专利名称：一种检测转基因植物成分的重组质粒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含酶或微生物的测定或检验方法，具体涉及包括叶绿体 RBCL(ribulose, 1. 5-bisphosphate carboxylose large subunit，核SMH 1，二 舞酸幾化酶大亚基)基因的重组质粒。
背景技术：
随着转基因生物(GMO)的迅速发展，其安全性在全球范围内引起激烈的争论与普遍关注。为保障消费者的知情权和选择权，世界上许多国家和地区都制定了相应的法律和法规，加强对进出口转基因植物及其产品的管理，这给为转基因生物安全监管提供技术支撑的转基因检测工作带来更大的挑战。基于核酸的转基因检测技术是转基因检测的重要方法。目前转基因产品的核酸检测方法主要有核酸分子杂交技术(southern blot)、PCR检测技术和基因芯片技术。无论是哪种核酸检测方法都必须以一种准确、可靠、稳定的标准物质作为阳性对照，以防止假阴性的出现。传统的标准物质是以转基因材料与其对应的非转基因材料按一定的质量比例配制而成，目前主要依靠从国外购买，不仅价格高，还很不方便， 严重影响日常转基因检测工作及检测技术研究的开展，因此亟需研制新型阳性对照材料。质粒标准分子是一种含有转基因检测目的外源基因和内标准基因的特异性片段的重组质粒分子。与传统的阳性标准物质相比，质粒标准分子具有以下几方面的优点(1) 可以通过微生物进行大量培养无限获得，提取简便，且纯度较高，用量少；( 可长期保存， 稳定性好，使检测结果的准确性得到很大的提高；C3)同一个标准分子可以同时包含多个外源目的基因，经济又高效，是GMO鉴定检测中是很好的标准阳性物质替代物。因此构建阳性标准分子已经成为国际上转基因检测领域的研究热点。目前国际上所构建的转基因成分标准质粒分子都是将1个品种或品系的内源参照基因和目的基因同时克隆到1个质粒中，在做不同物种、不同品系转基因成分检测时， 需要多个标准分子，比较繁琐。现有的转基因产品主要含转基因植物成分。云南植物研究 2002,24(3) :334-340发表了题为《植物转基因成分PCR检测内对照系统的建立》(作者 权洁霞等)一文，该文通过对23种植物的研究结果证实了植物叶绿体RBCL基因可作为内源参照基因用于转基因植物及其产品的检测。现有商业化的转基因产品中绝大多数都含有 CaMV35S启动子或/和NOS终止子，目前也有针对CaMV35S启动子和NOS终止子检测转基因植物及其产品的相关报导，但CaMV35S启动子和NOS终止子的检测主要用于已知产品配料和转基因背景的产品检测，对于未知产品配料和转基因背景的产品(尤其是加工产品)，则由于缺乏通用的标准品或质粒标准分子而无法进行准确的判断。因此制备一种通用的检测转基因成分的质粒标准分子具有非常重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测转基因植物成分的重组质粒，使用重组质粒可对转基因植物及其产品进行多靶点定性检测，具有方便快捷的优点。
本发明解决上述问题的技术方案是—种检测转基因植物成分的重组质粒，该质粒包括载体和基因片段，其特征在于， 所述的基因片段由叶绿体RBCL基因的特异性序列、CaMV35S启动子的特异性序列和NOS终止子的特异性序列融合构成，其中，所述的叶绿体RBCL基因的特异性序列如SEQ ID NO. 1所示；所述的CaMV35S启动子的特异性序列如SEQ ID NO. 2所示；所述的NOS终止子的特异性序列如SEQ ID NO. 3所示。本发明所述的重组质粒，其中所述的载体可以是常用的pMD-T系列载体，如， PMD18-T 或pMD19-T。本发明所述的重组质粒，其中所述的基因片段的融合方法为常用重组DNA分子的方法，如，酶切连接法和接头连接法。由于酶切连接法存在寻找酶切位点困难以及多个目的片段的连接需要进行多次的酶切、连接，不仅操作繁琐，而且连接效率较低，因此采用接头连接法较为理想。针对本发明所述的基因片段，本发明人所推荐的连接顺序依次是RBCL、 CaMV35S和N0S，其中，RBCL与CaMV!35S之间的接头的序列如SEQ ID NO. 4所示，CaMV!35S与 NOS之间的接头的序列如SEQ ID NO. 5所示。上述SEQ ID NO. 1至SEQ ID N0. 5所示序列的DNA片段可委托专业公司合成，也可从相关的植物产品中提取。为了节约资源，本发明人推荐以转基因大豆GTS40-3-2为原料，并设计出特定的引物即可制备出含SEQ ID NO. 1 SEQ ID N0. 3所示序列的重组基因片段，具体制备方法如下所述。本发明所述的重组质粒，其中所述的基因片段是以转基因大豆GTS40-3-2为原料并采用下述引物对扩增得到(I)扩增叶绿体RBCL基因的特异性序列的引物对上游引物5，-AATCTTCTACTGGTACATGGAC-3，(SEQID N0. 6)，下游引物5，-GCCACCGGATCCACCGCCACCTCATCATCTTTGGTAAAATCAAG-3，(SEQID N0. 7)；(II)扩增CaMV35S启动子特异性序列的引物对上游引物5，-GGTGGCGGTGGATCCGGTGGCGCTCCTACAAATGCCATCA-3，(SEQIDN0. 8)，下游引物5，-CAAGACCGGCAACAGGATTCGATAGTGGGATTGTGCGTCA-3'(SEQID N0. 9)；(III)扩增NOS终止子特异性序列的引物对上游引物5，-TGACGCACAATCCCACTATCGAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3，(SEQIDN0. 10)，下游引物5，-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3，(SEQID N0. 11)。得到所述的重组基因片段后经过割胶回收纯化后按公知的方法插入商用载体即可得到本发明所述重组质粒，该重组质粒可用于转基因植物成分的检测，本发明所推荐的具体应用方案如下一种快速检测转基因植物成分的多重PCR试剂盒，该试剂盒由引物、DNA聚合酶、 PCR反应液和阳性对照品组成，其特征在于，所述的阳性对照品为本发明所述的重组质粒；所述的引物分别为(A)扩增叶绿体RBCL基因特异性序列的引物对
上游引物5，-TGTGGACCGATGGGCTTAC-3，(SEQID NO. 12)，下游引物5，-TGAGGCGGACCTTGGAAAG-3，(SEQID NO. 13)；(B)扩增CaMV35S启动子特异性序列的引物对上游引物5，-GCTCCTACAAATGCCATCA-3，(SEQID NO. 14)，下游引物5，-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3，(SEQ ID NO. 15)；(C)扩增NOS终止子特异性序列的弓丨物对上游引物5，-ATCCTGTTGCCGGTCTTG-3，(SEQ ID NO. 16)，下游引物5，-GTATAATTGCGGGACTCTAATC-3，(SEQ ID N0. 17)。由于RBCL是植物共同的内参照基因，而其中的特异性序列(即SEQ ID NO. 1所示) 又是体现RBCL特异性的核心区域，且有80% 85%的商业化转基因植物使用了 CaMV35S 启动子，90%以上的转基因作物使用了 NOS终止子，因此本发明将外源基因RBCL、CaMV35S 和NOS插入商业载体所得到的重组质粒用于检测转基因植物成分具有以下有益效果1、目前市售的转基因农产品的种类和品系繁多，如果采用现有的转基因标准品进行鉴定，有关检测单位各种不同的转基因标准品就必须齐备，尤其是在对待检产品的转基因背景一无所知的情况下就无法进行。而采用本发明所述的重组质粒则可进行初步排查， 然后再针对少数问题产品进行准确的基因分析，其资源之省、工作量之小是可预见的；2、本发明所述的基因片段由RBCL、CaMV35S和NOS的特异性序列(即SEQ ID NO. 1 3)融合构成，因此检测的特异性更强。3、由于转基因大豆GTS40-3-2是一种标准品，且其内同时含有RBCL、CaMV35S和 NOS三种基因，因此本发明所述的基因片段不仅容易获得，而且方法简单。
图1为本发明所述基因片段的重组流程及原理示意图。图2为本发明所述重组质粒的一种具体实施的结构示意图。
具体实施例方式下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件操作，例如 Sambrook 等编著的分子克隆实验室手册(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。为了描述方便，下述实施例中，用代号RBCL-CaMV35S_N0S表示本发明所述的基因片段，用代号pMD-RBCL-CaMV35S-N0S表示采用商用载体PMD18-T所构建的重组质粒。例1 重组质粒 pMD-RBCL_CaMV;35S-NOS 的构建一、实验材料转基因大豆GTS40-3-2，购自欧洲IRMM公司。二、试剂PMD18-T载体、T4DNA连接酶及缓冲液、2Xpremix Taq DNA聚合酶及其缓冲液 DL2000 Marker购自宝生物工程(大连)有限公司；PCR产物回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自OMEGA生物技术有限公司；CTAB，Tris，EDTA等其他生化试剂购自广州学友生物技术有限公司；Dffia感受态菌株由本实验室保存；引物由上海英潍捷基生物工程技术服务有限公司合成。三、主要仪器设备C1000 型 PCR 仪(Bio-Rad Laboratories, Inc.)Gel 型凝胶成像系统(Bio-fcid Laboratories, Inc.)Biophotometer plus 紫夕卜分光光度计(Eppendorf, Inc.)其他仪器包括恒温水浴锅，离心机，恒温培养箱，电子天平，微量移液器等。四、实验方法和过程1、引物设计通过GenBank查询和检索相关国内外文献资料获得植物内参照基因RBCL， CaMV35S启动子和NOS终止子特异性序列。根据获得的序列信息，利用I^rimer Premier 5 软件，设计三对定性PCR引物，分别用于扩增RBCL基因、CaMV35S启动子特异性序列和NOS 终止子特异性序列。RBCL基因特异性序列扩增引物由RBCL-F和RBCL-R组成，RBCL-R带有含21个寡核苷酸的接头。CaMV35S启动子特异性序列引物由35S-F和组成，35S-F带有含 21个寡核苷酸的接头，且与RBCL-R引物的接头互补。NOS终止子特异性序列引物由NOS-F 和NOS-R组成。35S-R与NOS-F完全互补。2、特异性序列扩增2. 1 总 DNA 提取(1)称取Ig转基因大豆GTS40-3-2样品至50mL离心管中。(2)加入10mL65°C预热的CTAB提取缓冲液和RNase A酶，颠倒混勻后于65°C温育30min，期间颠倒混勻离心管2-3次，12000rpm离心机，离心lOmin，转移2_4mL上清液至 IOmL离心管中。(3)加入与上清等体积的三氯甲烷，颠倒混勻后，12000rpm离心机，离心lOmin，转移上清液至IOmL离心管中。(4)加入2 X体积的CTAB沉淀液，颠倒混勻后，室温静置Ih ； 12000rpm离心机，离心lOmin，弃上清。(5)向沉淀中加入400 μ L氯化钠溶液，使沉淀溶解，转移溶解液至 1. 5mLEppendorf 离心管。(6)在溶解液中加入等体积三氯甲烷，颠倒混勻，用12000rpm离心机，离心lOmin， 转移上层水相至1. 5mLEppendorf离心管。(7)加入0. 6倍体积4 V预冷的异丙醇，颠倒混勻后，4 °C下静置30min， 4°C 12000rpm离心机，离心lOmin，小心弃去上清液。(8)加入700 μ L4°C预冷的70%乙醇，倾斜离心管，轻转数圈后，4°C 12000rpm离心机，离心lOmin，小心弃去上清液。(9)重复一次，室温或核酸真空干燥系统中挥干液体。(10)加50 μ LTE缓冲溶液溶解，调整浓度至100ug/mL，_20°C保存备用。2. 2PCR 扩增PCR扩增的引物见表1。2. 2. 1 重组片段 RBCL-35S 的 PCR 扩增根据表1列出的引物，以转基因大豆GTS40-3-2阳性标准品基因组DNA为模板，进行特异性序列扩增，反应体系和程序见表2和表3。获得454bp的RBCL基因特异性序列 (RBCL基因43!3bp，接头为21bp)与CaMV35S基因特异性序列(CaMV35S基因l%bp，接头为 21bp)。表1引物设计表
权利要求
1.一种检测转基因植物成分的重组质粒，该质粒包括载体和基因片段，其特征在于，所述的基因片段由叶绿体RBCL基因的特异性序列、CaMV35S启动子特异性序列和NOS终止子的特异性序列融合构成，其中，所述的叶绿体RBCL基因的特异性序列如SEQ ID NO. 1所示； 所述的CaMV35S的特异性序列如SEQ ID NO. 2所示； 所述的NOS终止子的特异性序列如SEQ ID NO. 3所示。
2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述的基因片段是以转基因大豆 GTS40-3-2为原料并采用下述引物对扩增得到(I)扩增叶绿体基因RBCL的特异性序列的引物对 上游引物5’ -AATCTTCTACTGGTACATGGAC-3，，下游引物5’ -GCCACCGGATCCACCGCCACCTCATCATCTTTGGTAAAATCAAG-3，；(II)扩增35S启动子基因CaMV35S的特异性序列的引物对上游引物5，-GGTGGCGGTGGATCCGGTGGCGCTCCTACAAATGCCATCA-3，， 下游引物5，-CAAGACCGGCAACAGGATTCGATAGTGGGATTGTGCGTCA-3，；(III)扩增终止子基因NOS的特异性序列的引物对上游引物5’ -TGACGCACAATCCCACTATCGAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3，， 下游引物5’ -TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3。
3.一种快速检测转基因植物成分的多重PCR试剂盒，该试剂盒由引物、DNA聚合酶、PCR 反应液和阳性对照品组成，其特征在于，所述的阳性对照品为权利要求1所述的重组质粒； 所述的引物分别为(A)扩增叶绿体基因RBCL特异性序列的引物对 上游引物5’ -TGTGGACCGATGGGCTTAC-3，，下游引物5，-TGAGGCGGACCTTGGAAAG-3，；(B)扩增转基因植物成分CaMV35S启动子特异性序列的引物对 上游引物5，-GCTCCTACAAATGCCATCA-3，，下游引物5，-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3，；(C)扩增转基因植物成分NOS终止子特异性序列的引物对 上游引物5’ -ATCCTGTTGCCGGTCTTG-3，，下游引物5’ -GTATAATTGCGGGACTCTAATC-3，。
全文摘要
本发明涉及一种检测转基因植物成分的重组质粒，该质粒包括载体和基因片段，其特征在于，所述的基因片段由叶绿体RBCL基因的特异性序列、花椰菜花叶病毒35S(CaMV35S)启动子的特异性序列和根农杆菌(NOS)终止子的特异性序列融合构成，其中，所述的叶绿体RBCL基因特异性序列如SEQ ID NO.1所示；所述的CaMV35S启动子特异性序列如SEQ ID NO.2所示；所述的NOS终止子特异性序列如SEQ ID NO.3所示。本发明所述的重组质粒及其配套的多重PCR试剂盒可用于转基因植物及其产品的多靶点定性检测，具有方便快捷的优点。
文档编号C12N15/63GK102392040SQ201110355470
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月10日 优先权日2011年11月10日
发明者刘唐书, 周琳华, 肖维威, 马文丽 申请人:南方医科大学