酶的固定化载体及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】一种酶的固定化载体及其制备方法与应用，所述酶的固定化载体是直径长度为0.8～3cm成球碳纤维，其中，所述成球碳纤维球团高径比为H/D＝0.6/1～1/0.6。所述酶的固定化载体的制备方法是，先将长度为0.3cm～0.7cm短切碳纤维进行预处理后备用；然后将预处理完的短切碳纤维以2.0～20g/L的投入量投入到含水溶液的容器中，放置于摇床中，控制摇床转速为150rpm～220rpm，摇动0.5～4h，可控成球，即成。还包括酶的固定化载体的应用。将本发明之酶的固定化载体用于制备固定化酶，可提高固定化酶产物的产率，增强酶固定化效果。实验证明，成球碳纤维固定化载体的比表面积可达13～14m2/g，固定于成球碳纤维载体上的酶的残留活性在12％以上，所得的固定化酶重复使用4～5次，酶的活力仍可保留在62％～71％。
【专利说明】酶的固定化载体及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种酶的固定化载体及其制备方法与应用，具体涉及一种酶的固定化成球碳纤维载体及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]酶的固定化是指通过化学或物理的处理方法，使原来水溶性的酶与固态的水不溶载体相结合或被载体包埋。目前，传统的酶固定化的方法主要有吸附法、共价结合法、包埋法及交联法四大类，各种固定化方法有利有弊。其中，吸附法是常用的固定化方法之一，虽然吸附法主要依靠蛋白质和载体之间的结合力联结，作用力较弱，酶容易脱落，但是载体选择范围较广，价格低廉，固定化操作过程简单、操作条件温和、不易破坏酶分子的高级结构以及活性中心的构象，酶活回收率较高，载体可以回收重复利用，因此吸附法是在经济上最具吸引力的固定化方法。
[0003]吸附法固定化酶的性能关键因素取决于选取的固定化载体材料和固定化所采用的方法。其中，固定化载体材料作为固定化酶的一部分，载体材料的结构和性能对固定化酶的各种性能都有着巨大直接的影响。目前，酶使用的固定化载体材料主要有:有机高分子载体、无机载体、复合载体三种。有机高分子载体具有很强的灵活性，可根据不同类型的酶来设计与之相匹配的载体材料，并且也具有较大的强度、对微生物的腐蚀有较强的抵抗力，但传质性能较差，这对酶固定时对酶活性的影响较大。无机载体具有一些有机材料不具备的优点，例如，稳定性好、机械强度高、对微生物无毒性、不易被微生物所分解、耐酸碱、成本低、寿命长等；但固定化效率一般来说比较低。复合载体具有从反应体系中易分离和回收、操作简便、成本较低的优点；但技术发展得还不成熟。当前，酶固定化的载体都存在成球难或不易控制得缺点，并且不能在固定化过程中重复利用，使得成本较高；同时颗粒状的固定化方法制作也困难，从而导致固定化酶技术工业推广困难。因此，设计、开发和制备性能优异可控的载体材料已成为固定化酶研宄的热点之一。
[0004]酶的固定化载体和固定化的选择，总的原则就是要考虑维持酶的催化活性和专一性，酶与载体结合牢固，载体的机械强度要高，固定化酶要有最小的空间位阻，载体是惰性的；固定化酶要价格低廉，并且操作要简便、稳定。碳纤维是一种含碳量在95%以上的高强度、高模量纤维的新型纤维材料，具有生物相容性好、化学性能稳定、高比表面积、耐高温等优良性能，这些特点决定碳纤维以及活性炭纤维具备成为良好的酶固定化载体的特性。目前，碳纤维类材料作为固定化载体的优越性已逐渐被越来越多的研宄人员所重视。但是碳纤维材料作为酶固定化载体的研宄和应用仅限于考量固定化效果方面的研宄。碳纤维作为固定化载体的材料特性与酶的固定化机制及相互作用关系几乎没有报道，尤其是载体的成球制备方法和酶的固定化方法更是研宄的甚少。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是，提供一种具有较大的表面积和较小的空间体积的酶的固定化载体及其制备方法与应用，由此，可提高固定化酶产物的产率，更加显著增强酶固定化效果。
[0006]本发明解决其技术问题采用的技术方案是:
[0007]本发明之一种酶的固定化载体，所述固定化载体是直径长度为0.8?3挪成球碳纤维，其中，所述成球碳纤维的球团高径比为!1/0 = 0.6/1?1/0.6。
[0008]进一步，所述成球碳纤维的球团高径比为11/0 = 1/0.8。
[0009]本发明之一种酶的固定化载体的制备方法，包括以下步骤:
(1)预处理:将碳纤维切成长度为0.8挪短切碳纤维放入有机溶剂中浸泡3?5匕，过滤或离心回收上清液，用相当于3?5倍碳纤维体积的水对短切碳纤维进行清洗，然后将清洗后的短切碳纤维浸泡于体积大于3倍碳纤维体积的沸水浴中处理3?5卜后，用水清洗后，烘干，取出备用；
(2)成球:将经步骤(1)中预处理的短切碳纤维，以投入量为2.0?208/1投入含水溶液的容器中，然后放置于摇床中，控制摇床转速为120印111?220印111，摇动0.5?处，即得酶的固定化载体。
[0010]进一步，步骤(1)中，将碳纤维切成长度为0.4?0.6(^短切碳纤维放入丙酮中浸泡处，过滤或离心回收上清液，用相当于5倍碳纤维体积的蒸馏水对短切碳纤维进行清洗，然后将清洗后的短切碳纤维浸泡于体积6倍碳纤维体积的沸水浴中处理处后，用蒸馏水清洗后，烘干，取出备用；
[0011]进一步，步骤⑵中，将经步骤⑴中预处理的短切碳纤维，以等量方式每隔0.5?5分钟投入一次，共投放3?5次。
[0012]进一步，步骤(2)中，所述短切碳纤维投入量为2.5?158凡；在250此摇瓶中，所述含水溶液的量相当于10?50倍碳纤维体积。
[0013]进一步，所述含水溶液选自无菌水、无菌含水种子培养基、无菌含水含菌种培养液中的任一种；所述碳纤维选自2&碳纤维、3&碳纤维、6&碳纤维、2处碳纤维、补强布中的任一种。碳纤维种类的选取可多样化，但所选择的碳纤维需经过剪裁至适宜的长度后才能发生成球的现象。
[0014]进一步，所述含水溶液选自无菌水；所述碳纤维选自6&碳纤维。
[0015]本发明之一种酶的固定化载体在酶固定化中的应用，将所述固定化载体加入到相应缓冲液配制的相应酶溶液中，室温下搅拌反应，于2?61:静置过夜，洗去游离酶，即得固定化酶。
[0016]本发明提出的碳纤维自成球方案，其成球状态受到一些参数的改变而发生变化:
(1)成球大小的改变
碳纤维自成球的大小主要与碳纤维的加入方法有关。若一次性将2.0-20^/1的碳纤维投入到液体中，然后放入120印111?220印111的摇床内摇动0.5?411后，可能会形成的大小不均一的球团；反之，若将碳纤维分成若干等分，每隔2分钟投入至液体中，在同等条件下将会形成图1所示大小均一的小球团。
碳纤维的长短和投入量对碳纤维成球的大小也有一定影响，碳纤维长度和投入量的参数分别在0.4?0.7(3111和10?15邑凡的条件下，形成大小均一的较小球团。而碳纤维长度大于0.70111或投入量超过158/1时，会形成较大型的球团。 (2)成球圆扁的改变
碳纤维成球的形态有的较为饱满圆滑，而有的则扁平一些。影响成球圆扁形态的主要因素是容器内液体的加入量。若加液量多于5倍碳纤维体积，则生成较扁的碳纤维球团，球团高径比!1/0 = 0.6/1?1/0.6 ；而加液量少于3倍碳纤维体积，所生成的碳纤维球团高径比为11/0 = 1/0.4?0.4/1 ；若加液量刚刚能将球覆盖，碳纤维成球形态较圆滑，球团高径比为11/0 = 1/0.8?0.8/1。另一个影响碳纤维成球圆扁程度的相关因素为液体环境的粘度，在无菌水、含水培养液、含水含菌种培养液中，三者粘度依次增高，在粘度较高的含水含菌种培养液环境下，成球较扁一些，在粘度较低的无菌水中则较为饱满，但差别不显著。
(3)成球数量的改变
碳纤维的成球数量与其投入量有关，在投入量为2.0?158/1的范围内，成球的数量随着投入量的增加而增加。此外，碳纤维长度也会对成球数量造成影响，在投入量相同的条件下，选择长度较短的碳纤维所生成的球团数量较多。
(4)成球均一性的改变
碳纤维成球的均一,性对固定化效果有一定影响，成球均一,性的改变主要与加入方法、加入的液体量有关，液体的加入量应刚好能覆盖成球碳纤维，且投入碳纤维时分开等量投入，成球的圆扁控制在高径比为只/0 = 1/0.8?0.8/1左右，使得小球能达到最佳圆滑饱满程度，并在水中分布均匀。
(5)碳纤维种类所引起的成球差异
通过投入不同种类的碳纤维，包括2&碳纤维、3&碳纤维、6&碳纤维、2处碳纤维、补强布等，发现不同种类的碳纤维在可控成球方面具有不同的形态特征。在所选碳纤维种类中，纤维束较少的碳纤维所成球更加圆滑，但数量较少；而纤维束较多的碳纤维数量较多，但也有可能会形成较大的球团。
[0017]本发明利用碳纤维可控成球这一技术，主要通过物理吸附法使酶吸附在碳纤维表面固定，形成固定化酶。其中，碳纤维材料，无论是活性炭纤维还是改性后的碳纤维，其在固定化应用中所使用的固定方法多通过自身物理吸附性对酶进行固定。其优势在于，可通过改变条件，控制碳纤维在液体环境下的成球效果；利用成球的碳纤维载体，对酶进行固定化。
[0018]本发明之固定化载体碳纤维具有可控成球的现象，机理在于碳纤维受到范德华力、静电排斥力和空间斥力和疏水力的作用达到平衡、相互制约，并且形成聚结态。同时又受到摇床所给的撞击力、向心力和水的压力作用而形成球状。碳纤维载体的成球大小、圆扁、数量等受到碳纤维自身和外部环境的影响。
[0019]本发明之酶的固定化载体具有较大表面积且所占空间较小的优点，可提高固定化酶产物的产率，增强酶固定化效果，在酶的固定化领域中具有很大的应用范围。实验证明，成球碳纤维固定化载体的比表面积可达13?14！1127^，固定于成球碳纤维载体上的酶的回收率在12%以上。所得的固定化酶重复使用4?5次，酶的活力仍可保持在第一批时的62%?71%。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为可控成球的碳纤维载体固定化酶。
【具体实施方式】
[0021]下面结合实施例，对本发明的具体的实施方式进一步详细描述。以下实施例是用来进一步说明本发明的内容，而不限制本发明的保护范围。对于本发明所涉及的相关内容及所做的修改，均属于本发明保护范围。
[0022]实施例1
[0023](1)成球碳纤维固定化纤维素酶
将6&碳纤维短切成0.50.11的长度，然后进行预处理:在丙酮中浸泡41！后，过滤回收清液，用相当于5倍碳纤维体积的蒸馏水对短切碳纤维进行清洗，然后将清洗后的短切碳纤维浸泡于体积6倍碳纤维体积的沸水浴中处理处，取出处理后的短切碳纤维用蒸馏水冲洗干净，放入风箱烘干，取出备用。然后按照108/1的预处理的短切碳纤维投入量投入到含无菌水的2501111摇瓶中，然后放置于摇床中，控制摇床转速为18011)111，摇动411，控制碳纤维形成大小均一、高径比为1/0.6?0.6/1的酶固定化载体，即碳纤维球团，取出成球碳纤维放入风箱烘干。接着将彻/1成球碳纤维投入到1^6.0的缓冲液所配制的纤维素酶溶液中，室温下利用磁力搅拌器搅拌反应6匕于41:条件下静置过夜，之后用无水乙醇和纯净水洗去游离酶，即可得到固定化纤维素酶。
[0024](2)固定化酶活力的测定
固定化酶活力的测定:将0.18固定化酶加入至20此具塞试管中并加热至401，之后将5.01111的已预热的底物溶液(由0.625?羧甲基纤维素钠盐溶于1001111,0.211101，邱4 6的醋酸钠缓冲溶液配制而成)加入混合，准确反应5111111后加1.01111氢氧化钠溶液(2.011101/1)和2.0此指示剂溶液，反应终止并进行501！！沸水浴处理，冷却至室温。用蒸馏水定容至251111后在500鹽处测定吸光度。
葡萄糖含量的测定:配制0、0丨2,0.4,0.6,0.8,1.0^/1的葡萄糖标准溶液，分别将葡萄糖标准溶液和醋酸盐缓冲液(1^4.6)加入20此的具塞试管，然后加1.001氢氧化钠溶液(2.0001/1)和2.0此指示剂溶液，反应终止并进行5-=沸水浴处理，冷却至室温。用蒸馏水定容至25！！^后在500=0处测定吸光度并绘制标准曲线，测定样品的葡萄糖含量。
酶活力的计算:将所测得的游离酶及固定化酶的吸光度值带入葡萄糖的标准曲线回归方程中得到葡萄糖含量。
酶活力=(葡萄糖量#0)/5
固定化酶活力回收率=固定化酶总活力/溶液酶总活力
[0025](3)固定化酶的重复利用
将得到的固定化酶投入到催化反应中，并对催化反应中发生的酶活力进行测定，之后将固定化酶从反应液取出，用1^6.0的缓冲液冲洗后重新加入到新的反应液中，共检测酶活7次，在重复使用5次后，反应酶活仍保持在62%左右。
本实施例中测定成球碳纤维固定化载体的比表面积为13./^,固定于成球碳纤维载体上的酶的回收率为12.32%。
[0026]实施例2
[0027](1)成球碳纤维固定化脂肪酶
将0.50.11短切6&碳纤维按照与实施例1相同的方法预处理之后，按照108/1的预处理的短切碳纤维投入量投入到含水的250“摇瓶内，然后放置于摇床中，控制摇床转速为20011)111，摇动411，控制碳纤维形成大小均一、高径比为1/0.6?0.6/1的酶固定化载体，即碳纤维球团，处后取出成球碳纤维放入风箱烘干。接着将彻/1成球碳纤维投入到1)118.0的缓冲液所配制的脂肪酶磷脂液中，并于161:的条件下搅拌反应6匕41:条件下静置过夜，之后用无水乙醇和纯净水洗去游离酶，即可得到固定化脂肪酶。
[0028](2)固定化酶活力的测定
取208聚乙烯醇加入到8000[水中并加热至完全溶解，在75?851:恒温条件下保温1卜，冷却后定容至配制成2%体积分数的溶液。然后将22.橄榄油与75此聚乙烯醇溶液加入到250此摇瓶中混合，并迅速置入冰水中。在101:时立即用匀浆机高速搅拌250111，得到的反应底物(白色的混合液，48卜内稳定)。然后取401、邱7.0的磷酸缓冲溶液和5.01111底物放入同一 2501111摇瓶里，用磁力搅拌器搅拌2111111，于37。0条件下水浴加热10111111，最后加入0.2^固定化脂肪酶，搅拌并开始计时，待反应40111111后，加入20.01111、体积比为1: 1的丙酮-乙醇混合液并加入酚酞溶液5滴，用0.0511101/1氢氧化钠溶液滴定，将滴定值记为3。另一方面，再取401、邱7.0的磷酸缓冲溶液和5.01111底物放入同一 25001摇瓶里，用磁力搅拌器搅拌2111111，于37。0条件下水浴加热10111111，搅拌并开始计时，待反应40111111后，加入20.0111[、体积比为1: 1的丙酮-乙醇混合液及0.28脂肪酶并加入酚酞溶液5滴，用0.0511101/1氢氧化钠溶液滴定，作为对照滴定值记为13。
固定化酶活力=2.5=1=(21-13)/定量载体中料重
经检测本发明制备得固定化脂肪酶可重复使用4次，并保持71.2%的酶活。
本实施例中测定成球碳纤维固定化载体的比表面积为13.2^/8固定于成球碳纤维载体上的酶的回收率为13.47%。
【权利要求】
1.一种酶的固定化载体，其特征在于，所述固定化载体是直径长度为0.8?3cm成球碳纤维，其中，所述成球碳纤维的球团高径比为H/D = 0.6/1?1/0.6。
2.根据权利要求1所述的酶的固定化载体，其特征在于，所述成球碳纤维的球团高径比为 H/D = 1/0.8。
3.一种如权利要求1或2所述酶的固定化载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)预处理:将碳纤维切成长度为0.3cm?0.8cm短切碳纤维放入有机溶剂中浸泡3?5h，过滤或离心回收上清液，用相当于3?5倍碳纤维体积的水对短切碳纤维进行清洗，然后将清洗后的短切碳纤维浸泡于体积大于3倍碳纤维体积的沸水浴中处理3?5h后，用水清洗后，烘干，取出备用； (2)成球:将经步骤(I)中预处理的短切碳纤维，以投入量为2.0?20g/L投入含水溶液的容器中，然后放置于摇床中，控制摇床转速为120rpm?220rpm，摇动0.5?4h，即得酶的固定化载体。
4.根据权利要求3所述的酶的固定化载体的制备方法，其特征在于，步骤⑴中，将碳纤维切成长度为0.4?0.6cm短切碳纤维放入丙酮中浸泡4h，过滤或离心回收上清液，用相当于5倍碳纤维体积的蒸馏水对短切碳纤维进行清洗，然后将清洗后的短切碳纤维浸泡于体积6倍为碳纤维体积的沸水浴中处理4h后，用蒸馏水清洗后，烘干，取出备用。
5.根据权利要求3或4所述的酶的固定化载体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，将经步骤(I)中预处理的短切碳纤维，以等量方式每隔0.5?5.0分钟投入一次，共投放3?5次。
6.根据权利要求3或4所述的酶的固定化载体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述短切碳纤维投入量为2.5?15g/L ;在250mL摇瓶中，所述含水溶液的量相当于10?50倍短切碳纤维体积。
7.根据权利要求3?6之一所述的酶的固定化载体的制备方法，其特征在于，所述含水溶液选自自无菌水、无菌含水种子培养基、无菌含水含菌种培养液中的任一种；所述碳纤维选自2k碳纤维、3k碳纤维、6k碳纤维、24k碳纤维、补强布中的任一种。
8.根据权利要求7所述的酶的固定化载体的制备方法，其特征在于，所述含水溶液选自无菌水；所述碳纤维选自6k碳纤维。
9.根据权利要求1或2所述的酶的固定化载体在制备固定化酶中的应用，其特征在于，将所述固定化载体加入到相应缓冲液配制的相应酶溶液中，室温下搅拌反应，于2?6°C静置过夜，洗去游离酶，即得固定化酶。
【文档编号】C12N11/14GK104450667SQ201410652131
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月14日 优先权日:2014年11月14日
【发明者】王乐, 武大鹏, 惠明, 刘娜 申请人:河南工业大学