专利名称：人ppp2r3a基因突变及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及人PPP2R3A的基因突变和分析人PPP2R3A基因的突变的方法，以及此突变在扩张型心肌病中辅助诊断的用途。
背景技术：
扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopathy, DCM)是一种以心室腔(左心室和/ 或右心室)扩大、心肌收缩功能受损为主要特征的原因不明的心肌疾病，可通过超声心动图明确诊断。其临床表现为进行性心衰，左室收缩功能下降，室性及室上性心律失常， 传导系统异常，血栓栓塞，猝死以及心衰相关的死亡。分别为心衰的第3大病因及心脏移植最常见原因[Maron BJ, Towbin JA, Thiene G，et al. Contemporary definitions and classification of the cardiomyopathies :an American Heart Association Scientific Statement from the Council on Clinical Cardiology,Heart Failure and Transplantation Committee ；Quality of Care and Outcomes Research and Functional Genomics and Translational Biology Interdisciplinary Working Groups ；and Council on Epidemiology and Prevention. Circulation，2006，113(14) :1807-1816.]。 目前认为病毒感染、免疫功能异常和遗传因素(基因突变)是导致扩张型心肌病的3个主要致病原因。如果DCM患者家族内有2个或2个以上的成员患病，则为家族性扩张型心肌病(FDCM)。研究表明约-48% 的 DCM 具有家族遗传性[Menon SC, Olson TM,Michaels W.Genetics of familial dilated cardiomyopathy. Prog Pediatr Cardiol,2008, 25(3) :57-67.]。迄今为止，共定位、克隆了 40个与FDCM相关的疾病基因或位点。其中伴心脏传导功能障碍的DCM与以下5个基因或位点相关LMNA [Fatkin D，MacRae C， Sasaki Τ, et al. Missense mutations in the rod domain of the lamin A/C gene as causes of dilated cardiomyopathy and conduction-system disease. N Engl J Med,1999,341 (23) :1715-1724. ]、SCN5A[McNair WP, Ku L, Taylor MR, et al. SCN5A mutation associated with dilated cardiomyopathy, conduction disorder, and arrhythmia. Circulation,2004,110 (15) :2163-2167. ]>6q22-q23[Messina DN, Speer MC, Pericak-Vance MA, et al. Linkage of familial dilated cardiomyopathy with conduction defect and muscular dystrophy to chromosome 6q23. Am J Hum Genet, 1997,61(4) :909-917. ]、2ql4_q22[Jung M, Poepping I，Perrot A, et al. Investigation of a family with autosomal dominant dilated cardiomyopathy defines a novel locus on chromosome 2ql4-q22. Am J Hum Genet, 1999,65(4) : 1068—1077·]禾口 3q26 [徐伟，张宝荣，胡正茂，等.应用遗传连锁分析法对伴传导功能障碍的扩张型心肌病家系致病基因的定位.中南大学学报(医学版)，2005，30 (5) :510-514.]。关于DCM确切的致病机制， 目前仍不清楚。传统的分子遗传学方法采用连锁分析合并候选基因筛查技术研究DCM取得了一些成果，但也存在诸多缺陷与不足。如对家系样本的数量和质量要求高、定位区域较宽、难以最终鉴定出致病基因以及耗时长等。外显子组测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕获并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。2010年《Science》 杂志公布的十大科学突破中就包含外显子组测序[The Runners-Up[J], Science, 2010, 333(17) :1605-1607.]。本发明以伴房室传导阻滞的DCM家系为研究对象，结合连锁分析、外显子组测
序技术，鉴定了一个新的致病基因-PPP2R3A(protein phosphatase 2, regulatory
subunit B"，alpha)，其编码蛋白为蛋白磷酸酶2的一种调节亚基。蛋白磷酸酶2是一种重要的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，其功能极为广泛，涉及细胞的发育与运动性、细胞增殖与死亡、细胞骨架动力学、细胞周期调控、多种信号传导通路调节等方面。此外，它也被认为可能是一禾中重要的抑癌基因[Shi Y. Serine/threonine phosphatases :mechanism through structure. Cell, 2009,139 (3) :468-484.]。蛋白磷酸酶2的全酶为异源三聚体结构，包含结构亚基、催化亚基和调节亚基。PPP2R3A基因的突变(R9Q，匪181897. 2)可能影响其蛋白功能，使磷酸酶活性异常，心肌蛋白去磷酸化出现异常，导致了扩张型心肌病的发生。在本申请之前，还没有人PPP2R3A基因突变导致疾病特别是扩张型心肌病的报道。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种检测PPP2R3A基因突变的方法；本发明的第二个目的在于提供用于检测PPP2R3A基因突变的试剂盒。本发明研究发现PPP2R3A基因1号外显子第沈位核苷酸G — A突变与扩心病相关联，在此位点存在突变。为此，本发明第一方面，提供一种检测人PPP2R3A基因的突变的方法，其包括以下步骤(a)确定在样品中人PPP2R3A基因编码的第9位氨基酸，或SEQ ID NO=I的第360 至362位核苷酸；(b)检测在所述位置是否存在氨基酸R — Q突变。本发明的第二方面，提供一种分离的核酸，它具有SEQ ID NO 1所示的序列，且第 361位为A，或者包括第361位核苷酸的SEQ ID NO. 1所示序列的特异性片段。进而本发明提供一种分子标记，其为上述SEQ ID NO. 1所述的核酸序列，或者所述的特异性片段，通过该分子标记，能够判断是否存在可能的扩心病。在本发明的第三方面，提供用于扩增包括上述多态位点的特异性引物。例如，该引物其长度为15-50bp，且特异性地杂交并扩增出含人PPP2R3A基因的SEQ ID NO=I所示序列中第361位核苷酸G — A突变或者基因组PPP2R3A基因的1号外显子第沈位处的G — A 突变的扩增产物。在本发明的第四方面，提供一种可与上述SEQ ID NO. 1特异性杂交并检测所述突变位点的寡核苷酸探针。例如，其长度为15-50bp，且特异性地杂交并检测含人PPP2R3A基因的SEQ ID N0:1所示序列中第361位核苷酸G —A突变或者基因组PPP2R3A基因的1号外显子第沈位处的G — A碱基突变。在本发明的第五方面，提供了扩张型心肌病分子诊断的试剂盒。该试剂盒包括用于人PPP2R3A基因的第1外显子第沈位核苷酸检测的试剂，或用于该基因转录的mRNA序
4列相应位点检测的试剂，或用于该基因表达产物相应位点检测的试剂。其可以是1)检测基因组的PCR试剂盒；或2~)检测mRNA的荧光定量PCR检测试剂盒，或Northern检测试剂盒。例如，可以包括上述的引物和/或本发明上述的寡核苷酸探针；或幻检测该突变蛋白的免疫检测试剂盒。本发明研究发现人PPP2R3A基因的SEQ ID NO :1所示序列中第361位核苷酸G —A 突变或者基因组PPP2R3A基因的1号外显子第沈位处的G — A突变，从而改变了 PP2A酶的磷酸酶活性，与遗传性扩张型心肌病的发病相关。通过该位点的鉴定可以用于扩心病的辅助诊断，用于发现扩心病的潜在携带者，为该病的预防提供依据。
图1显示的是家系中对照及人群中对照的测序图，为野生型(G/G)；图2显示的是家系中患者或无症状携带者的测序图，为突变型(G/A)。具体实施的方式本发明人通过广泛而深入的研究，已经发现了人PPP2R3A基因的突变(c. 26G > A，R9Q，NM_181897. 2)在一个遗传性扩张型心肌病家系中与疾病性状共分离，这种扩张型心肌病发病年龄较早，且伴有房室传导阻滞，显示这个突变可能影响到基因的功能，使心肌蛋白去磷酸化出现异常，导致了扩张型心肌病的发生。已经有PPM基因心肌组织特异性敲除和PP2A全酶催化基团PP2Ac α全身性敲除的小鼠模型，均导致了扩张型心肌病的临床表型。而PPP2R3A基因作为ΡΡ2Α酶的调节因子，它的功能缺失，可能导致ΡΡ2Α酶的活性下降，进而导致例如Ca2+蛋白去磷酸化功能障碍，使心肌细胞的去极化障碍，凋亡增加，出现心肌细胞的重构，最终表现出扩张型心肌病的临床症状。因此可以通过检测PPP2R3A基因的mRNA、cDNA或基因组DNA中该位点的突变，或者通过检测患者PP2A磷酸酶的酶活性，从而确定检测对象的扩张型心肌病易感性。人PPP2R3A基因的cDNA序列为SEQ ID NO :1，其开放阅读框为第336-1925位，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO :2。人PPP2R3A的基因组序列可以从GenBank中获得。本技术领域的人员均知道，有许多的分析技术可以用于检测人PPP2R3A基因的突变。这些技术包括(但不局限于)DNA测序、杂交测序、酶促错配切割、异源双链分析、点杂交、寡核苷酸阵列(DNA芯片)、Mini-sequencing、Taqman技术、高分辨率熔解曲线(HRM)、 变性的高效液相色谱(DHPLC)和分子信标等。另一方面，本发明的检测方法被用于评估个体患扩张型心肌病的易感性。本发明的检测样品可以是从体液、组织甚至头发等样品中抽提的基因组DNA或 mRNA。用于本发明方法或检测试剂盒的引物和探针，根据PPP2R3A基因的cDNA序列(SEQ ID NO 1的序列)或基因组序列进行设计，并用常规的合成技术进行合成即可。以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按常规进行或者按照试剂盒建议的条件完成。实施例1基因组的抽提和测序用常规的酚氯仿法从人的血液中提取基因组DNA，用于常规PCR扩增。
引物序列为正义引物AGGTATTGGGAGCCACAGACT反义引物ACTTCAGCCGCTTCTTAAACC扩增体系(总体积50 μ L)
权利要求
1.一种检测人/ ^/？划基因突变的方法，其步骤包括(a)确定在样品中人/^基因编码的第9位氨基酸，或SEQID NO: 1的第360至 362位核苷酸；(b)检测在所述位置是否存在氨基酸R— Q突变。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的突变是在SEQID NO: 1第361位核苷酸G —A的突变。
3.一种分离的核酸，其特征在于，所述分离的核苷酸序列是SEQ ID N0:1所示的序列， 且第361位为A ；或包括第361位核苷酸的SEQ ID NO. 1所示序列的特异性片段。
4.一种分子标记，其为权利要求3所述分离的核酸。
5.一种用于辅助诊断遗传性扩张型心肌病的试剂盒，其包括用于人/ / ^基因的第 1外显子第26位核苷酸检测的试剂，或用于该基因转录的mRNA序列相应位点检测的试剂， 或用于检测该基因表达产物相应位点检测的试剂。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为1)检测基因组的PCR试剂盒；或2)检测mRNA的荧光定量PCR检测试剂盒，或Northern检测试剂盒；或3)检测该突变蛋白的免疫检测试剂盒。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR试剂盒包括序列为SEQID NO:3和4的引物对。
8.一种检测人/ ^/？划基因突变的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3和4所示。
9.一种寡核苷酸探针，其特异性地与SEQ ID NO: 1杂交并检测其第361位核苷酸。
全文摘要
本发明涉及人PPP2R3A的基因突变及其与扩张性心肌病的相关性。本发明提供了检测人PPP2R3A基因的突变的方法，并提供了相关的检测试剂盒。本发明方法是通过确定SEQIDNO:1所示序列中第361位核苷酸，检测其是否存在G→A突变。本发明研究发现人PPP2R3A基因的SEQIDNO:1所示序列中第361位核苷酸(基因组PPP2R3A基因的1号外显子第26位)存在G→A单核苷酸多态性，当发生G→A突变时，改变了PP2A酶的磷酸酶活性，存在与遗传性扩张型心肌病的发病相关性。本发明可以用于扩心病的辅助诊断，用于发现扩心病的潜在携带者，为该病的预防提供依据。
文档编号C12N15/11GK102443630SQ20111035431
公开日2012年5月9日 申请日期2011年11月10日 优先权日2011年11月10日
发明者周新, 宋贵波, 干学东, 李聪, 杨娜, 郑芳 申请人:武汉大学