用于检测人类bcr-abl基因突变的引物、探针及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因突变的检测，具体地涉及一种用于检测人类BCR-ABL基因突变的引物、探针及试剂盒。用于检测人类BCR-ABL基因突变的引物、探针由以下3组突变引物和探针序列中的一组或几组的组合。本发明可同时检测BCR-ABL基因中3种点突变，分别采用针对其不同突变方式设计的突变型引物及探针对待测样品进行检测，只有突变型样本才能被顺利的扩增出双链DNA产物，并与探针结合，发出荧光信号从而被检测到。本发明具有快速、简便、安全、高灵敏、高通量和低成本等优点，可用于大量临床样本的BCR-ABL基因突变筛查。
【专利说明】用于检测人类BCR-ABL基因突变的引物、探针及试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因突变的检测，具体地涉及一种用于检测人类BCR-ABL基因突变的 引物、探针及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 慢性粒细胞自血病（CML)是一种起源于造血干细胞的恶性增殖性疾病，占全部白 血病的13%，以9号和22号染色体易位t(9 :22) (q34 ;qll)形成的费城染色体（Ph)为特 征。该易位形成一种新的融合基因（BCR-ABL)，此基因编码融合型蛋白p210,即一种活性酪 氨酸激酶，能够导致髓系造血的异常克隆性增殖，这是导致CML的根本原因，也是治疗的靶 向位点。
[0003] 伊马替尼是首个被批准应用于一线治疗CML的酪氨酸激酶抑制剂。伊马替尼能够 靶向作用于BCR-ABL，显示了其卓越的临床疗效。然而，仍有17% CML患者不能获得完全细 胞遗传学反应（CCyR)，约18%已获得CCyR的患者最终失去疗效，14%已获得CCyR的患者 不能获得主要分子学反应（MMR)，6%的患者对伊马替尼不耐受。
[0004] 达沙替尼（Dasatinib)是一种人工合成的BCR-ABL和Src激酶双重抑制剂，用于 治疗甲磺酸伊马替尼耐药或不能耐受的慢性骨髓性白血病所有病期的成人患者。FDA已经 批准达沙替尼治疗对其他疗法耐药或不能耐受的费城染色体阳性的急性淋巴细胞性白血 病成人患者。达沙替尼虽然对多数的突变位点都可以起作用，但是也有部分位点出现突变 会导致其耐药。因此对其耐药位点进行基因检测对于指导病人临床用药具有重要的参考价 值。
[0005] 达沙替尼是第2代BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂，其对BCR-ABL活性的抑制作用比 伊马替尼强325倍，比尼洛替尼强16倍。能够抑制多数引起伊马替尼耐药的BCR-ABL突变， 但仍有一些突变会导致患者产生耐药，例如：V299L、F317L/C等。因此对其耐药位点进行基 因检测对于指导病人临床用药具有重要的参考价值。
[0006] 目前，针对基因突变检测主要取样于肿瘤组织。但临床上初诊的70% -80%的癌 症病人都已经到了晚期，失去了手术机会，肿瘤组织获取困难，以致失去检测机会。临床迫 切需要建立简便而广泛使用的监测指标，评价患者个体对靶向药物的耐药性（或敏感性）， 减少盲目用药给病人带来的经济损失。
[0007] 外周血取样具有取材简便的优点，是临床上进行病情监测的首选标本来源。研究 表明，实体肿瘤患者的血循环中大量存在游离的肿瘤DNA，其含量约为健康人的10倍以上。 近年来，随着核酸扩增技术的不断优化，国外开始报道采用外周血标本检测游离DNA基因 突变，灵敏度和特异性与组织标本的结果符合率较高，这极大促进了靶向药物基因突变检 测方法的研究进展，以游离DNA为靶分子探讨临床药物疗效及预后分子标志物正成为目前 的研究热点。但是，外周血液中癌细胞的突变DNA是存在于大量野生型基因背景下的极为 稀少的突变基因，其存在比率一般小于〇. 2 %。因此，能否准确无创的检测这类稀有突变对 现有检测技术提出了挑战。
【发明内容】
[0008] 为解决上述问题，本发明提供一种用于检测人类BCR-ABL基因突变的引物、探针 及试剂盒。
[0009] 为实现上述目的本发明采用的技术方案为：
[0010] 一种用于检测人类BCR-ABL基因突变的引物、探针，由以下3组突变引物和探针序 列中的一组或几组的组合：
[0011] (l)GATCAAACACCCTAACTAGC(SEQ ID NO ：1)
[0012] GTCGGCAGAGCACAAATATTC(SEQ ID NO ：2)
[0013] FAM-CAGCTCCTTGGTGAGTAAGCC-BHQl (SEQ ID NO ：3)
[0014] (2)GTCAGAATCCTTCAGAACGC(SEQ ID NO ：4)
[0015] GGAGGTTCCCGTAGGTTGTC(SEQ ID NO ：5)
[0016] FAM-CCACGTGTTGAAGTCCTCGTTG-BHQl (SEQ ID NO ：6)
[0017] (3)CGTTCTATATCATCACTGTCTG(SEQ ID NO ：7)
[0018] CCTCTACCTGTGGATGAAGT(SEQ ID NO ：8)
[0019] FAM-CTTCTCCAGGTACTCCATGGC-BHQl (SEQ ID NO ：9)
[0020] 一种检测人类BCR-ABL基因突变的方法，以提取待测样品的DNA作为模板，采用上 述记载的引物和探针，通过荧光PCR扩增待测的突变基因把序列，检测反应体系的荧光强 度，以达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为结果判断的标准，Ct值为0或45 :阴 性；Ct值< 38 :阳性。所述待测样品可为全血或骨髓样本。
[0021] 所述荧光定量PCR的反应体系为：
[0022]
【权利要求】
1. 一种用于检测人类BCR-ABL基因突变的引物、探针，其特征在于：由以下3组突变引 物和探针序列中的一组或几组的组合： (1) GATCAAACACCCTAACTAGC(SEQ ID NO ：1) GTCGGCAGAGCACAAATATTC(SEQ ID NO ：2) FAM-CAGCTCCTTGGTGAGTAAGCC-BHQKSEQ ID NO ：3) (2) GTCAGAATCCTTCAGAACGC(SEQ ID NO ：4) GGAGGTTCCCGTAGGTTGTC(SEQ ID NO ：5) FAM-CCACGTGTTGAAGTCCTCGTTG-BHQl (SEQ ID NO ：6) (3) CGTTCTATATCATCACTGTCTG(SEQ ID NO ：7) CCTCTACCTGTGGATGAAGT(SEQ ID NO ：8) FAM-CTTCTCCAGGTACTCCATGGC-BHQl (SEQ ID NO ：9) 〇
2. -种检测人类BCR-ABL基因突变的方法，其特征在于： 以提取待测样品的DNA作为模板，采用上述记载的引物和探针，通过荧光PCR扩增待测 的突变基因把序列，检测反应体系的荧光强度，以达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct 值作为结果判断的标准，Ct值为0或45 :阴性；Ct值< 38 :阳性。
3. 按权利要求2所述的检测人类BCR-ABL基因突变的方法，其特征在于：所述待测样 品可为全血或骨髓样本。
4. 按权利要求2所述的检测人类BCR-ABL基因突变的方法，其特征在于：所述荧光定 量PCR的反应体系为： I X PCR buffer ( Free Mg2') MgCl2 2- IOmM dNTP MIX 50~200μΜ 各对引物 100~ I OOOnM 各条探针 50-500nM Taq 酶 0.5?1.5U Betaine 0~1.8M DMSO 0-15% 模板 2?5μ? 总体积 20~30pL "
5. 按权利要求2所述的检测人类BCR-ABL基因突变的方法，其特征在于：所述荧光定 量PCR的反应条件是：
6. -种用于检测人类BCR-ABL基因突变的试剂盒，其特征在于：试剂盒中包括至少一 组权利要求1所记载的引物和探针。
7. 按权利要求6所述的用于检测人类BCR-ABL基因突变的试剂盒，其特征在于：所述 试剂盒为反应体系。
【文档编号】C12N15/11GK104372094SQ201410652876
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年11月14日 优先权日:2014年11月14日
【发明者】李文欣, 金雪花 申请人:辽宁迈迪生物科技有限公司