专利名称：苏云金芽孢杆菌固态深层发酵及连续转接的生产方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物固态发酵方法，特别是一种苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)固态深层发酵及连续转接的生产方法。
背景技术：
目前，苏云金杆菌固态发酵多采用浅盘式、仓式浅盘、箱式、桶式，形式各异，铺料作业以手工操作为主，费工费时容易污染，铺料厚度、空气净化及供风量、温湿控制达不到规范化和标准化要求，生产往往受地域、气候、环境影响和限制，特别是夏季生产温度湿度难以控制，粉碎过程中有些培养基成分不易粉碎，造成生产能耗高浪费大，产品质量不稳定。
发明内容
本发明的目的就是提供一种苏云金芽孢杆菌固态深层发酵及连续转接的生产方法，以实现用固态培养基大规模生产苏云金芽孢杆菌。
本发明可以通过以下方式来实现(1)液态菌种与固态培养基混合后，置于发酵器发酵，培养基厚度300-800mm，发酵器在密封的发酵房内，室内温度26-55℃，湿度35-95％，发酵温度28-32℃，湿度35-85％，风压112mmH2O，风量10588-12000m3/h，发酵时间48-55小时；(2)把发酵物作为菌种进行连续转接后再发酵，是当发酵至对数期的发酵物菌体数量达到200亿/mg时，由发酵器提取发酵物作为菌种分别转接到5-10个发酵器内发酵，发酵温度28-32℃，湿度35-85％，风压112mmH2O，风量10588-12000m3/h，发酵时间48-55小时，然后，用发酵物作为菌种转接发酵3-5次，当发现菌体出现衰退或噬菌体时，停止连续转移接。
本发明的活孢子含量可达400-500亿/克，拌孢晶体个大、均匀，干粉的毒力效价稳定在16000IU/mg。本发明大大提高了生产效率，具有生产工艺稳定、不易染菌、产量高、质量好的优点，减少一级菌种的制作，减少了噬菌体污染的可能性，从而降低成本。其非常适合好氧微生物的固态发酵。
具体实施例方式
下面结合实施例，对本发明进行更详尽的描述。
实施例一苏云金芽孢杆菌固态深层发酵过程菌种液态放大培养、培养基灭菌接种、固态深层发酵、烘干、粉碎。
1、发酵器培养基配方及配制方法麦麸665公斤、鱼粉14公斤、酵母粉14公斤，将培养基物料混合在一起拌匀，将7公斤石灰放入735公斤水中，取其上清液与培养基混合料搅拌均匀即可。
2、培养基灭菌将培养基置于灭菌釜内121℃高温灭菌，时间35分钟。
3、接种与拌种砂土管菌种接种、茄瓶育种、种子罐液态培养，培养基常温接种并在釜内拌匀，然后分料。
4、固态深层发酵4.1发酵器设置在发酵房内室内温度30℃，湿度65％，发酵器内上下各铺一层无菌湿布用于过滤空气和保湿保温；4.2接种后的培养基被送至发酵器，经翻料机铺平，厚度450mm；4.3发酵时，发酵器采用微机调频控制，温度30℃、湿度85％、风压112mmH2O、风量10588m3/h，风向以发酵器的长轴方向行进，在搅流板的作用下，风向转而垂直向上，均匀穿透培养基，经过延迟期、对数期、稳定期、成熟期四个阶段51小时发酵，发酵物伴孢晶体毒力效价≥16000IU/mg，毒素蛋白≥2.0。
5、用烘干机将发酵物水分烘干至7％以下，经气流粉碎机粉碎使产品细度达到200目。
实施例二苏云金芽孢杆菌固态深层转接发酵过程培养基灭菌、固态深层发酵物作为菌种转接再发酵、烘干、粉碎。
1、发酵器培养基配方及配制方法按实施例一培养基配方比例配料，麦麸、鱼粉、酵母粉、石灰各乘以5倍，合计3500公斤，将培养基物料混合在一起拌匀，将35公斤石灰放入3675公斤水中，取其上清液与培养基混合料搅拌均匀即可。
2、培养基灭菌将培养基置于灭菌釜内121℃高温灭菌，时间35分钟。
3、固态发酵物作为菌种转接再发酵3.1发酵房内每个发酵器内上下都铺垫一层无菌湿布用于过滤空气和保湿保温；培养基灭菌后送入发酵器，由翻料机铺平，厚度600mm；
3.2随后将已发酵至对数期菌体数量200亿/mg的发酵物用移料机提取作为菌种分别转接到5个发酵器内；3.3发酵过程同实施例一4.3。
实施例三苏云金芽孢杆菌固态深层连续转接再发酵培养基灭菌、固态菌种连续转接再发酵、烘干、粉碎。
1.培养基配方及配制方法培养基配方、比例、数量及配制方法同实施例二(1)；2、培养基灭菌将培养基置于灭菌釜内121℃高温灭菌，时间35分钟。
3、固态菌种连续转接再发酵3.1培养基灭菌后送入发酵器，由翻料机铺平，厚度800mm，3.2再将施例二(3.2)已发酵至对数期菌体数量200亿/mg的发酵物用移料机提取作为菌种分别转接到10个发酵器内，均匀拌种后进行再发酵；3.3发酵过程同实施例一(4.3)；4.烘干粉碎同实施例二(5)；实施例一、二、三形成一个完整的苏云金芽孢杆菌固态深层连续转接发酵生产周期，全过程只需五天，投料17200公斤，与普通固态深层发酵相比生产周期缩短1.6天，产量提高3.2倍，产品毒力效价提高30％。
苏云金杆菌固态发酵物经过质检生测，配兑填料和标准化处理后，作为可湿性粉剂商品出售，该产品可掺土作为毒土使用，可用其他溶制剂配兑成悬浮剂等剂型，可直接兑水喷施。其杀虫效果、展着性、湿润性等均有良好的表现。由于产品培养基由粮食副产品组成，施药后可落地为肥，具有杀虫、追肥的双效功能。
权利要求
1.一种苏云金芽孢杆菌固态深层发酵及连续转接的生产方法，其特征在于(1)液态菌种与固态培养基混合后，置于发酵器发酵，培养基厚度300-800mm，发酵器在密封的发酵房内，室内温度26-55℃，湿度35-95％，发酵温度28-32℃，湿度35-85％，风压112mmH2O，风量10588-12000m3/h，发酵时间48-55小时；(2)把发酵物作为菌种进行连续转接后再发酵。
2.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于把发酵物作为菌种进行连续转接后再发酵，是当发酵至对数期的发酵物菌体数量达到200亿/mg时，由发酵器提取发酵物作为菌种分别转接到5-10个发酵器内发酵，发酵温度28-32℃，湿度35-85％，风压112mmH2O，风量10588-12000m3/h，发酵时间48-55小时，然后，用发酵物作为菌种转接发酵3-5次，当发现菌体出现衰退或噬菌体时，停止连续转移接。
全文摘要
本发明公开了一种苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)固态深层发酵及连续转接的生产方法，(1)液态菌种与固态培养基混合后，置于发酵器发酵，培养基厚度300－800mm，发酵器在密封的发酵房内，室内温度26－55℃，湿度35－95％，发酵温度28－32℃，湿度35－85％，风压112mmH
文档编号C12N1/20GK1546651SQ20031011252
公开日2004年11月17日 申请日期2003年12月8日 优先权日2003年12月8日
发明者田锋, 张世坚, 王胜华, 黄国勇, 田 锋 申请人:广东北大新世纪生物工程股份有限公司