专利名称：：果糖二磷酸钠(fdp)含量测定专用固体复合酶(ald、tim、gdh)试剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种果糖二磷酸钠(FDP)类含量测定专用固体复合酶(ALD、TIM、GDH)试剂其制备方法。
背景技术：
：我国药典中现(试行)标准的果糖二磷酸钠的测定方法有酶法和二苯胺法，二苯胺法专属性较差，6-磷酸果糖、果糖均能干扰测定结果，酶法较二苯胺法专属性好。故国家药典委员会关于果糖二磷酸钠类产品转正标准中，需要将果糖二磷酸钠的测定方法中的二苯胺法改为酶法。但酶法中使用的醛縮酶(ALD)、磷酸丙糖异构酶(TIM)和磷酸甘油脱氢酶(GDH)目前国内没有产品，只能从国外购买。根据上述情况，我从2003年开始，对该类酶试剂进行科研和开发。经过多年开发、研制生产出果糖二磷酸钠(FDP)含量测定专用固体复合酶(ALD、TIM、GDH)试剂，目前国内外均无同类产品。本发明是最新研发成为了果糖二磷酸钠(FDP)类含量测定专用固体复合酶试剂。该产品经广州药检所李薇主任、苏广海主住、佟爱东主任多次试验、测试、计算，其各项性能均通过测定和鉴定并规范了测试和计算方法，其功能和方法，完全可以替代同类相关国外产品。该产品的应用办法于2009年加入国药典化发〔2009〕12号文件(果糖二磷酸钠及其制剂质量标准征求意见稿)中果糖二磷酸钠(FDP)检测方法中的固体复合酶试剂。果糖二磷酸钠(FDP)含量测定专用固体复合酶(ALD、TIM、GDH)试剂在一定的条件下可测定果糖二磷酸钠的含量，具有专属性强(仅与果糖二磷酸钠反应，与葡萄糖、果糖、6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖均无反应)，重复性好(RSD=1.45%，n=6)，准确度较高，操作简便的特点、优点。该产品填补了国内外相关领域的空白。弘扬了民族产业，打破了国外对果糖二磷酸钠(FDP)类酶试剂的垄断局面，为国内制药、科研用户降低了果糖二磷酸钠(FDP)测试成本。故此，该专用固体复合酶在果糖二磷酸钠类的含量测定上有着广泛的应用。
发明内容本发明所解决的技术问题是解决了ALD(醛縮酶)、TIM(磷酸丙糖异构酶)、GDH(甘油磷酸脱氢酶)的提取和各自独立液态以及活力不稳定等技术难题，采取低温定速分离过滤提取和复合低温冻干技术使其稳定性好，使用方便(使用时不需将ALD(醛縮酶)TIM(磷酸丙糖异构酶)GDH(甘油磷酸脱氢酶)另按量配制)和保持活力时间长等优点。本发明专用固体复合酶其制备方法具体制备方法以下通过实施来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的范围。取大白免一只，活杀剥皮割下臂、背及大腿部肌肉，低温下用绞肉机绞成肉泥(500毫升)，盛于1000毫升烧杯中，加入等体积水搅拌15分钟后用医用3-4层纱布挤压进行粗过滤，滤渣再用半量水二次抽提，合并两次滤液，加入标准试剂(含量在98%以上)固体流酸铵到饱和(固体流酸铵不溶解)，边加边拌，加完后放冰箱冷藏(5度左右)存放30分钟，存液冷冻离心30分钟，转速为4000转/分(转速过大时，大分子将被分离)，取离心上清液再精细过滤《通过石棉滤板布氏漏斗》去除尚存的沉淀悬浮物。清液中再加入标准试剂(含量在98%以上)固体流酸铵到80%的饱和度。然后将此液以7000转/分(此转速可将有效大分子分离)冷冻离心30分钟，沉淀为粉红色糊状物将其分装在培养皿中，冷冻干燥得粉红色固体。各组分的重量份是ALD(醛縮酶)20-25份，TIM(磷酸丙糖异构酶)30-40份，GDH(甘油磷酸脱氢酶)30-35份(此物质中90%以上为有效物质其它物质不影响功效)。用研体研成粉末，测定活力，以每克酶每分钟催化FDP大于40微克为合格。外观为粉红色或淡白色固体粉末，将合格品按不同规格分装，密封，低温保存。专用固体复合酶的活力测定方法见2009年加入国药典化发〔2009〕12号文件(果糖二磷酸钠及其制剂质量标准征求意见稿)中果糖二磷酸钠(FDP)检测方法中的固体复合酶试剂。专用固体复合酶的应用方法见2009年加入国药典化发〔2009〕12号文件(果糖二磷酸钠及其制剂质量标准征求意见稿)中果糖二磷酸钠(FDP)检测方法中的固体复合酶试剂。[试验例l]本发明专用固体复合酶，2005年在广州市药品检验所进行的鉴定试验—、试验材料1、供试验酶本发明实施例1所制备的固体复合酶。2、试验物果糖二磷酸钠。二、试验地点和时间试验地点广州市药品检验所试验时间2005年4月-2005年11月。三、试验方法1、仪器与试剂cary-100紫外可见分光光度计(美国varian);D-无水葡萄糖对照品(批号110833-200302)、果糖对照品(批号100231-200303)、果糖二磷酸钠对照品(100539-200301，含量为74.1%)均购于中国药品生物制品检验所；果糖二磷酸钠样品为国内海南长安国际制药有限公司；河北长天药业有限公司国药集团国瑞药业有限公司提供；6-磷酸葡萄糖(批号Q52k7043)、6-磷酸果糖(Q43k7005)购于Sigma公司；4还原型辅酶I(还原性烟酰胺腺嘌呤二核甘酸NADH)购于德国BoehringerMannheim公司；固体复合酶由发明人提供，商品名"怡心力"；其他试剂均为分析纯。2、实验方法和结果2.1试液配制2丄1盐酸三乙醇胺缓冲液(0.4mol/L，pH7.6):取盐酸三乙醇胺18.6g，加水200ml溶解，加3.7g乙二胺四乙酸二钠，用2mol/L氢氧化钠调节pH值至7.60，加水稀释至250ml。fC保存，可稳定保存一周。2丄2复合酶溶液取固体复合酶0.1g，用盐酸三乙醇胺缓冲液(pH7.6)溶解并稀释至10ml。垂熔漏斗过滤，4"保存。2丄3还原型辅酶I(NADH)溶液取还原型辅酶I6.5mg，用盐酸三乙醇胺缓冲液溶解并稀释至50ml。2丄4空白酶溶液取固体复合酶60mg，用盐酸三乙醇胺缓冲液(pH7.6)溶解并稀释至20ml。垂熔漏斗过滤，fC保存，两天内使用。2丄5测定酶溶液取空白酶溶液10ml，加还原型辅酶I3.0mg，溶解后4。C保存，两天内使用。2.2专属性分别取D-无水葡萄糖对照品、果糖对照品、6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖、果糖二磷酸钠对照品适量，用水溶解并制成每lml约含0.4mg的溶液，按含量测定方法项下测定吸光度，结果仅果糖二磷酸钠溶液的吸光度降低，其余溶液的吸光度无变化，表明国产复合酶试剂仅与果糖二磷酸钠反应，与葡萄糖、果糖、6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖均无反应。2.3还原型辅酶I(NADH)的摩尔吸收系数及浓度的确定果糖二磷酸钠经醛縮酶的作用下，裂解成3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮(在磷酸丙糖异构酶作用下二分子可以互变)，3-磷酸甘油醛经脱氢酶氧化等一系列过程，生成丙酮酸[5]，这个反应需要还原型辅酶I(NADH)提供H+转化为NAD，弓|起NADH的数量变化，NADH在340nm波长处有特征吸收峰，NAD在340nm波长处却无这一吸收带，可以从NADH的吸光度变化，测定果糖二磷酸钠的含量。从默克索引"MERCKINDEX"可查到还原型辅酶I(NADH)在340nm波长处的摩尔吸收系数为6290，水分约为78%，固体复合酶活力测定方法的反应条件下，吸收度值为1左右时浓度约为0.012%。2.4缓冲液的选择选取盐酸三乙醇胺缓冲液(0.4mol/L，pH7.6)和Tris(三羟甲基铵基甲烷)缓冲液(O.lmol/L，pH7.6)分别按固体复合酶活力测定方法项下测定复合酶活力(批号050703)，结果分别为48.5g/分钟/mg和50.7yg/分钟/mg，两者差别不大，为了与国家药品标准试验条件一致，选取盐酸三乙醇胺缓冲液测定复合酶活力。2.5固体复合酶活力测定方法2.5.1测定方法取果糖二磷酸钠Q.3g(按无水物计算)，用水溶解并稀释至10ml制成果糖二磷酸钠溶液。取石英吸收池两只，一只加还原型辅酶I溶液2.99ml和果糖二磷酸钠溶液101，作为样品池；另一只加盐酸三乙醇胺缓冲液2.99ml和果糖二磷酸钠溶液101，作为空白池，摇匀，静置5分钟，照紫外-可见分光光度法(中国药典2005年版二部附录IVA)，在340nm波长处测定吸光度。向样品池中加入复合酶溶液40y1，在2(TC25t:立即摇匀并准确记时，于l、2、3、4、5分钟分别测定吸光度，以时间为横坐标，吸光度为纵坐标作图，取近似直线部分的斜率(即平均每分钟吸收度的差值AA)按下式计算复合酶的活力。式中6.29X103为还原型辅酶I(NADH)的摩尔吸收系数3为反应溶液体积(ml)406.06为果糖二磷酸钠三钠盐的分子量(C6HnNa3012P2)1000为毫克转化为微克(yg)2为果糖二磷酸钠反应系数W为加入样品池中的酶溶液毫克数(mg)2.5.2测定结果四批复合酶的活力测定结果见表一，酶活力反应曲线见说明书附图1。表一.复合酶活力测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>图1是复合酶的活力反应曲线图酶活力是指酶催化一定化学反应的能力[6]，实质上是以酶催化的反应速度来表示，酶催化的反应速度愈大，酶的活力就愈高，速度愈小，酶的活力就愈小。在进行酶活力测定时，应该选择反应产物与反应时间呈线性关系的区段，才能真实地代表酶活力。从图一可见，在上述测定方法的反应条件下，反应产物(吸光度)与反应时间呈线性关系，酶反应速度近似恒定，符合酶活力测定的要求。复合酶活力系指每毫克酶每分钟催化果糖二磷酸钠的微克数(Pg/分钟/mg)，应不少于40微克。2.6含量测定方法2.6.1测定方法取本品适量，精密称定，加水溶解并制成每lml约含0.4mg(按无水物计算)的溶液作为供试品溶液。精密量取盐酸三乙醇胺缓冲液2ml，测定酶溶液lml，置石英吸收池中；另精密量取盐酸三乙醇胺缓冲液2ml，空白酶溶液lml置另一吸收池，作为空白，摇匀，静置15分钟，照紫外-可见分光光度法(中国药典2005年版二部附录IVA)，在340nm波长处测定吸光度A"各池再分别精密加入供试品溶液0.1ml，摇匀，于2(TC25t:放置10分钟，在340nm波长处测定，直至吸光度基本不变，读取吸光度人。求出吸光度差值AA(AA=A广1.0333A2)，按下式计算，即得。AA3,()x406.06x稀释倍数*糖二磷黢*%:、100%6.29xi0'x20.1x^式中3.0为加入供试品溶液前样品池中溶液的体积(ml)6.29X103为还原型辅酶I(NADH)的摩尔吸收系数2为果糖二磷酸钠反应系数406.06为果糖二磷酸钠三钠盐的分子量(C6HnNa3012P2)0.1为供试品溶液加入体积(ml)W为供试品的取样量(mg)(以无水物计算)2.6.2线性范围精密称取果糖二磷酸钠对照品，加水配成lmg/ml(按无水物计算)的对照品溶液，分别精密量取对照品溶液l、2、3、4、5、6ml，置10ml量瓶中，加水稀释到刻度，用三个批号(050703、050804、050905)的酶试剂按含量测定方法操作测定吸收度，将吸收度(A)与浓度(C)做线性回归，得果糖二磷酸钠的线性回归方程为A=-0.003664+0.9960C,r=0.9995A=0.004976+0.9805C，r=0.9999A=0.007319+0.9696C，r=0.9996结果表明，果糖二磷酸钠在0.10.6mg/ml浓度范围内与吸收度呈良好线性关2.6.3精密度试验精密称取果糖二磷酸钠对照品，加水配成0.4mg/ml(按无水物计算)的对照品溶液，用上述四批固体复合酶溶液按含量测定方法操作重复测定吸收度，结果见表二。表二.固体复合酶精密度试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>结果表明精密度良好。2.6.4重复性试验取注射用果糖二磷酸钠和果糖二磷酸钠注射液各一批，精密称定或量取多份，加水配成0.4mg/ml(按无水物计算)的溶液，按含量测定方法操作测定，结果见表三。表三.重复性试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>结果表明重复性良好。2.6.5回收率试验精密称取已知含量的注射用果糖二磷酸钠(批号20040201)九份，置100ml量瓶中，配成相当于标示量70%、100%、130%的溶液，分别精密加入14.01mg/ml果糖二磷酸钠对照品溶液2ml，加水至刻度，按含量测定方法操作，回收率好。取六批样品，分别制备样品溶液，按含量测定方法进行操作，测定结果见表六。表六含量测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3结论3.1固体复合酶活力测定实际是测定酶反应的速度，为保证测得的是反应的初速度(反应产物与反应时间呈线性关系)，底物浓度应足够大，把酶完全饱和，这样酶反应对于底物来说是零级反应，测得的酶活力才能准确地代表酶的含量。固体复合酶活力测定方法的酶反应条件中，参与反应的还原型辅酶I(NADH)有0.5iimo1，理论上作为底物的果糖二磷酸钠参与反应数量应不少于0.25iimol，固体复合酶参与反应数量为0.4mg，按酶活力为40iig/分钟/mg反应时间为5分钟计算，需要底物80iig，即0.2iimo1，底物实际配制为0.74iimo1，为理论值的3倍左右，底物浓度足够完成反应。如果固体复合酶活力过高，可适当调低复合酶溶液的浓度。酶活力愈大，表明酶含量愈高，通过测定酶活力，可控制固体复合酶的质量。3.2含量测定方法中通过测定NADH的数量变化来测定底物果糖二磷酸钠的浓度，为了确保反应完全，应加入大量的酶和小量的底物。含量测定方法的的酶反应条件中，参与反应的还原型辅酶I(NADH)有0.4iimo1，理论上作为底物的果糖二磷酸钠参与反应数量应少于0.2iimo1，固体复合酶参与反应数量为3mg，按酶活力为40yg/分钟/mg计算，可催化底物120iig/分钟，S卩0.3iimol/分钟，底物实际配制为O.liimol，为理论值的0.5倍左右，底物能够反应完全。如果固体复合酶活力过低，可适当调高复合酶溶液的浓度。3.3含量测定方法中通过NADH在340nm波长处的摩尔吸收系数计算果糖二磷酸钠的含量，紫外分光光度计的波长准确度对测定结果有一定影响，实验数据表明，最大吸收波长与340nm波长处的吸光度差值可达0.001左右。3.4酶反应生成物氧化型辅酶I(NAD)在340nm波长处有较弱吸收，国产试剂NAD(纯度90%以上)的0.1mg/ml溶液吸光度A34。nm为0.0035，Sigma试剂NDA(纯度97%以上)的O.lmg/ml溶液吸光度A34。nm为0.0025，约为同浓度NADH吸光度的0.3%。3.5含量测定方法为底物测定法，而非速度法，测定环境的温度对酶反应速度有影响，对底物的总变化量影响不大。实验数据表明，测定温度高，达到吸光度基本不变的时间相对縮短，测定温度低，反应时间相对延长，但吸光度差值AA基本不变。[试验例2]本发明专用固体复合酶2009年在广州市药品检验所在果糖二磷酸钠上的含量应用测定试验—、试验材料1、供试验酶本发明实施例1所制备的固体复合酶。2、试验物果糖二磷酸钠。二、试验地点和时间试验地点相关药厂负责汇总单位广州市药品检验所试验时间2009年2月-2009年6月。2009年在广州市药品检验所根据2009年加入国药典化发〔2009〕12号文件要求，有资格生产果糖二磷酸钠的相关企业，对本发明实施例l所制备的固体复合酶进行领lj试。三、试验方法按2009年加入国药典化发〔2009〕12号文件(果糖二磷酸钠及其制剂质量标准征求意见稿)中果糖二磷酸钠(FDP)检测方法。四、试验结果含量测定根据2009年加入国药典化发〔2009〕12号文件要求各企业根据"混悬液酶试剂(进口)"、"固体复合酶试剂(国产)"两种方法对本品的含量测定进行研究，可根据不同的酶试剂确定其中一种方法。主要考察进口酶试剂和国产酶试剂哪个更符合检测的要求。结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>两安万隆制药有限责任公司<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>五、结论上述试验结果表明，本发明的果糖二磷酸钠(FDP)含量测定专用固体复合酶(ALD、TIM、GDH)试剂在果糖二磷酸钠上的含量测定效果试验，说明发明的果糖二磷酸钠(FDP)含量测定专用固体复合酶(ALD、TIM、GDH)试剂与进口酶具有同等检测功能，完全可替代进口混悬液酶试剂即ALD(醛縮酶)TIM(磷酸丙糖异构酶)GDH(甘油磷酸脱氢酶)。权利要求一种新的果糖二磷酸钠(FDP)含量测定专用固体复合酶(ALD、TIM、GDH)试剂其制备及应用方法，该固体复合酶由以动物肌肉为原料从中提取以下ALD(醛缩酶)TIM(磷酸丙糖异构酶)GDH(甘油磷酸脱氢酶)的固体复合酶。2.按照权利要求1所述的固体复合酶，其特征在于，各组分的重量份是ALD(醛縮酶)20-25份，TIM(磷酸丙糖异构酶)30-40份，GDH(甘油磷酸脱氢酶)30-35份。3.按照权利要求2所述的固体复合酶，其特征在于，各组分的重量份是ALD(醛縮酶)20份，TIM(磷酸丙糖异构酶)30份，GDH(甘油磷酸脱氢酶)30份。4.权利要求1-3任何一项所述固体复合酶在测定果糖二磷酸钠类含量的应用。全文摘要本发明公开了一种新的果糖二磷酸钠(FDP)含量测定专用固体复合酶(ALD、TIM、GDH)试剂其制备及应用方法，该固体复合酶由以下醛缩酶(ALD)、磷酸丙糖异构酶(TIM)、甘油磷酸脱氢酶(GDH)组成。本发明是以动物肌肉为主要原料在一定条件下提取含醛缩酶(ALD)、磷酸丙糖异构酶(TIM)和甘油磷酸脱氢酶(GDH)的固体复合酶试剂。该固体复合酶在一定的条件下可测定果糖二磷酸钠类的含量，具有专属性强(仅与果糖二磷酸钠反应，与葡萄糖、果糖、6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖均无反应)，重复性好(RSD＝1.45％，n＝6)，准确度较高，操作简便的特点。文档编号C12Q1/32GK101691566SQ20091009193公开日2010年4月7日申请日期2009年9月2日优先权日2009年9月2日发明者不公告发明人申请人:赵军