鉴定或辅助鉴定禽流感病毒及其h6n1亚型的引物对组合物与应用的制作方法

鉴定或辅助鉴定禽流感病毒及其h6n1亚型的引物对组合物与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了鉴定或辅助鉴定禽流感病毒及其H6N1亚型的引物对组合物与应用。本发明所提供的鉴定或辅助鉴定禽流感病毒及其H6N1亚型的引物对组合物与应用为组合物1、组合物2或组合物3；组合物1由名称为H6的PCR引物对、名称为N1的PCR引物对和名称为M的PCR引物对组成；H6由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成；N1由序列表中SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的两条单链DNA组成；M由序列表中SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的两条单链DNA组成；组合物2由所述H6和所述M组成；组合物3由所述N1和所述M组成。
【专利说明】鉴定或辅助鉴定禽流感病毒及其H6N1亚型的引物对组合 物与应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学领域中鉴定或辅助鉴定禽流感病毒及其H6N1亚型的引物对 组合物与应用。

【背景技术】
[0002] 禽流感病毒（Avian Influenza Virus, AIV)根据表面糖蛋白（Hemagglutinin, HA) 和神经氨酸酶（Neuraminidase, NA)抗原性差异分为不同的亚型，目前已发现有16种HA亚 型（H1-H16)和9种NA亚型（N1-N9)，HA和NA的组合可产生至少135种亚型，其中，H5和 H7亚型中的部分组合（H5N1、H7N7和H7N9等）称为高致病性AIV，可感染人类并致死。低 致病性AIV感染虽然无任何症状或表现温和的、轻微的不典型症状，对畜禽和人类的健康 不具威胁性，但当不同亚型的低致病性AIV毒株混合感染畜禽时，可以在动物体内互相交 换基因，从而产生无法预测致病性和传染性的新变异株，这将对禽类和人类健康存在很大 的威胁。
[0003] H6亚型AIV属于低致病性AIV，但有报道表明1997年在香港爆发感染人的高致病 性H5N1病毒，除HA基因外，其余7个基因片段都与A/teal/Hong Kong/W312/97(H6Nl)病 毒高度相似，因此H6亚型AIV很可能成为高致病性H5亚型AIV的基因供体。2013年6月， 台湾发现了第一例人感染型H6N1亚型AIV，是一种低致病性禽流感病毒，其HA基因由台湾 H6亚型AIV支内进化而来。
[0004] 雁形目（鸭子、鹅、天鹅）和鹆形目（岸禽类鸟、鸥、燕鸥、海雀）是AIV潜伏的主 要自然宿主，其中特别是水禽，是所有亚型AIV的储存库，并经粪便排毒污染水系，通过直 接传播或候鸟的南北迁徙将病毒进一步散播开来，感染其它禽类和哺乳动物，因此水禽被 认为是流感病毒的天然储存库和新毒株的重要来源，在流感病毒的遗传进化和生态分布中 具有重要作用。低致病性AIV在健康鸭群中潜伏、繁殖和排毒，也可通过基因重排导致高致 病性禽流感的爆发，危害养禽业的安全，亦可能进化为可突破种间屏障的人禽流感病毒，危 害人类健康。
[0005] 病毒分离与鉴定是经典的流感检测方法，即先将样品接种SPF鸡胚增殖病毒2-5 天，再收集鸡胚尿囊液进行血凝试验和血凝抑制试验，结果准确可靠，但存在检测周期长的 缺点。酶联免疫吸附试验可检测禽流感的抗原，但需要特定的标准阳性血清。RT-PCR、实时 荧光定量RT-PCR和环介导等温扩增等分子生物学方法广泛应用于禽流感病毒的检测。


【发明内容】

[0006] 本发明所要解决的技术问题是如何鉴定禽流感病毒，并确定其HA亚型是否为H6 亚型及其NA亚型是否为Nl亚型。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的引物对组 合物。
[0008] 本发明所提供的鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的引物对组合物，为组合物1、组合物 2或组合物3 ;
[0009] 所述组合物1由独立包装的三个引物对组成，即由名称为H6的PCR引物对、名称 为Nl的PCR引物对和名称为M的PCR引物对组成；
[0010] 所述H6由序列表中SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的两条单链DNA组成；所述 Nl由序列表中SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的两条单链DNA组成；所述M由序列表中 SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示的两条单链DNA组成；
[0011] 所述组合物2由独立包装的两个引物对组成，即由所述H6和所述M组成；
[0012] 所述组合物3由独立包装的两个引物对组成，即由所述Nl和所述M组成。
[0013] 上述鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的引物对组合物中，所述组合物1为鉴定或辅助 鉴定禽流感病毒及其H6N1亚型的引物对组合物，所述组合物2为鉴定或辅助鉴定禽流感病 毒及其H6亚型的引物对组合物，所述组合物3为鉴定或辅助鉴定禽流感病毒及其Nl亚型 的引物对组合物。
[0014] 上述鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的引物对组合物中，所述H6、所述Nl和所述M均 可独立包装。
[0015] 其中，所述H6可以H6亚型禽流感病毒为模板进行RT-PCR获得447bp的DNA片段； 所述Nl可以Nl亚型禽流感病毒为模板进行RT-PCR获得325bp的DNA片段；所述M可以禽 流感病毒为模板进行RT-PCR获得669bp的DNA片段。
[0016] 上述鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的引物对组合物中，所述H6、所述Nl和所述M这 三种引物对可以单独使用分别进行单独的RT-PCR，也可以组合使用进行多重RT-PCR。这三 种引物对组合使用的方式有多种，可以是其中任两种引物对组合在一起使用，也可以是三 种引物对组合在一起使用。
[0017] 这三种引物对单独使用时，本申请的鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的引物对组合物 中这三种引物对的配比没有要求。这三种引物对组合在一起使用时，所述H6、所述Nl和所 述M的摩尔比为2 :1 :1。如这三种引物对中的所述H6和所述M组合在一起使用时，所述H6 和所述M的摩尔比为2 :1 ;如这三种引物对中的所述Nl和所述M组合在一起使用时，所述 Nl和所述M的摩尔比为I : 1。
[0018] 本申请中，每种引物对中的两条单链DNA的摩尔比均为1 :1。
[0019] 为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的PCR引物 对。
[0020] 本发明所提供的鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的PCR引物对为上述M，所述M由序列 表中SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示的两条单链DNA组成。
[0021] 为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的试剂或试剂 盒。
[0022] 本发明所提供的鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的试剂或试剂盒为下述H或I或J或 K ：
[0023] H、含有所述组合物1的试剂或试剂盒；
[0024] I、含有所述组合物2的试剂或试剂盒；
[0025] J、含有所述组合物3的试剂或试剂盒；
[0026] K、含有所述M的试剂或试剂盒。
[0027] 上述试剂或试剂盒中，所述试剂或试剂盒还包括反转录酶。
[0028] 上述试剂或试剂盒中，所述试剂或试剂盒还包括2Χ ISt印Buffer和 PrimeScript IStep Enzyme Mix。
[0029] 上述试剂或试剂盒中，所述H还包括记载有下述HI)和H2)的说明书：
[0030] Hl)在同一个PCR反应体系中，以待测生物样品的核酸（RNA或DNA)为模板，选用 50-57°C的退火温度，用所述组合物1进行PCR扩增得到PCR产物；
[0031] H2)检测步骤Hl)得到的PCR产物的大小，如果所述PCR产物中含有447bp和 669bp的DNA片段，所述待测样品含有H6亚型的禽流感病毒或候选含有H6亚型的禽流感病 毒；如果所述PCR产物中不含有447bp的DNA片段，所述待测样品不含有H6亚型的禽流感 病毒或候选不含有H6亚型的禽流感病毒；如果所述PCR产物中含有325bp和669bp的DNA 片段，所述待测样品含有Nl亚型的禽流感病毒或候选含有Nl亚型的禽流感病毒；如果所述 PCR产物中不含有325bp的DNA片段，所述待测样品不含有Nl亚型的禽流感病毒或候选不 含有Nl亚型的禽流感病毒；如果所述PCR产物中含有669bp的DNA片段，所述待测样品含 有禽流感病毒或候选含有禽流感病毒；如果所述PCR产物中不含有669bp的DNA片段，所述 待测样品不含禽流感病毒或候选不含禽流感病毒。
[0032] 上述试剂或试剂盒中，Hl)的RT-PCR体系中，每25 μ L RT-PCR反应体系含有： 2 X IStep Buffer 12.5 μ L，PrimeScript IStep Enzyme Mix lyL，SEQ ID No. 1、3和 5所 示单链DNA，SEQ ID No. 2、4和6所示单链DNA，浓度为IOng/ μ L的待测病毒RNA 1 μ L，以 无 RNA酶的超纯水补足25 μ L，使SEQ ID No. 1和2所示单链DNA的终浓度均为0. 4 μ Μ，使 SEQ ID No. 3和4所示单链DNA的终浓度均为0. 2 μ Μ，使SEQ ID No. 5和6所示单链DNA 的终浓度均为〇. 2 μ M。
[0033] 所述 RT-PCR 的反应程序如下：50°C 30min，94 °C 2min ;94°C 30s，50-57 °C 30s， 72°C 30s，30 个循环；72°C 10min。
[0034] 上述试剂或试剂盒中，所述50_57°C具体可为52°C。
[0035] 上述试剂或试剂盒中，所述I还包括记载有下述II)和12)的说明书：
[0036] II)在同一个PCR反应体系中，以待测生物样品的核酸（RNA或DNA)为模板，选用 50-57°C的退火温度，用所述组合物2进行PCR扩增得到PCR产物；
[0037] 12)检测步骤II)得到的PCR产物的大小，如果所述PCR产物中含有447bp和 669bp的DNA片段，所述待测样品含有H6亚型的禽流感病毒或候选含有H6亚型的禽流感病 毒；如果所述PCR产物中不含有447bp的DNA片段，所述待测样品不含有H6亚型的禽流感 病毒或候选不含有H6亚型的禽流感病毒；如果所述PCR产物中含有669bp的DNA片段，所 述待测样品含有禽流感病毒或候选含有禽流感病毒；如果所述PCR产物中不含有669bp的 DNA片段，所述待测样品不含禽流感病毒或候选不含禽流感病毒。
[0038] 上述试剂或试剂盒中，II)的RT-PCR体系中，每25 μ L RT-PCR反应体系含有： 2 X IStep Buffer 12.5 μ L，PrimeScript IStep Enzyme Mix lyL，SEQ ID No. 1 和 5所不 单链DNA，SEQ ID No. 2和6所示单链DNA，浓度为IOng/ μ L的待测病毒RNA 1 μ L，以无 RNA 酶的超纯水补足25 μ L，使SEQ ID No. 1和2所示单链DNA的终浓度均为0. 4 μ Μ，使SEQ ID No. 5和6所示单链DNA的终浓度均为0. 2 μ Μ。
[0039] 所述 RT-PCR 的反应程序如下：50°C 30min，94 °C 2min ;94°C 30s，50-57 °C 30s， 72°C 30s，30 个循环；72°C lOmin。
[0040] 上述试剂或试剂盒中，所述50-57°C具体可为52°C。
[0041] 上述试剂或试剂盒中，所述J还包括记载有下述Jl)和J2)的说明书：
[0042] Jl)在同一个PCR反应体系中，以待测生物样品的核酸（RNA或DNA)为模板，选用 50-57°C的退火温度，用所述组合物3进行PCR扩增得到PCR产物；
[0043] J2)检测步骤Jl)得到的PCR产物的大小，如果所述PCR产物中含有325bp和 669bp的DNA片段，所述待测样品含有Nl亚型的禽流感病毒或候选含有Nl亚型的禽流感病 毒；如果所述PCR产物中不含有325bp的DNA片段，所述待测样品不含有Nl亚型的禽流感 病毒或候选不含有Nl亚型的禽流感病毒；如果所述PCR产物中含有669bp的DNA片段，所 述待测样品含有禽流感病毒或候选含有禽流感病毒；如果所述PCR产物中不含有669bp的 DNA片段，所述待测样品不含禽流感病毒或候选不含禽流感病毒。
[0044] 上述试剂或试剂盒中，Jl)的RT-PCR体系中，每25 μ L RT-PCR反应体系含有： 2 X IStep Buffer 12.5 μ L，PrimeScript IStep Enzyme Mix lyL，SEQ ID No. 3和 5所不 单链DNA，SEQ ID No. 4和6所示单链DNA，浓度为IOng/ μ L的待测病毒RNA 1 μ L，以无 RNA 酶的超纯水补足25 μ L，使SEQ ID No. 3和4所示单链DNA的终浓度均为0. 2 μ Μ，使SEQ ID No. 5和6所示单链DNA的终浓度均为0. 2 μ Μ。
[0045] 所述 RT-PCR 的反应程序如下：50°C 30min，94 °C 2min ;94°C 30s，50-57 °C 30s， 72°C 30s，30 个循环；72°C 10min。
[0046] 上述试剂或试剂盒中，所述50_57°C具体可为52°C。
[0047] 上述试剂或试剂盒中，所述K还包括记载有下述Kl)和K2)的说明书：
[0048] Kl)在同一个PCR反应体系中，以待测生物样品的核酸（RNA或DNA)为模板，选用 50-57°C的退火温度，用所述M进行PCR扩增得到PCR产物；
[0049] K2)检测步骤Kl)得到的PCR产物的大小，如果所述PCR产物中含有669bp的DNA 片段，所述待测样品含有禽流感病毒或候选含有禽流感病毒；如果所述PCR产物中不含有 669bp的DNA片段，所述待测样品不含禽流感病毒或候选不含禽流感病毒。
[0050] 上述试剂或试剂盒中，Kl)的RT-PCR体系中，每25 μ L RT-PCR反应体系含有： 2 X IStep Buffer 12.5 μ L，PrimeScript IStep Enzyme Mix 1 μ L，SEQ ID No. 5 所不单链 DNA，SEQ ID No. 6所示单链DNA，浓度为IOng/ μ L的待测病毒RNA 1 μ L，以无 RNA酶的超 纯水补足25 μ L，使SEQ ID No. 5和6所示单链DNA的终浓度均为0. 2 μ Μ。
[0051] 所述 RT-PCR 的反应程序如下：50°C 30min，94 °C 2min ;94°C 30s，50-57 °C 30s， 72°C 30s，30 个循环；72°C 10min。
[0052] 上述试剂或试剂盒中，所述50_57°C具体可为52°C。
[0053] 为解决上述技术问题，本发明还提供了引物对组合物或鉴定或辅助鉴定禽流感病 毒的试剂或试剂盒的制备方法。
[0054] 本发明所提供的引物对组合物或鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的试剂或试剂盒的 制备方法中，所述引物对组合物为所述组合物1、所述组合物2或所述组合物3,所述鉴定或 辅助鉴定禽流感病毒的试剂或试剂盒为上述H或I或J ;所述引物对组合物或鉴定或辅助 鉴定禽流感病毒的试剂或试剂盒的制备方法包括将所述组合物1、所述组合物2或所述组 合物3中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
[0055] 为解决上述技术问题，本发明还提供了 PCR引物对或鉴定或辅助鉴定禽流感病毒 的试剂或试剂盒的制备方法。
[0056] 本发明所提供的PCR引物对或鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的试剂或试剂盒的制 备方法中，所述PCR引物对为所述M，所述鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的试剂或试剂盒为上 述K ;所述PCR引物对或鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的试剂或试剂盒的制备方法包括将所 述M的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
[0057] 本申请中的 2 X IStep Buffer 和 PrimeScript IStep Enzyme Mix 均为 PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver. 2 中试剂，PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver. 2为宝生物工程（大连）有限公司产品，货号为RR055A。
[0058] 实验证明，用本发明的引物对组合物1以H6N1亚型的禽流感病毒RNA为模板进行 的RT-PCR，能扩增出大小为447bp、325bp和669bp的条带，用本发明的引物对组合物1以 H6Nx (X尹1)亚型的禽流感病毒RNA为模板进行的RT-PCR，能扩增出大小为447bp和669bp 的条带，用本发明的引物对组合物1以HxNl (X尹6)亚型的禽流感病毒RNA为模板进行的 RT-PCR，能扩增出大小为325bp和669bp的条带，用本发明的引物对组合物1以HxNy (X尹6， y尹1)亚型的禽流感病毒RNA为模板进行的RT-PCR，能扩增出大小为669bp的条带，用本 发明的引物对组合物1以其他病毒核酸为模板进行的三重RT-PCR，均不能扩增出条带，表 明本发明的引物对组合物可用来鉴定禽流感病毒及其H6亚型、Nl亚型。
[0059] 本发明的引物对组合物对H6N1亚型AIV具有较高的灵敏度和特异性：本发明的引 物对组合物1能检测出500拷贝/25 μ L的H6N1亚型AIV ;本发明的引物对组合物1能特 异性地检测禽流感病毒、Η6Ν1亚型禽流感病毒、Η6亚型禽流感病毒和Nl亚型禽流感病毒。
[0060] 相比传统的病毒分离方法和序列测定方法，利用本发明的引物对组合物进行三重 RT-PCR鉴定禽流感病毒的方法，节约了检测试剂，简化了反应程序，且结果与病毒分离鉴定 和序列测定一致。因此，利用本发明的引物对组合物进行三重RT-PCR鉴定禽流感病毒的方 法是一种简便、快速、有效的检测技术。

【专利附图】

【附图说明】
[0061] 图1为本发明的引物对组合物的敏感性实验结果。其中，泳道M为DL lOOOMarker， 泳道1为H6N1RNA终浓度为5X IO7拷贝/25 μ L，泳道2为H6N1RNA终浓度为5X IO6拷贝 /25 μ L，泳道3为H6N1RNA终浓度为5 X IO5拷贝/25 μ L，泳道4为H6N1RNA终浓度为5 X IO4 拷贝/25 μ L，泳道5为H6N1RNA终浓度为5 X IO3拷贝/25 μ L，泳道6为H6N1RNA终浓度为 500拷贝/25 μ L，泳道7为H6N1RNA终浓度为50拷贝/25 μ L，泳道8为阴性对照。
[0062] 图2为本发明的引物对组合物的特异性实验结果。其中，泳道M为DL lOOOMarker， 泳道1为H6N1，泳道2为H6N1，泳道3为H6N2,泳道4为H6N2,泳道5为H6N5,泳道6为 H6N6,泳道7为H6N6,泳道8为H6N8,泳道9为H1N1，泳道10为H2N3,泳道11为H3N2,泳 道12为H4N5,泳道13为H5N1，泳道14为H7N2,泳道15为H8N4,泳道16为H9N2,泳道17 为H10N3,泳道18为H11N9,泳道19为H12N5,泳道20为H13N5,泳道21为NDV，泳道22为 IBV，泳道23为ILTV，泳道24为阴性对照。
[0063] 图3为本发明的引物对组合物和引物对组合物N的三重RT-PCR结果。其中，泳道 M为DL IOOOMarker ;泳道1-5为引物对组合物N的三重RT-PCR结果，其中泳道1-4的模板 均为H6N1RNA，泳道5为阴性对照；泳道6-10为本发明的引物对组合物的三重RT-PCR结果， 其中泳道6-9的模板均为H6N1RNA，泳道10为阴性对照。

【具体实施方式】
[0064] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0065] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0066] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0067] 下述实施例中的 MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction 试剂盒（MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver. 4.0)为宝生物工程（大连）有限公司产品，货号为9766。
[0068] 下述实施例中的 2 X IStep Buffer 和 PrimeScript IStep Enzyme Mix 均为 PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver. 2 中试剂，PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver. 2为宝生物工程（大连）有限公司产品，货号为RR055A。
[0069] 下述实施例中的H6N8亚型禽流感病毒、HlNl亚型禽流感病毒、H2N3亚型禽流感 病毒、H3N2亚型禽流感病毒、H5N1亚型禽流感病毒、H7N2亚型禽流感病毒、H8N4亚型禽 流感病毒、H9N2亚型禽流感病毒和H12N5亚型禽流感病毒、新城疫病毒（NDV)、鸡传染性 支气管炎病毒（IBV)、鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV) (Yi Peng, et al. Visual detection of H3 subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Virology Journal, 2011，8:337)公众可从广西壮方矣自 治区兽医研究所（即 申请人:）获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为 其它用途使用。
[0070] 下述实施例中的H6N1亚型禽流感病毒、H6N2亚型禽流感病毒、H6N5亚型禽流感 病毒和H6N6亚型禽流感病毒（周辰瑜，H6亚型禽流感病毒病原学监测和快速检测方法的 研究，广西大学2012年硕士毕业论文，2012-06-01.)公众可从广西壮族自治区兽医研究所 (即 申请人:）获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0071] 下述实施例中的H4N5亚型禽流感病毒、H10N3亚型禽流感病毒和H11N9亚型禽流 感病毒（罗思思，谢芝励，刘加波，等.H7N9亚型AIV双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的 建立[J].动物医学进展，2013, 34(12) :1-5.)公众可从广西壮族自治区兽医研究所（即申 请人）获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0072] 下述实施例中的H13N5亚型禽流感病毒（Xie Z，Pang Y S，Liu J，et al. A multiplex RT-PCR for detection of type a influenza virus and differentiation of avian H5, H7 and H9 hemagglutinin subtypes[J]. Mol Cell Probes,2006,20(3-4)： 245-249.)公众可从广西壮族自治区兽医研究所（即 申请人:）获得，该生物材料只为重复本 发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0073] 下述实施例中的pGEM T-easy载体为Promega公司（美国）产品，货号为A3600。
[0074] 实施例1、制备鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的引物对组合物
[0075] 鉴定或辅助鉴定禽流感病毒（AIV)的引物对组合物，由名称为H6的PCR引物对、 名称为Nl的PCR引物对和名称为M的PCR引物对组成；所述H6由序列表中SEQ ID No. 1所 示的单链DNA (H6-F)和SEQ ID No. 2所示的单链DNA (H6-R)组成，可从H6亚型的禽流感病 毒中扩增出大小为447bp的条带；所述Nl由序列表中SEQ ID No. 3所示的单链DNA (Nl-F) 和SEQ ID No. 4所示的单链DNA(Nl-R)组成，可从Nl亚型的禽流感病毒中扩增出大小为 325bp的条带；所述M由序列表中SEQ ID No. 5所示的单链DNA (M-F)和SEQ ID No. 6所示 的单链DNA(M-R)组成，可从禽流感病毒中扩增出大小为669bp的条带。
[0076] 上述鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的引物对组合物中，所述H6、所述Nl和所述M独 立包装。每种引物对中的两条单链DNA的摩尔比均为1 :1。
[0077] 实施例2、实施例1的鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的引物对组合物的敏感性实验
[0078] 按照MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction试剂盒说明书，从H6N1亚型禽流感病 毒抽提得到浓度为IOng/ μ L的H6N1亚型禽流感病毒总RNA (简称H6N1RNA)。
[0079] 分别用文献 Hoffmann Ε, Stech J, Guan Υ, et al. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses [ J]. Arch Virol, 2001, 146:2275 - 2289 中 HA、NA 和 M 基因引物，以 H6N1RNA 为模板进行 RT-PCR 扩 增，反应体系如下：2X IStep Buffer 12.5 μ L，PrimeScript IStep Enzyme Mix 1 μ L，HA 或NA或M基因的上游引物（25μΜ)0. 5yL，HA或NA或M基因的下游引物（25μΜ)0. 5yL， H6NlRNA(10ng/yL)lyL，以无 RNA酶的超纯水补足25yL;反应程序如下：94°C 5min， 94°C lmin、52°C I. 5min、72°C I. 5min、35 个循环，72°C 8min, KTC终止反应。RT-PCR 扩增结 束后分别得到1744bp的HA基因片段、1458bp的NA基因片段和1027bp的M基因片段，将这 三个基因片段分别连接至PGEM T-easy载体上，将含有HA基因片段的正确序列的重组载体 命名为T-H6,将含有NA基因片段的正确序列的重组载体命名为为T-Nl，将含有M基因片段 的正确序列的重组载体命名为为T-M。
[0080] 利用限制性内切酶Spe I酶切重组载体T-H6,得到线性化T-H6,用RNA体外转录 试剂盒（美国Promega公司，货号为P1280)转录线性化T-H6,并利用RNA纯化试剂盒（宝 生物工程（大连）有限公司产品，货号为9767)纯化转录产物，得到纯化的T-H6RNA。
[0081] 按照上述方法，将T-H6分别替换为T-Nl和T-M，其他步骤均不变，分别得到纯化的 T-NlRNA 和纯化的 T-M RNA。
[0082] 利用NanoDrop ND-1000微量核酸检测仪对T-H6RNA、T-NlRNA和T-M RNA进行浓 度检测，根据分子量和核酸浓度计算拷贝数，将T-H6RNA、T-NlRNA和T-M RNA进行等拷贝数 混合，并进行稀释，分别得到T-H6RNA、T-N1RNA和T-M RNA的浓度均为5 X IO7拷贝/ μ L的 5 X IO7 拷贝 / μ L RNA、T-H6RNA、T-N1RNA 和 T-M RNA 的浓度均为 5 X IO6 拷贝 / μ L 的 5 X IO6 拷贝 / μ L RNA、T-H6RNA、T-NlRNA 和 T-M RNA 的浓度均为 5 X IO5 拷贝 / μ L 的 5 X IO5 拷贝 / μ L RNA、T-H6RNA、T-NlRNA 和 T-M RNA 的浓度均为 5 X IO4 拷贝 / μ L 的 5 X IO4 拷贝 / μ L RNA、T-H6RNA、T-NlRNA 和 T-M RNA 的浓度均为 5 X IO3 拷贝 / μ L 的 5 X IO3 拷贝 / μ L RNA、 T-H6RNA、T-NlRNA 和 T-M RNA 的浓度均为 500 拷贝 / μ L 的 500 拷贝 / μ L RNA、T-H6RNA、 T-NlRNA和T-M RNA的浓度均为50拷贝/ μ L的50拷贝/ μ L RNA。
[0083] 按照下述25 μ L的一步法RT-PCR反应体系进行三重RT-PCR :2 X ISt印 BufTerl2.5yL，P;rimeSc;ript IStep Enzyme Mix lyL，SEQ ID Νο·1、3 和 5 所不单链 DNA, SEQ ID No. 2、4和6所示单链DNA，5 X IO7拷贝/ μ L RNA 1 μ L，以无 RNA酶的超纯水补足 25 μ L，使SEQ ID No. 1和2所示单链DNA的终浓度均为0. 4 μ Μ，使SEQ ID No. 3和4所示 单链DNA的终浓度均为0. 2 μ M，使SEQ ID No. 5和6所示单链DNA的终浓度均为0. 2 μ M， 得到5 X IO7拷贝RNA的反应体系。
[0084] 按照上述方法，将"5 X IO7拷贝/ μ L RNA"分别替换为"5 X IO6拷贝/ μ L RNA"、 "5Xl〇1#W/yLRNA"、"5Xl〇4#W/yLRNA"、"5Xl〇1#W/yLRNA"、"5Xl〇1#W/ μ L RNA"或"5 X IO1拷贝/ μ L RNA"分别得到5 X IO6拷贝RNA的反应体系、5 X IO5拷贝RNA 的反应体系、5 X IO4拷贝RNA的反应体系、5 X IO3拷贝RNA的反应体系、500拷贝H6N1RNA的 反应体系和50拷贝RNA的反应体系。
[0085] 按照上述方法，将5Χ107拷贝/yL RNA替换为无 RNA超纯水，得到阴性对照的反 应体系。
[0086] 反应程序均为：50°C 30min, 94°C 2min ;94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 30s, 30 个循环； 72 °C 10min〇
[0087] 将各三重RT-PCR获得的产物分别进行琼脂糖凝胶电泳（图1)，结果显示，5X107 拷贝?5X IO3拷贝RNA的反应体系中均有3条明显的扩增条带出现，片段大小分别为 447bp、325bp、669bp ;500拷贝RNA的的反应体系中有2条扩增条带的出现，大小分别为 447bp、325bp，50拷贝RNA的反应体系和阴性对照的反应体系中均无扩增条带。因此，本发 明的引物对组合物最低能检测到浓度为5X IO3拷贝/25 μ L的禽流感病毒以及500拷贝 /25 μ L的Η6Ν1亚型禽流感病毒。
[0088] 实施例3、实施例1的鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的引物对组合物的特异性实验
[0089] 1、检测样品的制备
[0090] 实验中用到的病毒分别是Η6Ν1亚型禽流感病毒、Η6Ν2亚型禽流感病毒、Η6Ν5亚型 禽流感病毒、Η6Ν6亚型禽流感病毒、Η6Ν8亚型禽流感病毒、HlNl亚型禽流感病毒、Η2Ν3亚型 禽流感病毒、Η3Ν2亚型禽流感病毒、Η4Ν5亚型禽流感病毒、Η5Ν1亚型禽流感病毒、Η7Ν2亚 型禽流感病毒、Η8Ν4亚型禽流感病毒、Η9Ν2亚型禽流感病毒、Η10Ν3亚型禽流感病毒、Η11Ν9 亚型禽流感病毒、Η12Ν5亚型禽流感病毒和Η13Ν5亚型禽流感病毒、新城疫病毒（NDV)、传染 性支气管炎病毒（IBV)和传染性喉气管炎病毒（ILTV)。
[0091] 2、利用实施例1的引物对组合物对病毒的核酸进行三重RT-PCR
[0092] 1)病毒RNA的提取
[0093] 按照MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction试剂盒说明书，分别抽提得到步骤1中 禽流感病毒（H6N1、H6N2、H6N5、H6N6、H6N8、HlNl、H2N3、H3N2、H4N5、H5N1、H7N2、H8N4、H9N2、 H10N3、H11N9、H12N5、H13N5 和 H15N8 亚型）、NDV、IBV 的总 RNA，提取得到 ILTV 的 DNA。
[0094] 2)三重RT-PCR反应及电泳检测
[0095] 分别以上述步骤1)中各个病毒的RNA为模板，以无 RNA超纯水为阴性对照，利用 实施例1中的H6、Nl和M进行三重RT-PCR。
[0096] 每个三重RT-PCR均为25 μ L的一步法RT-PCR反应体系：2 X ISt印Buffer 12.5yL，PrimeScript ISt印 Enzyme Mix lyL，SEQ ID Νο·1、3 和 5 所示单链 DNA，SEQ ID No. 2、4和6所示单链DNA，浓度为IOng/ μ L的病毒核酸或无 RNA超纯水1 μ L，以无 RNA酶 的超纯水补足25 μ L，使SEQ ID No. 1和2所示单链DNA的终浓度均为0. 4 μ Μ，使SEQ ID No. 3和4所示单链DNA的终浓度均为0. 2 μ Μ，使SEQ ID No. 5和6所示单链DNA的终浓度 均为0. 2 μ M。
[0097] 反应程序均为：50°C 30min, 94°C 2min ;94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 30s, 30 个循环； 72 °C 10min〇
[0098] 将各三重RT-PCR获得的产物分别进行琼脂糖凝胶电泳（图2)，结果显示，H6N1亚 型禽流感病毒（泳道1和2)扩增出大小分别为325bp、447bp和669bp的条带；H6N2亚型禽 流感病毒（泳道3和4)、H6N5亚型禽流感病毒（泳道5)、H6N6亚型禽流感病毒（泳道6和 7)和H6N8亚型禽流感病毒（泳道8)均扩增出大小为447bp和669bp的条带；HlNl亚型禽 流感病毒（泳道9)和H5N1亚型禽流感病毒（泳道13)均扩增出大小为325bp和669bp的 条带；H2N3亚型禽流感病毒（泳道10)、H3N2亚型禽流感病毒（泳道11)、H4N5亚型禽流感 病毒（泳道12)、H7N2亚型禽流感病毒（泳道14)、H8N4亚型禽流感病毒（泳道15)、H9N2 亚型禽流感病毒（泳道16)、H10N3亚型禽流感病毒（泳道17)、H11N9亚型禽流感病毒（泳 道18)、H12N5亚型禽流感病毒（泳道19)和H13N5亚型禽流感病毒（泳道20)均只扩增出 大小为669bp的条带；NDV (泳道21)、IBV (泳道22)、ILTV (泳道23)及阴性对照（泳道24) 均未扩增出任何条带。结果和预期相符，表明本发明的引物对组合物可用来鉴定禽流感病 毒及其HA亚型和NA亚型：RT-PCR产物中若有大小分别为325bp、447bp和669bp的条带， 表明该病毒为H6N1亚型禽流感病毒；RT-PCR产物中若只有大小分别为325bp和669bp的 条带，表明该病毒为HxNl (X尹6)亚型禽流感病毒；RT-PCR产物中若只有大小分别为447bp 和669bp的条带，表明该病毒为H6Nx(x尹1)亚型禽流感病毒；RT-PCR产物中若仅有大小 为669bp的条带，表明该病毒为HxNy亚型禽流感病毒（X尹6, y尹I) ;RT-PCR产物中若无 任何条带，表明该病毒非禽流感病毒。该实验结果说明实施例1的鉴定或辅助鉴定禽流感 病毒的引物对组合物能特异性地检测H6N1亚型禽流感病毒、H6亚型禽流感病毒和Nl亚型 禽流感病毒。实施例1的鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的引物对组合物中的名称为M的PCR 引物对能特异性地检测禽流感病毒。
[0099] 实施例4、三重RT-PCR鉴定禽流感病毒
[0100] 1、样品采集
[0101] 从活禽市场采集鸡、鸭咽肛棉拭子305份，分别用含有抗生素的PBS溶液（PBS溶 液中青霉素的浓度为〇. 8万单位/mL，硫酸链霉素的浓度为I. 0万单位/mL，庆大霉素的浓 度为0. 5mg/mL，制霉菌素的浓度为0. 5mg/mL)充分浸泡棉拭子（约4小时），反复挤压和清 洗棉拭子，8000rpm/min离心5min，得到305份棉拭子的上清液。
[0102] 2、三重RT-PCR确定禽流感病毒及其亚型
[0103] 取步骤1的305份棉拭子的上清液（样品1-305)，按照MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction试剂盒说明书，分别提取并得到305份样品的总RNA，分别调整每份样品总RNA 的浓度，使这305份样品的总RNA的浓度均为IOng/ μ L。按照下述方法，分别对每份样品的 总RNA进行三重RT-PCR :
[0104] 每个三重RT-PCR均为25 μ L的一步法RT-PCR反应体系：2 X ISt印Buffer 12.5yL，PrimeScript ISt印 Enzyme Mix lyL，SEQ ID Νο·1、3 和 5 所示单链 DNA，SEQ ID No. 2、4和6所示单链DNA，病毒RNA (IOng/μ L) 1 μ L，以无 RNA酶的超纯水补足25 μ L，使SEQ ID No. 1和2所示单链DNA的终浓度均为0. 4 μ Μ，使SEQ ID No. 3和4所示单链DNA的终 浓度均为〇. 2 μ M，使SEQ ID No. 5和6所示单链DNA的终浓度均为0. 2 μ M。
[0105] 反应程序均为：50°C 30min, 94°C 2min ;94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 30s, 30 个循环； 72 °C 10min〇
[0106] 将各三重RT-PCR获得的产物分别进行琼脂糖凝胶电泳（表I)，结果显示，这305 份样品的总RNA的三重RT-PCR结果中，43份（样品1-43)均能扩增出大小为669bp的条 带，表明样品1-43含有禽流感病毒。样品1-43中，样品1-2还能扩增出大小为447bp和 325bp的条带，表明样品1-2中的禽流感病毒的HA亚型均为H6亚型、NA亚型均为Nl亚型， 即样品1-2中的禽流感病毒均为H6N1亚型禽流感病毒；样品1-43中，样品3-9还能扩增出 大小为447bp的条带但不能扩增出325bp的条带，表明样品3-9中的禽流感病毒的HA亚型 均为H6亚型、NA亚型均不为Nl亚型，即样品3-9中的禽流感病毒均为H6Nx(x尹1);样品 1-43中，样品10-15还能扩增出大小为325bp的条带但不能扩增出447bp的条带，表明样品 10-15中的禽流感病毒的HA亚型均不为H6亚型、NA亚型均为Nl亚型，即样品10-15中的 禽流感病毒均为HxNl (X尹6)。305份样品中的样品44-305均不能扩增到条带，说明样品 44-305均不含禽流感病毒。
[0107] 3、常规方法确定禽流感病毒及其亚型
[0108] 按照如下病毒分离方法鉴定棉拭子的上清液中AIV :取步骤1的305份棉拭子的 上清液（样品1-305)分别接种SPF鸡胚，收集24-96h致死的鸡胚尿囊液和96h以上未致 死的鸡胚尿囊液，取尿囊液进行血凝试验。结果显示（表1)，样品1-43均具有血凝性，表明 样品1-43均含有禽流感病毒。
[0109] 取有血凝价的样品（样品1-43)进行血凝抑制试验，确定感染的AIV的HA亚型 (表1)。结果显示，样品1-9中的禽流感病毒的HA亚型均为H6亚型，样品10-15中的禽流 感病毒的HA亚型均为Hl亚型，样品16-26中的禽流感病毒的HA亚型均为H9亚型，样品 27-35中的禽流感病毒的HA亚型均为H3亚型，样品36-43中的禽流感病毒的HA亚型均为 H4亚型。
[0110] 通过文献（Hoffmann E,Stech J, Guan Y, et al. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses [ J]. Arch Virol, 2001，146:2275 - 2289)中克隆测定的方法，确定样品1-43中的AIV的NA亚型（表 1)。结果显示，样品1-2、10-15中的禽流感病毒的NA亚型均为Nl亚型，样品3-5、16-25、 27-39中的禽流感病毒的NA亚型均为N2亚型，样品6-7和40-43中的禽流感病毒的NA亚 型均为N6亚型，样品8中的禽流感病毒的NA亚型为N5亚型，样品9和26中的禽流感病 毒的NA亚型均为N8亚型。
[0111] 结果表明，用本发明的引物对组合物检测H6亚型和Nl亚型禽流感病毒结果与病 毒分离鉴定、血凝抑制试验和序列测定方法确定的禽流感病毒及其H6亚型和Nl亚型是一 致的，对于其他HA亚型（H3、H4和H9等）和NA亚型（N2、N5、N6和N8等）不发生交叉反 应。因此，本发明的三重RT-PCR及引物对组合物可以用来确定是否为禽流感病毒，并进一 步确定HA亚型是否为H6亚型、NA亚型是否为Nl亚型的禽流感病毒。
[0112] 表1、305份棉拭子中禽流感病毒及其H6亚型和Nl亚型的鉴定
[0113]
[0114]

【权利要求】
1. 鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的引物对组合物，为组合物I、组合物2或组合物3 ; 所述组合物1由独立包装的三个引物对组成，即由名称为H6的PCR引物对、名称为Nl 的PCR引物对和名称为M的PCR引物对组成； 所述H6由序列表中SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的两条单链DNA组成；所述NI 由序列表中SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的两条单链DNA组成；所述M由序列表中SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示的两条单链DNA组成； 所述组合物2由独立包装的两个引物对组成，即由所述H6和所述M组成； 所述组合物3由独立包装的两个引物对组成，即由所述NI和所述M组成。
2. 鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的PCR引物对，其特征在于：所述PCR引物对为权利要 求1所述的M，所述M由序列表中SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示的两条单链DNA组成。
3. 鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒含有 权利要求1所述的引物对组合物。
4. 根据权利要求3所述的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒还包括反转 录酶。
5. 根据权利要求3或4所述的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒还包括 PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver. 2 试剂盒中的 2X IStep Buffer 和 PrimeScript IStep Enzyme Mix。
6. 鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒含有 权利要求2所述的PCR引物对。
7. 根据权利要求6所述的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒还包括反转 录酶。
8. 根据权利要求6或7所述的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒还包括 PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver. 2 试剂盒中的 2X IStep Buffer 和 PrimeScript IStep Enzyme Mix。
9. 权利要求1所述的引物对组合物或权利要求3或4或5所述的试剂或试剂盒的制备 方法，包括将权利要求1所述的引物对组合物中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包 装的步骤。
10. 权利要求2所述的PCR引物对或权利要求6或7或8所述的试剂或试剂盒的制备 方法，包括将权利要求2所述的PCR引物对中的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
【文档编号】C12Q1/70GK104313190SQ201410652473
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年11月17日 优先权日:2014年11月17日
【发明者】谢芝勋, 罗思思, 谢志勤, 邓显文, 刘加波, 黄莉, 黄娇玲, 曾婷婷 申请人:广西壮族自治区兽医研究所