<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2atcatacaaccataagcgccga22<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3caagacatgcaatcagcaca<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4ccctatctcatccattattt<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>5cacctcaccaaaaaatggtgt<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<糊>6tagttccaagtaaggaga202021181权利要求1、一种百合种球病毒的多重检测引物，包括CMV上游引物GAAACCAGATGGACAATCT，CMV下游引物ATCATACAACCATAAGCGCCGA；LMoV上游引物CAAGACATGCAATCAGCACA，LMoV下游引物CCCTATCTCATCCATTATTT；以及LSV上游引物CACCTCACCAAAAAATGGTGT，LSV下游引物TAGTTCCAAGTAAGGAGA。2、含有权利要求l所述检测引物的检测试剂盒。3、权利要求1所述引物或权利要求2所述检测试剂盒在检测百合种球病毒中的应用。4、一种百合种球病毒的检测方法，其包括如下步骤1)提取百合种球鳞片RNA;2)RT-MPCR:将步骤l)中得到的RNA反转录后，用权利要求l所述引物扩增反转录产物，并进行电泳检测。5、如权利要求4所述的方法，其特征在于，其中步骤1)提取RNA的方法是釆用改进的Trizol和CTAB法提取百合种球鳞片RNA,其中改进的Trizol法包括步骤(1)取-70。C保存的鳞茎内侧鳞片0.10.5g，在经O.P/。DEPC的无菌水处理、干热灭菌后的研钵中加液氮充分研磨；(2)加入lmLTrizol提取液，室温放置5min,使其充分裂解,磨至匀浆，12，000rpm离心15min，弃沉淀，收集提取液于离心管；(3)加入(UmL三氯甲烷并上下倒置混句，U，000rpm，4。C离心20min;(4)小心收集上清，转移至新离心管中，加入与上清等体积的异丙醇，充分混匀，室温静置10min;(5)4°C,12,000rpm,离心10min，弃上清，RNA沉于管底；(6)重复步骤(3)-步骤(5)3次；(7)加入由DEPC水配制的lmL75%乙醇，洗涤沉淀，4°C,7500rpm，离心10min，弃上清；(8)沉淀干燥后，溶于20mlLRNA溶解液或DEPC水中，置于-7(TC冰箱备用；或改进的CTAB法包括步骤(1)将-7(TC保存的鳞片样品0.1g，在经0.1。/。DEPC的无菌水处理、干热灭菌后的研钵中加液氮充分研磨至粉末；(2)迅速转入1.5mL离心管中，加入600jiL65。C预热的CTAB提取液，其含有2%CTAB，2%PVP，100mMpH8.0TrisCl，10mMNaCl，25mMpH8.0EDTA,使用前加入2%P-巯基乙醇，盖紧盖子，立即剧烈涡旋振荡30s，使粉末完全分散在溶液中；(3)65。C温浴2530min,期间剧烈涡旋振荡3~5次，然后冷却至室温；(4)向上述混合液中加入等体积的氯仿/异戊醇抽提三次，每次涡旋振荡5min后，室温或18。C下12,000rpm离心15min，转移上清至新的离心管中；(5)加入l/4体积10MLiCl，混勾，4。C过夜沉淀；(6)4°C,10,000rpm离心20min收集沉淀,用500yLSSTE,其含有1.0MNaCl，0.5%SDS，10mMTrisCl,lmMEDTA,缓冲液溶解沉淀，加入等体积的氯仿/异戊醇再抽提l2次；(7)转移上清后加入2倍体积无水乙醇，-2(TC放置2h或-7(TC放置30min;(8)4°C,12,000rpm离心20min，沉淀RNA，先后用500mL75%乙醇、500liL无水乙醇漂洗沉淀，超静台上吹干后，用30jaLRNase-freeddH20溶解，置于-70。C冰箱备用。6、如权利要求4所述的方法，其特征在于，其中步骤2)RT-MPCR体系包括RT反应和PCR反应，其中RT反应操作步骤如下(1)在冰洛的试管中加入如下反应混合物模板总RNAljLig4iL5pg;01igo(dT)180.5lig/pll|aL;RNase-freeddH206|iL;(2)轻轻混匀后，在7(TC水洛5min后，冰浴5min;(3)向冰洛的试管中加入如下组分5xReactionBuffer4pL;RNaseInhibitor40U/pllpL;dNTPMix10mmol/Ll(iL;(4)轻轻混匀后离心35sec,加入2plM-MLVRT200U/|aL，终体积为20pL;(5)反应混合物先在25'C温育10min,然后37。C水浴60min;(6)在7(TC加热10min结東反应，合成cDNA第一链，置冰上进行后续实验或冷冻保存；PCR反应体系为<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>PCR反应程序95。C预变性4min，然后94。C变性20sec，52。C退火30sec，72。C延伸3min，35个循环，72。C延伸5min,最后于4。C结束。全文摘要本发明提供了一种百合种球病毒的检测方法，包括三种病毒CMV、LSV及LMoV的检测，其步骤包括1)设计三对兼容性好的病毒引物；2)采用改进的Trizol和CTAB法提取种球鳞片RNA；3)采用RT-MPCR技术检测病毒。该百合种球病毒的检测方法稳定快速，可重复性好，成本低廉，可用于百合种球的CMV、LSV及LMoV病毒检测。文档编号C12Q1/70GK101649355SQ20091009197公开日2010年2月17日申请日期2009年9月2日优先权日2009年9月2日发明者吕英民,张启翔,张强英,程堂仁,郑丽娜申请人:北京林业大学