专利名称：人crybb1基因突变及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及人CRYBBl的基因突变和分析人CRYBBl基因的突变的方法，以及此突变在白内障中辅助诊断的用途。
背景技术：
晶状体蛋白首先在1893 年由M0rner发现[M0rner, C. Τ.，Untersuchungen der. Proteinsubstanzen in den lichtbrechenden Medien des Auges. Ζ. Physiol. Chem. 1893 ； 18:61-106]。它是脊椎动物晶状体最主要的结构蛋白，占晶状体蛋白质总量的90%。晶状体蛋白有特殊的空间结构，这对于维持晶状体的透明性有非常重要的作用。晶状体蛋白根据分子量由大到小，可分为α-，β-, γ-晶状体蛋白。β-晶状体蛋白(Beta crystallin, CRYB)可分为酸性蛋白(β A)及碱性蛋白 (β B)两个亚组，每个亚组分别由3个基因编码(CRYBA1，2，3 ;CRYBB1，2，3) [Jochen Graw. Genetics of crystal1 ins :Cataract and beyond. Exp. Eye Res. 2009 ;88 :173-189]。其中位于22qll的编码β Bl-晶状体蛋白的基因CRYBBl和位于22qll. 2的编码β Β2-晶状体蛋白的基因CRYBB2突变与先天性白内障的发生关系极其密切[Wang J.，Ma Χ.，Gu F.， Liu N. , Hao X. ,Wang K, Wang N and Zhu S. A missense mutation S228P in the CRYBBl gene causes autosomal dominant congenital cataract. Chin. Med. J. 2007 ； 120 (9) 820-824.，Yang J.，Zhu Y, Gu F, He X，Cao Ζ, Li X，Tong Y, Ma X. A novel nonsense mutation in CRYBBl associated with autosomal dominant congenital cataract Molecular Vision 2008;14:727-731]。单核苷酸突变可能会对基因所编码的蛋白质产生重要影响，晶状体蛋白编码基因的分子研究有助于发现潜在的患病者。到目前为止，还没有人CRYBBl基因Q227X突变导致遗传性白内障病的报道。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种检测CRYBBl基因突变的方法。本发明的第二个目的在于提供用于检测CRYBBl基因突变的试剂盒。本发明在一常染色体显性遗传的三代核性白内障家系中发现位于CRYBBl基因上第六外显子的一个新突变Q227X。该C — T突变导致第四Greek Key基序上的227密码子由谷氨酸变成终止密码子，这一突变使CYBBl蛋白被截短了沈个氨基酸，从而使其理化性质和功能发生改变。经研究发现，该突变与白内障形成显著相关。为此，本发明第一方面，提供一种检测人CRYBBl基因的突变的方法，其包括以下步骤(a)确定在样品中人CRYBBl基因编码的氨基酸序列的第227位氨基酸，或该基因第18458至18460位碱基；(b)检测该位置是否存在氨基酸Q — X的突变。
具体地，所述的突变是在SEQ ID NO :1第18458位核苷酸C — T的突变，使得其在此处形成终止密码。本发明的第二方面，提供一种分离的核酸，它具有SEQ ID NO. 1所示的序列，且第 18458位为T，或者包括第18458位核苷酸的SEQ ID No. 1所示序列的特异性片段。进而本发明提供一种分子标记，其为上述SEQ ID No. 1所述的核酸序列，或者所述的特异性片段，通过该分子标记，能够判断其是否存在白内障患病风险。在本发明的第三方面，提供用于扩增包括上述多态位点的特异性引物。例如，该引物其长度为15-50bp，且特异性地杂交并扩增出含人CRYBBl基因的SEQ ID NO. 1所示序列中第18458位核苷酸C — T突变。在本发明的第四方面，提供一种可与上述SEQ ID No. 1特异性杂交并检测所述多态位点寡核苷酸探针。例如，其长度为15-50bp，且特异性地杂交并检测含人CRYBBl基因的 SEQ ID NO 1所示序列中第18458位核苷酸C — T突变。在本发明的第五方面，提供了遗传性白内障分子诊断的试剂盒。该试剂盒包括用于人CRYBBl基因的第18458位核苷酸检测的试剂，或用于该基因转录的mRNA序列相应位点检测的试剂，或用于检测该基因表达产物相应位点检测的试剂。其可以是1)检测基因组的PCR试剂盒；或幻检测mRNA的荧光定量PCR试剂盒，或Northern检测试剂盒。例如可以包括上述的引物和/或本发明上述的寡核苷酸探针；或幻检测该突变蛋白的免疫试剂
品.ο本发明研究发现人CRYBBl基因的SEQ ID NO 1所示序列中第18458位核苷酸 C —T突变，导致了 β Bl晶状体蛋白氨基酸序列SEQ ID Ν0:2中Q227X的改变，形成了截短的βΒΙ晶状体蛋白，与遗传性白内障的发病相关。本发明可以用于白内障的辅助诊断， 用于发现白内障的潜在携带者，为该病的预防提供了依据。
图1显示的是家系先证者CRYBBl基因第六个外显子的测序结果(正向)，图中146 位碱基(相对于SEQ ID No. 1的第18458位碱基)为C/T杂合(箭头所示)；图2显示的是家系对照中CRYBBl基因第六个外显子的测序结果(正向)，图中151 位碱基(相对于SEQ ID No. 1的第18458位碱基)为C/C纯合(箭头所示)。具体实施的方式本发明人通过广泛而深入的研究，已经发现了人CRYBBl基因的突变(Q227X)在一个遗传性白内障家系中与疾病性状共分离，这种遗传性白内障发病年龄较早，且伴有眼球震颤，显示这个突变可能影响到基因的功能，使晶状体蛋白出现异常，导致了白内障的发生。人CRYBBl基因的基因组序列为SEQ ID NO. 1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。 人CRYBBl的基因组序列可以从GenBank中获得。本技术领域的人员均知道，有许多的分析技术可以用于检测人CRYBBl基因的突变。这些技术包括(但不局限于)DNA测序、杂交测序、酶促错配切割、异源双链分析、点杂交、寡核苷酸阵列(DNA芯片)Jini-sequencingJaqman技术、高温变性的熔解曲线(HRM)、 变性的高效液相色谱(DHPLC)和分子信标等。
另一方面，本发明的检测方法被用于评估个体对白内障的易感性。本发明的检测样品可以是从体液、组织甚至头发等样品中抽提的基因组DNA或 mRNA。用于本发明方法或检测试剂盒的引物和探针，根据CRYBBl基因的基因组序列 (SEQ ID NO. 1的序列)或cDNA序列进行设计，并用常规的合成技术进行合成即可。以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按常规进行， 或者按照试剂盒建议的条件完成。实施例1基因组的抽提和测序用常规的酚氯仿法从人的血液中提取基因组DNA，用于常规PCR扩增。引物序列为正向引物5-CTGGTCTGGCAGGGGTCTGGGTG-3反向引物5-TGAAGAAGGGTTGGGGCAAGGTA-3反应体系
上游引物(lOpmol/μΙ)l.OpL
下游引物(lOpmol/μΙ)1单dNTPs (2mmol/L)2.5μ!ν模板 DNA(3Ong/0)MgCl2(25mmol/l)IOxBuffer缓冲液2.5μ!νTaq 酶(lU/μΙ)2单双蒸水13单总体积25单扩增条件先进行95°C 5min预变性，后进入35个循环扩增(95°C 45秒，60°C 30秒，72°C 30 秒)，最后72°C IOmin延伸，扩增出300bp的产物，进行直接测序。实施例2突变的检测采取研究对象的外周血，并提取其基因组DNA。在遗传性白内障家系中进行全基因组的连锁分析，定位候选区域。采用测序技术获得CRYBBl基因SNP位点的碱基序列。结合测序结果(测序方法按实施例1进行)和生物信息学的分析，经过家系内的病例对照分析和大样本对照的SNP筛查，确定CRYBBl基因的突变和遗传性白内障连锁在一起。以下表格中的家系成员均知情同意参与本研究，所有入选成员均在武汉大学中南医院眼科接受眼部检查，确诊或排除遗传性白内障。
权利要求
1.一种检测人CRYBBl基因突变的方法，其包括步骤(a)确定在样品中人CSTM7基因编码的氨基酸序列的第227位氨基酸，或该基因第 18458至18460位碱基；(b)检测该位置是否存在氨基酸Q-^X的突变。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的突变是在SEQID NO: 1第18458位核苷酸C —T的突变。
3.一种分离的核酸，其特征在于，所述分离的核苷酸序列是SEQ ID N0:1所示的序列， 且第18458位的核苷酸为T，或包括第18458位核苷酸的SEQ ID No. 1所示序列的特异性片段。
4.一种分子标记，其为权利要求3所述分离的核酸。
5.一种用于辅助诊断白内障的试剂盒，其包括用于人CSTM7基因的第18458位核苷酸检测的试剂，或用于该基因转录的mRNA序列相应位点检测的试剂，或用于检测该基因表达产物相应位点的检测试剂。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为1)检测基因组的PCR试剂盒；或2)检测mRNA的荧光定量PCR试剂盒，或Northern检测试剂盒；或3)检测该突变蛋白的免疫试剂盒。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR试剂盒包括序列为SEQID NO. 3和4的引物对。
8.一种检测人基因突变的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID No. 3和4所示。
9.一种寡核苷酸探针，其特异性地与SEQ ID NO. 1杂交并检测其第18458位核苷酸。
全文摘要
本发明涉及人CRYBB1的基因突变及其与白内障的相关性。本发明提供了检测人CRYBB1基因突变的方法，并提供了相关的检测试剂盒。本发明方法是通过确定SEQ ID NO:1所示序列中第18458位核苷酸，检测其是否存在C→T突变。本发明研究发现人CRYBB1基因的SEQ ID NO:1所示序列中第18458位核苷酸存在C→T单核苷酸多态性，当发生C→T突变时，导致了βB1晶状体蛋白氨基酸序列SEQ ID NO:2中Q227X的改变，形成了截短的βB1晶状体蛋白，与遗传性白内障的发病相关。本发明可以用于白内障的辅助诊断，用于发现遗传性白内障的潜在携带者，为该病的预防提供依据。
文档编号C12N15/11GK102382889SQ201110354279
公开日2012年3月21日 申请日期2011年11月10日 优先权日2011年11月10日
发明者严明, 周新, 杨娜, 熊陈岭, 郑芳, 饶艳 申请人:武汉大学